Summary
Blaastumoren zijn gevestigd in vrouwelijke muizen in een minimaal invasieve wijze via catheterisatie, lokale cauterisatie, en de daaropvolgende aanhechting van carcinoom cellen om de branden sites.
Abstract
In deze eenvoudige procedure, zijn blaastumoren gevestigd in vrouwelijke C57 muizen door het gebruik van de catheterisatie, lokale cauterisatie, en de daaropvolgende celadhesie. Na hun blazen zijn transurethrally gecatheteriseerd en afgevoerd, zijn dieren weer gecatheteriseerd het inbrengen van een platina draad in blazen toestaan zonder beschadiging van de plasbuis of blaas. De catheters zijn gemaakt van Teflon om te dienen als een isolator voor de draad, die elektrische stroom voert in de blaas om een brandwond creëren. Een elektrocauterisatie eenheid wordt gebruikt voor het afleveren 2,5 W aan het blootgestelde uiteinde van de draad, wegbranden extracellulaire lagen en het verstrekken van bevestiging sites voor carcinoom cellen die in suspensie geleverd aan de blaas door middel van een latere catheterisatie. Cellen blijven in de blaas gedurende 90 minuten, waarna de katheters zijn verwijderd en de blaas op natuurlijke wijze af te voeren. De ontwikkeling van de tumor wordt bewaakt via een echografie. Specifieke aandacht wordt besteed aan de catheterisatie techniek in de bijbehorende video.
Protocol
1. Dieren
- Vrouwelijke C57BL/6J muizen (Mus musculus) zijn geverifieerd vrij van besmettelijke ectoparasieten, worminfecties endoparasieten, en antilichamen tegen 17 muriene virussen door de verkoper voor de verzending. Muizen zijn ondergebracht in de AAALAC-geaccrediteerde dier faciliteit van Tulane University in overeenstemming met de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren. 1
- In het bijzonder, muizen zijn gehuisvest groep (4-5 muizen / kooi) in individueel geventileerde polycarbonaat cageswith microisolation filter toppen op hardhout beddengoed. Ze zijn ad libitum verstrekt gepelleteerd knaagdier voedsel en drinkwater.
- Muizen zijn toegestaan 7 dagen om te acclimatiseren voor de start van de studie.
2. Cellen
- De muizen overgangsperiode cell carcinoma cellijn MB49 wordt gebruikt om de blaastumoren te produceren.
- Cellen worden gekweekt in medium Dulbecco's gemodificeerd Eagle's aangevuld met 10% foetaal runderserum, 100 eenheden / ml penicilline en 100 eenheden / ml streptomycine.
- Culturen zijn gehandhaafd op 37 ° C en 5% CO 2 met media wisselt om de twee tot drie dagen.
3. Animal orthotope Tumor Model
De instillatie van de blaas tumor model hier beschreven is een aanpassing van de procedure beschreven door Gunther et al. 2.
- Anesthesie wordt geïnduceerd met 2% isofluraan (MWI / VetOne, Meridian, ID, Cat # 501017) in zuurstof en gehandhaafd op 0.75-1.25%. (Meerdere dieren kunnen gelijktijdig worden behandeld, dat zou een verhoging van de isofluraan levels vereisen.) Om het hoornvlies uitdrogen te voorkomen, zijn ogen gesmeerd met een kunsttranen oogzalf. Lichaamswarmte wordt onderhouden met een verwarmd kussentje onder een papieren gordijn.
- De vacht van de onderrug is geknipt om contact te bevorderen met de metalen geaarde plaat, en het geschoren gebied is bedekt met electroconduction gel.
- Elke muis is dan individueel geplaatst in dorsale recumbancy op een metalen geaarde plaat, en de blaas wordt gecatheteriseerd transurethrally met behulp van een gesmeerde 24-gauge, 3 / 4 inch, over-the-naald IV katheter met de stilet verwijderd.
- De blaas wordt afgevoerd van de urine, en een platina draad wordt ingebracht via de katheter in de blaas verlaten blootgesteld draad aan elk uiteinde van de katheter - ongeveer 2 mm op de lumenale uiteinde van de katheter. De draad is gemaakt van platina omdat de weerstand van het materiaal tegen oxidatie.
- Een 2,5 W stroom wordt vervolgens toegepast op de blaas ongeveer 0,5 seconden door het aanraken van de buitenkant deel van de draad met een elektrocauterisatie toestel in coagulatie.
- De draad wordt dan verplaatst naar een tweede locatie in de blaas en een andere 2,5 toegepast W te laden.
- De draad is verwijderd en 100 ul van MB49-cellen bij een concentratie van 1x10 6 cellen / ml wordt door de katheter bijgebracht in de blaas via een 1 ml spuit.
- De spuiten zijn overgelaten aan de katheters aan efflux van de celsuspensies te voorkomen, en de katheter muizen worden bijgehouden onder narcose voor 90 minuten om de cellen te hechten aan de branden sites.
- 100 tot 200 ul van steriele fysiologische zoutoplossing wordt toegediend door IP injectie om elke muis voorafgaand aan nuttige toepassing.
