Disección de la glándula del anillo larvario: Aislamiento de órganos endocrinos del desarrollo de Drosophila

Overview

Este video describe la glándula tórica Drosophila, una estructura endocrina compleja importante para la biosíntesis y secreción de ecdysteroides y otras hormonas. El protocolo destacado demuestra su disección, fijación e inmunodetención.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Imura et al., Protocolos para visualizar órganos esterogénicos y sus órganos interactivos con inmunodetención en la mosca de la fruta Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

NOTA: El esquema general de protocolos se muestra en la Figura 1.

1. La disección de la glándula del anillo larvario (RG)

NOTA: En D. melanogaster, que pertenece a ciclorrirápidos Diptera, el PG está dentro de un órgano endocrino compuesto llamado glándula tórica (RG, Figura 2D). Puesto que es inviable que el PG se separen quirúrgicamente de otros tipos de células (discutidos más adelante), un objetivo práctico es aislar un RG intacto y sin daños por disección.

1. Preparación de larvas en las etapas de desarrollo apropiadas
   NOTA: Para sincronizar las etapas de desarrollo de las larvas de D. melanogaster, es necesario recoger huevos dentro de un plazo estrecho y recoger larvas en los momentos apropiados.
   1. Recoger los huevos durante 2 h en un plato de agar de jugo de uva a 25 °C.
   2. Recoge larvas de 1^pt instar recién eclosionadas bajo un microscopio diseccionador con fórceps y transfiéralas a un pequeño vial que contenga puré de alimento estándar para moscas de levadura/harina de maíz.
      NOTA: La edad de las larvas está representada por "horas después de la puesta de huevos (hAEL)", "horas después de la escotilla (hAH)", o "horas después de la ecdisis L3 (hAL3E)".
   3. En el momento adecuado, recoger las larvas escenificadas con un bucle de plástico desechable para evitar lesiones indeseables. Para minimizar la diferencia en la progresión del desarrollo de las larvas de 3^rd instar, recoge las^2ªs larvas instar a 70 hAEL (48 hAH) y deja que se molt en intervalos de 2 h. A continuación, recoger las larvas de 3^rd instar dentro de 2 h después de la ecdisis L3; este procedimiento da larvas de 0-2 hAL3E.
   4. Transfiera las larvas escenificadas a un plato lleno de solución salina tamponada de fosfato (PBS).
   5. Enjuague las larvas con PBS para eliminar los alimentos residuales del cuerpo.
2. Disección gruesa de larvas bajo un microscopio diseccionador
   1. Sostenga el gancho de la boca de una larva con fórceps. Corta el cuerpo larvario en el tercio anterior de la longitud del cuerpo usando micro tijeras.
   2. Sostenga el extremo cortado del cuerpo larvario anterior con un par de fórceps. Usando el otro par de fórceps, empuje suavemente la punta de la cabeza hacia el interior del cuerpo; este procedimiento convierte el cuerpo larvario de adentro hacia afuera.
      NOTA: Este paso se puede omitir para la disección de 1^st larvas instar.
   3. Repita los pasos 1.2.1-1.2.2 con larvas adicionales durante 5-10 min.
      NOTA: El número de larvas debe ser igual o inferior a 20 para ahorrar tiempo para la disección.
3. Fijación y tinción de tejido con inmunohistoquímica
   1. Coloque el tercio anterior de los cuerpos larvarios (paso 1.2.2) en un microtubo de 1,5 ml lleno de 500 μL la solución fija (4% paraformaldehído en PBS). Fijar menos de 20 muestras a la vez, de lo contrario PBS conectado a las muestras fijas puede causar una dilución desfavorable del fijador. Para la disección de redondeo, quite una gota de PBS y, a continuación, agregue una solución de corrección.
      NOTA: Para la solución de arreglo, se puede utilizar 3,7% de formaldehído o 4% paraformaldehído.
   2. Incubar los tejidos diseccionados en la solución de fijación durante 30 min a temperatura ambiente (RT) o alternativamente durante 2 h a 4 °C.
