Summary
Experimentele muismodellen van allergische astma bieden nieuwe mogelijkheden voor het bestuderen van de ziekte van pathogenese en het ontwikkelen van nieuwe therapeutica. Deze modellen zijn zeer geschikt voor het meten factoren die de allergische immuunrespons, ontsteking van de luchtwegen en longen pathofysiologie.
Abstract
Astma is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit, waardoor ongeveer 300 miljoen mensen over de hele wereld. 1 Meer dan 8% van de Amerikaanse bevolking heeft astma, met de prevalentie toe. 2 Net als bij andere ziekten, diermodellen van allergische luchtwegaandoeningen veel gemakkelijker begrip van de onderliggende pathofysiologie, helpen bij het identificeren potentiële therapeutische doelen, en laat preklinische testen van mogelijke nieuwe therapieën. Modellen van allergische luchtwegaandoeningen zijn ontwikkeld in verschillende diersoorten, maar muis-modellen zijn met name aantrekkelijk vanwege de lage kosten, gemakkelijke beschikbaarheid, en goed gekarakteriseerd immuunsysteem van deze dieren. 3 Beschikbaarheid van een verscheidenheid van transgene stammen verhoogt verder de aantrekkelijkheid van deze modellen. 4 Hier beschrijven we twee muismodellen van allergische luchtwegaandoeningen, zowel in dienst ovalbumine als antigeen. Na de eerste opname door intraperitoneale injectie, een model spreekt zichers het antigen uitdaging aan door verneveling, de andere door intratracheale levering. Deze twee modellen bieden aanvullende voordelen, met elkaar het nabootsen van de belangrijkste kenmerken van de menselijke astma. 5
De belangrijkste kenmerken van een acute astma zijn onder andere een overdreven luchtwegen reactie op prikkels, zoals methacholine (luchtweg hyperreactiviteit, LHR) en eosinofielen-rijke luchtwegontsteking. Dit zijn ook belangrijke effecten van allergeen uitdaging in onze muismodellen, 5,6 en beschrijven we technieken voor het meten van hen en dus de beoordeling van de effecten van de experimentele manipulatie. In het bijzonder, beschrijven we zowel invasieve 7 en 8 niet-invasieve technieken voor het meten van de luchtweg hyperreactiviteit en methoden voor de beoordeling van infiltratie van ontstekingscellen in de luchtwegen en de longen. Airway ontstekingscellen worden verzameld door bronchoalveolaire lavage, terwijl long histopathologie wordt gebruikt om de markers van ontsteking te beoordelen in het orgel. Dezetechnieken zorgen voor krachtige tools voor het bestuderen van astma op een manier die niet mogelijk zou zijn bij de mens.
Protocol
I. allergenen Sensibilisatie en Challenge (zie figuur 1)
A. Voor intratracheale Challenge
- Voor de eerste sensibilisatie, injecteren mannelijke of vrouwelijke C57BL / 6 of BALB / c muizen (6-8 weken oud) intraperitoneaal op dag 0 en weer op dag 7 met 20 ug ovalbumine (OVA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) geëmulgeerd in 0,2 ml steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) die 2 mg aluminiumhydroxide (Sigma-Aldrich) of met 2 mg aluminiumhydroxide in 0,2 ml steriele PBS als controle.
- Challenge met antigeen geval (bijvoorbeeld op dag 14, 16, 18 en 20). Challenge geschiedt.
- Verdoven muis met een intraperitoneale (ip) injectie van een mengsel van ketamine (90 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg). Zorg ervoor dat de muis is volledig onder narcose gebracht voor ten minste 10 minuten.
- Hoek werking oppervlak 45 graden of meer. Plaats de muis op dit oppervlak te houden ventrale zijde naar boven en het hoofd aan de bovenkant.
- Hook thread onder voor-snijtanden in te houden hoofd. Zet de poten met elkaar om ervoor te zorgen de luchtpijp recht is en het gebruik tape om de benen te houden. Opnemen chirurgische site met 70% EtOH en wattenstaafje.
- Topicaal aanbrengen bupivicaine (0,1 tot 0,2 ml 0,25% oplossing) bij de snede.
- Nip huid op de keel met een pincet en trek voorzichtig naar buiten. Maak een kleine verticale incisie met chirurgische schaar. Minimaliseer grootte van de incisie.
- Bereid een 1 ml spuit met 50 ul PBS of 0,1% OVA in PBS en plaats deze in een zich herhalend pipet (Tridak Stepper, Torrington, CT). Neem de pipet in de ene hand en gebruik de andere om het weefsel terug te houden met de pincet en bloot de luchtpijp.
- Houd de spuit als parallel aan de luchtpijp mogelijk te maken, steek de naald door de luchtpijp muur en injecteer de oplossing.
- Houd de muis in een verticale oriëntatie na injectie op tijd voor oplossing om zich te vestigen in de longen mogelijk te maken.
- Voorzichtig en steriel dicht wond metpincet en afdichting met hechtdraad.
- Plaats de muis borstbeen naar beneden op een verwarmingselement en laat zich te herstellen tot ze volledig ambulant. Na herstel, terug te keren met de muis om het dier zorginstelling en bewaken het dagelijks op tekenen van seroom, ontsteking of infectie, en wonddehiscentie totdat de wond geheel genezen is.