- Aan het einde van de incubatietijd van de katheters zijn verwijderd en de dieren mogen terug op het verwarmde pad totdat rechtzetten reflexen terug te keren, op welk punt de muizen worden teruggestuurd naar hun huis kooien.
4. Ultrageluid
- Tumoren kunnen groeien gedurende 3-5 dagen voordat de muizen ondergaan echografisch onderzoek van de urineblaas tot groei van de tumor te controleren.
- Voor de eerste echo-onderzoek, dieren worden verdoofd zoals hierboven beschreven. Muizen worden geplaatst in dorsale recumbancy en buikhuid wordt bereid door het knippen van de vacht.
- Een 24 meter IV katheter wordt transurethrally ingebracht in de urineblaas. Op dit punt, kan de blaas worden afgetapt en de urine verzameld voor verdere analyse.
- 100 ui van de steriele fysiologische zoutoplossing wordt bijgebracht in de blaas door de katheter de blaas beter zicht op echografie.
- Echografie geleiding gel wordt aangebracht op de buik, en echografie wordt uitgevoerd om de blaaswand en het lumen te beoordelen.
5. Representatieve resultaten:
Tumorweefsel zal beginnen 3-5 dagen verschijnen na de inoculatie. In onze ervaring, in een groep van 12 muizen, 50% of meer routinematig hebben een aantoonbaar weefselmassa in de blaas (0,5 tot 1,0 ul, met behulp van V = π / 6 · L · W · H) per dag vijf. Bij het gebruik van MB 49 cellen, zal tumoren blijven groeien en euthanasie nodig zal zijn door de dagen 24, indien de muizen niet behandeld. Euthanasie wordt aanbevolen als muizen worden lusteloos of cachectische, display gegolfde vacht, hunching, en niet-responsieve gedrag, of wanneer ze verliezen 20% van hun oorspronkelijke lichaamsgewicht. </ P>
De tumoren groeien snel en hebben necrotische centra na het bereiken van een massa van 200 mg of meer, 3 zogenaamd omdat de cellen in de zich ontwikkelende tumor vermenigvuldigen sneller dan wat kan worden onderhouden door de angiogene bloedtoevoer. Men kan ook indirect controleren progressie van de tumor via het niveau van de hematurea, die vermoedelijk is aan snelle angiogenese verbonden binnen het ontwikkelen van tumoren. Er werd consequent op gewezen dat de urine van onbehandelde tumor-dragende muizen bloed opgenomen door 14 dagen. De concentratie van de rode bloedcellen bleek na verloop van tijd toename van deze muizen, en de volumes van de urine verzameld verminderd. Tumoren van meer dan 50 mg kan ook worden gepalpeerd met relatief gemak, meestal met 14 dagen na inoculatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze minimaal invasieve methode voor de vaststelling orthotope blaas tumoren in vrouwelijke muizen kan ook worden toegepast voor celtypes andere dan de MB49, hoewel verschillende resultaten moeten worden verwacht. Als er minder agressieve tumorcellen worden gebruikt, zal het verhogen van de wattage licht (met behulp van 0,5 W stappen naar de nieuwe optimale stand) leveren een oppervlakte van meer vatbaar zijn voor tumorcellen gehechtheid, en langere blaas incubatietijden voor de bijgebracht cellen zullen een grotere hoeveelheid van de opbrengst celhechting bij de branden sites (ongepubliceerde gegevens). Hoewel sommige protocollen raden het leveren van 10 W via elektrocauterisatie, 2 dit bedrag van de macht moet worden beschouwd als een bovengrens, en misschien wel helemaal worden vermeden. Het verhogen van de concentratie van de geleverde cellen kunnen zich ook verhogen de kans op succes bij het andere celtypes worden gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de institutionele zorg en het gebruik Comite van Tulane University in te stellen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de National Science Foundation LOOPBAAN award (cbet-0846395) en de Vakgroep Vergelijkende Geneeskunde, Tulane University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57Bl/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | 3-5-wk-old |
| Polycarbonate cages and ventilated rack | Lab Products | Super Mouse 750 | 327mm x 190mm x 143mm |
| Hardwood Bedding | Harlan Laboratories | Laboratory –grade SaniChips | |
| Rodent diet | Harlan Laboratories | Rodent Diet 2019 | |
| IV Catheter | MWI Veterinary Supply | 009231 | 24 G x ¾ in. |
| Electrocautery unit | Bovie Medical Corporation | Aaron 900 | |
| Ultrasound unit | Sonosite | 180 Plus (Vet) | |
| MB49 cell line | Wake Forest University Baptist Medical Center | N.A. | |
| DMEM | Invitrogen | 21063-029 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio Products | 100106 500A57B | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-163 |
References
- Institute of Laboratory Animal Resources. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , National Academies Press. Washington, DC. (1996).
- Gunther, J. H., Jurczok, A., Wulf, T., Brandau, S., Deinert, I., Jocham, D. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
- Zhang, X., Atala, A., Godbey, W. T. Expression-targeted gene therapy for the treatment of transitional cell carcinoma. Cancer Gene Ther. 15, 543-552 (2008).