   3. Reemplace la solución fix por 500 μL PBS y enjuague rápidamente las muestras 3 veces. Lave las muestras con 500 μL 0.3% PBT (PBS + 0.3% octilfenol eoxilato) durante 15 min en un balancín en RT. Para la disección del filete, retire los pasadores de insectos y transfiera las muestras a un microtubo de 1,5 ml.
      NOTA: Para aumentar la permeabilidad de los anticuerpos en los tejidos, las muestras se tratan con 500 μL 2.0% PBT para 1-2 h en un balancín en RT.
   4. Reemplace PBT por una solución de bloqueo de 500 μL (2% de albúmina sérica bovina en PBT). Incubar las muestras durante 1,5 h en un balancín en RT.
   5. Reemplace la solución de bloqueo por 50 μL la solución principal de anticuerpos, es decir, anticuerpos diluidos en la solución de bloqueo.
   6. Incubar las muestras durante la noche en un balancín a 4 °C.
   7. Reemplace la solución de anticuerpos primarios por 500 μL 0,3% PBT y enjuague rápidamente las muestras 5 veces. Lave las muestras 3 veces con 500 μL 0.3% PBT durante 15 minutos cada una en un balancín en RT.
   8. Reemplace 0.3% PBT por 50 μL la solución secundaria de anticuerpos (anticuerpos conjugados con tinte diluidos en la solución de bloqueo). Para la tinción nuclear, se añade 0,5 μL 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, solución de stock de 0,1 mg/ml) a la solución de 50 μL. Incubar las muestras en un balancín durante 2 h en RT o alternativamente a 4 °C durante la noche.
      NOTA: Mantén las muestras en la oscuridad.
   9. Reemplace la solución de anticuerpos por 500 μL 0.3% PBT y enjuague 5 veces. Lave las muestras 3 veces con 500 μL 0.3% PBT durante 15 minutos cada una en RT.
4. Disección fina del complejo cerebro-RG que contiene el PG y el montaje
   1. Utilice un pipete desechable para transferir las muestras inmunodeprimadas a un plato lleno de 0,3% PBT.
      NOTA: Para evitar burbujas inconvenientes durante la disección y el montaje, 0.3% PBT se puede reemplazar con PBS.
   2. Bajo un microscopio diseccionador, sostenga la cutícula o el gancho de la boca con un par de fórceps. Usando una aguja de 27 G unida a una jeringa de 1 ml como "cuchillo", corta la punta anterior del esófago y los discos oculares para eliminar el complejo de disco del ojo RG del cerebro de la cutícula corporal.
   3. Separe el esófago y el intestino del complejo de discos del ojo RG cerebral con fórceps. Dado que el esófago pasa a través del cerebro por encima del cordón nervioso ventral (VNC), tire del intestino hacia el lado posterior.
      NOTA: Para eliminar discos imaginales adicionales de las muestras, corta las conexiones entre el cerebro, los discos oculares y los discos de las piernas con un cuchillo de aguja.
   4. Repita los pasos 1.4.1-1.4.4 para otras muestras.
      NOTA: Para evitar que los desechos tisulares se peguen a las muestras, transfiera cada muestra completada a un plato limpio diferente lleno de PBT o PBS del 0,3%.
   5. Transfiera las muestras al centro de una diapositiva de vidrio limpio con un micropipette.
      NOTA: Para larvas de 2^nd o 3^rd instar, el extremo de una punta de micropipette debe truncarse con una cuchilla de afeitar.
   6. Bajo un microscopio diseccionador, alinee muestras individuales con su lado dorsal hacia arriba mediante el uso de fórceps.
      NOTA: El RG se encuentra en el lado dorsal del cerebro (Figura 2A). Esta alineación facilita la especificación de muestras individuales durante la toma de imágenes.
   7. Incline un tobogán de vidrio y limpie tanto exceso de PBT como sea posible. Coloque una gota de reactivo de montaje en un lado de la diapositiva. Coloque el borde de un resbalón de cubierta del otro lado de la caída y coloque el resbalón de la cubierta en las muestras lentamente con fórceps.
      NOTA: Este procedimiento evita que las muestras se muevan fuera de la tapa.
   8. Almacene las muestras a 4 °C. Mantén las muestras en la oscuridad.

