Enkelcellsdisociation av Caenorhabditis elegans: En metod för att isolera levande celler

Overview

Denna video beskriver en metod för att skilja hela maskar till en encellig suspension lämplig för FACS eller immunprecipitation av intakta celler.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Tyskland et al, Isolering av specifika neuronpopulationer från Roundworm Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

1. Förberedelse och insamling av åldrade maskar för cellisolering

OBS: Nedan förklaras isoleringen av kolinerga nervceller från den transgena unc-17 ::GFP-stammen(OH13083) som erhållits från Caenorhabditis Genetics Center (CGC) stamförvar vid University of Minnesota. Det är absolut nödvändigt att upprätthålla sterila förhållanden för att förhindra förorening från svampar eller bakterier.

1. Förbered och synkronisera maskar via blekningsmetoden enligt T. Stiernagle. För åldrande experiment, tallrik maskar på nematod tillväxt medium (NGM) plattor som innehåller 25 μM vattenlösning av fluorodeoxyuridin (FuDR) för att minska äggproduktionen och arrestera ägg kläckning. Inspektera agarplattor regelbundet för att förhindra förorening eller äggkläckning eftersom detta kommer att orsaka otillförlitliga resultat.
   OBS: För unc-17::GFP-celler används vanligtvis tre 100 mm x 15 mm NGM-plattor för att isolera en tillräcklig mängd celler av intresse.
2. Samla maskar och förbered buffertar för cellisolering.
   1. Samla maskar i ett 15 ml koniskt rör. Tvätta maskar från plattan med 1,5 ml M9-buffert (1 mM MgSO_4,85 mM NaCl, 42 mM Na₂HPO4·7H₂O, 22 mM KH₂PO, pH 7,0) och centrifug i 5 min vid 1 600 x g. Kassera supernatant och tvätta maskar med 1 ml M9-buffert. Upprepa centrifugation och tvätta i totalt fem gånger för att avlägsna så mycket E. coli-förorening som möjligt.
      OBS: Att tillsätta antibiotika (50 μg/ml), såsom ampicillin, i detta steg kan bidra till att minska bakteriell kontaminering.
   2. För två prover, förbered 2 ml natriumdididylsulfat-dithiothreitol (SDS-DTT) lysbuffert: 200 mM DTT, 0,25% (w/v) SDS, 20 mM HEPES (pH 8,0) och 3% (w/v) sackaros.
   3. Förbered 15 ml isoleringsbuffert (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl_2,2 mM MgCl₂, 25 mM HEPES [pH 7.3]) och förvara den på is.
      OBS: Både SDS-DTT lysbufferten och isoleringsbufferten måste göras färska före varje experiment.
3. Nagelbandsstörning och isolering av en cell
   1. Centrifugdjur som samlats in i steg 1.2.1 i 5 min vid 1 600 x g. Ta bort alla supernatant och suspendera maskar i 1 ml M9-media och överför till 1,5 ml mikrocentrifugrör.
   2. Pelletsmaskar med centrifugering vid 1 600 x g i 5 min.
   3. Tillsätt 200 μL SDS-DTT lysbuffert till maskar och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur (RT). Maskar bör verka vara "blinkade" längs kroppen om de ses under ett ljusmikroskop.
      OBS: Långvarig exponering för SDS-DTT lysbuffert kan leda till att maskar avdödas, vilket kan övervakas genom att observera maskar. Maskar som är döda kommer att förlängas och kommer inte att krulla.
   4. Tillsätt 800 μL iskyl isoleringsbuffert och blanda genom att försiktigt snärta rör.
   5. Pelletsmaskar i 1 min vid 13 000 x g vid 4 °C, ta bort supernatant och tvätta med 1 ml isoleringsbuffert.
   6. Upprepa steg 1.3.5 totalt fem gånger och ta försiktigt bort isoleringsbufferten varje gång.
   7. Tillsätt 100 μL proteasblandning från Streptomyces griseus (15 mg/ml)(materialförteckning)upplöst i isoleringsbuffert till pelleten och inkubera i 10−15 min vid RT.
      OBS: Liksom med SDS-DTT lysbufferten kan den förlängda proteasrötningen resultera i överdriven klyvning av proteiner längs plasmamembranet, vilket förhindrar isolering av ytexponerad GFP via magnetiska pärlor.
   8. Under inkubation med proteasblandning, applicera mekaniska störningar genom att pipettera prover upp och ner mot botten av 1,5 mL mikrocentrifugrör med en 200 μL mikropipettspets i ~ 60−70 gånger. Håll pipettspetsen mot väggen i mikrocentrifugröret med konstant tryck för att korrekt avassociera celler.
   9. För att bestämma matsmältningsstadiet, ta bort en liten volym (~ 1−5 μL) av matsmältningsblandningen, släpp den på en glasrutschbana och inspektera den med hjälp av ett vävnadskulturmikroskop. Efter 5−7 min inkubation bör maskfragment ha synligt reducerad nagelband och en uppslamning av celler kommer att vara lätt synlig.
   10. Stoppa reaktionen med 900 μL kommersiellt tillgängliga kalla Leibovitz L-15 medium kompletteras med 10% fetala nötkreatur serum (FBS) och penicillin-streptomycin (slutlig koncentration vid 50 U/mL penicillin och 50 μg/mL streptomycin).
   11. Pelletsisolerade fragment och celler genom centrifugering i 5 min vid 10 000 x g vid 4 °C. Tvätta de pelleterade cellerna med 1 ml kallt L-15-kompletterat medium två gånger till för att säkerställa att överflödigt skräp och nagelband avlägsnas.
   12. Återanvända pelleterade celler i 1 ml L-15-kompletterade medier och lämna på is i 30 min. Ta det översta lagret, cirka 700−800 μL, till ett mikrocentrifugrör. Detta lager innehåller celler utan cellskräp och kommer att användas i efterföljande isolering av celler av intresse.
   13. Använd en automatiserad cellräknare eller hemocytometer för att mäta celltätheten på 10−25 μL isolerade celler enligt tillverkarens instruktioner.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar, Molecular Biology Grade	VWR	A0930
CaCl2	Sigma	C5670
Contess Automated Cell Counter	Invitrogen	Z359629
DTT	USBiological	D8070
FBS	Omega Scientific	FB-02
Fluorodeoxyuridine	Sigma	F0503
HEPES	Sigma	H3375
KCl	Amresco	O395
KH2PO4	USBiological	P5110
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	21083027
MgCl2	Sigma	M8266
MgSO4	USBiological	M2090
Na2HPO4·7H2O	USBiological	S5199
NaCl	VWR	X190
NaOCl (Bleach)	Clorox
Penicillin-Streptomicen	Fisher Scientific	15140122
Pronase E	Sigma	7433	protease mixture from Streptomyces griseus
SDS	Amresco	O227
SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope	Tritech Research
Sucrose	USBiological	S8010