Representative Results

Figura 1: El esquema general de protocolos. Dos métodos de disección distintos son aplicables a las larvas y hembras adultas, dependiendo del propósito de los experimentos. Los métodos de montaje también se idean de acuerdo con las condiciones de la muestra. Las técnicas de fijación, tinción e imágenes son básicamente comunes a todas las muestras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Visualización del PG y las neuronas que proyectan PG. (A y B) El complejo de glándulas anilladas cerebrales (RG) de la larva instar de tipo salvaje 3^rd. En (B), el PG se describe por líneas punteadas. La estructura filamentosa entre el cerebro y el RG es la tráquea. (C-E) El interior del PG se visualizó con mCD8::GFP impulsado por GMR45C06-GAL4 en la colección FlyLight. Las neuronas positivas PG y GFP fueron etiquetadas con anticuerpos anti-Sro (magenta) y anticuerpo anti-GFP (verde), respectivamente. La imagen fluorescente se fusiona con la imagen de luz transmitida para especificar el contorno de los tejidos. En (D), se ilustran el PG, la corpora allata (CA) y la corpora cardiaca (CC). Las neuronas que proyectan PG son más prominentes en la imagen de alta potencia con lente objetiva 40X (flechas en E) que la imagen de baja potencia con lente objetiva 10X (C). Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Egg collection
tissue culture dish (55 mm)	AS ONE	1-8549-02	for grape-juice agar plates
collection cup	HIKARI KAGAKU
yeast paste	Oriental dry yeast, Tokyo
100% grape juice	Welch Food Inc.
rearing larvae
small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS)	SARSTEDT	58.487
disposable loop	AS ONE	6-488-01
standard fly food			The recipe is on the website of Bloomington stock center.
Dissection
dissecting microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000-C
dissecting microscope	Leica	S8 AP0
tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated)	IWAKI	1000-035
Sylgard	TORAY		coarting silicon inside dishes
Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm)	TERUMO	NN-2719S	A "knife" to cut the tissue
forceps, Inox, #5	Dumont, Switzerland
insect pin (0.18 mm in diameter)	Shiga Brand		for fillet dissection
micro scissors	NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.	MB-50-10
Fixation
ultrapure water	Merck Millipore
phosphate buffered saline (PBS)
Formaldehyde	Nacalai tesque	16222-65
Paraformaldehyde	Nacalai tesque	02890-45
Triton-X100	Nacalai tesque	35501-15
microtubes (1.5 ml)	INA OPTIKA	CF-0150
Incubation
As one swist mixer TM-300 (rocker)	As one	TM-300	rocker
Bovine Serum Albumin	SIGMA	9048-46-8
Primary antibody
anti-Sro (guinea pig), 1:1000
anti-GFP (rabbit), 1:1000	Molecular Probes	A6455	Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100	Nakarai tesque	04363-66
anti-5HT (rabbit), 1:500	SIGMA	S5545
anti-Hts 1B1 (mouse)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1
anti-DE-cadherin (rat), 1:20	DSHB	DCAD2
anti-nc82 (mouse), 1:50	DSHB	nc82
Secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-11008
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-11001
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate	Life Technologies	A-11081
Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate	Life Technologies	A-21435
Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin	Life Technologies	A-22283
Mounting reagents
Micro slide glass	Matsunami Glass Ind.,Ltd.	SS7213
Square microscope cover glass	Matsunami Glass Ind.,Ltd.	C218181
FluorSave reagent (Mounting reagent)	Calbiochem	345789
Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper)	WATSON	5660-222-1S
Fly stocks
w; GMR45C06-GAL4			from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP			gifts from K. Ito, The University of Tokyo.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4			Li, H. H. (2014) and Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A. (2010)
w; UAS-mCD8::GFP			from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4			from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)