B. Voor de Challenge door Verneveling
- Sensibiliseren muizen op dag 0 door intraperitoneale injectie van 20 pg van OVA (Sigma-Aldrich) geëmulgeerd in 0,2 ml steriele PBS dat 2 mg aluminiumhydroxide (Sigma-Aldrich) of met 2 mg aluminiumhydroxide in 0,2 ml steriele PBS als controle .
- Op dag 14, te verhogen bij opname door ip injectie zoals hierboven beschreven.
- Op de 21 e, 22 e, 23 e, 24 e en 25 e dag na de eerste sensibilisatie, uitdaging muizen door blootstelling gedurende 30 minuten tot 1% vernevelde OVA of PBS alleen geleverd via een ultrasone vernevelaar (Buxco Research Systems, Wilmington, NC).
- Plaats muizen in de belangrijkste kamer van WBP; acclimatiseren ze binnen de plethysmografie kamer gedurende ten minste 10 minuten.
- Plaats 1 ml 0,1% OVA in steriele PBS of steriele PBS alleen, zoals in onderstaande stappen 4-6, via een verstuiver kop. Verstuiven gedurende 30 minuten.
- Verwijder de vernevelaar beker en gooi de resterende oplossing.
- Verneveling kan worden uitgevoerd op alle muizen gelijktijdig met een verneveling kamer.
II. Bepaling van de luchtwegen hyperreactiviteit voor methacholine
A. Niet-invasieve meting van luchtwegovergevoeligheid door hele lichaam plethysmografie (WBP; Buxco Research Systems, Wilmington, NC)
- Laat de poedervorm methacholine fles tot kamertemperatuur opwarmen alvorens te openen (methacholine is zeer hygroscopisch en zal deel nutteloos klonten indien toegestaan om water te absorberen). Bereid een 200 mg / ml stockoplossing in steriele PBS, maak dan serial 2-voudige verdunningen (bijvoorbeeld 100, 50, 25, 12,5 en 60,25 mg / ml). Een oplossing koud.
- Stel, als hieronder: sluit de belangrijkste ingang van WBP te vernevelaar, bias-flow inlaat aan de lucht-pomp, en de WBP afvoer van gas val met behulp van strakke rubber slang. Bevestig drukopnemer tot de verkooppunten van de hoofd-en referentie-kamers van de WBP te overbruggen. Sluit de druksensor aan voorversterker met de bijgeleverde kabels, en sluit voorversterker op de PC met behulp van specifieke data-acquisitie kaart.
- Kalibreer de voorversterker gebruik van de software volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
- Plaats muizen in de belangrijkste kamer van WBP; acclimatiseren ze binnen de plethysmografie kamer gedurende ten minste 10 minuten, dan is opname basislijn metingen (Penhbase) gedurende 3 minuten.
- Plaats 1 ml steriele PBS in de vernevelaar beker. Vernevelt gedurende 2 minuten en dan te controleren respiratoire variabelen voor een extra 6 minuten tijdens het drogen fase. Verwijder de vernevelaar beker en gooi de resterende PBS.
- Plaats 1 ml van 6,25 mg / ml methacholine in de vernevelaar beker en rEPEAT verneveling gedurende 2 minuten, plus een 6-minuten controle cyclus.
- Herhaal meting met 12,5, 25, 50 en 100 mg / ml methacholine met dezelfde 2 minuten verneveling periode 6 minuten controle cyclus.
- Verwijder de bladeren van de kamers en terug te geven aan hun kooien.
- Vul vernevelaar beker met 1 ml steriele PBS en de instellingen nogmaals volgorde om de slang te spoelen.
- Schakel de luchtstromen, demonteren, en maak hem schoon alle kamers voordat u een tweede set van dieren.
B. invasieve meting van de luchtwegen voor door Computer-gestuurde ventilator (flexiVent, SCIREQ Inc, Montreal, Canada)
- Weeg de muis en het verdoven door intraperitoneale (ip) injectie van 60 mg per kg lichaamsgewicht pentobarbital natrium.
- Na een doeltreffende verdoving, de positie van de muizen Ventro-dorsaal voor tracheostomie.
- Ontsmet de hals huid met 70% ethanol. Topicaal aanbrengen bupivicaine (0,1 tot 0,2 ml 0,25% oplossing) bij het incision site. Incisie en open de hals huid. Scheid de nekspieren en bloot de luchtpijp.
- Maak een 1 - tot 2-mm incisie in de luchtpijp met fijne schaar (zeker niet naar de luchtpijp te verbreken) en voorzichtig plaats de tracheale tube. Bind een hechting rond de luchtpijp naar een luchtlek te voorkomen.
- Leg de muis in het lichaam plethysmograaf kamer en sluit de geplaatste tracheale tube naar de ventilator.
- Start mechanische ventilatie. Stel de juiste ademhaling en getijden / slagvolume (150 slagen / min en 200 ui, respectievelijk voor een 20-g muis). Zorg ervoor dat de borstkas beweegt synchroon met de ventilator. Als de muis is "vechten" met de ventilator (zelf-ademhaling), meer injecteren verdoving en wacht op de synchronisatie.
- Naar aanleiding van nulmetingen, onderhouden muizen onder de uitgangswaarde ventilatie voor nog eens 3 min, en neem dan een 2 e set van impedantie metingen. Deze 2 e set van nulmetingen wordt gebruikt om calculate de gemiddelde uitgangswaarden.
- Lever PBS of methacholine (MCH) uitdagingen (6,25, 12,5, 25, 50 en 100 mg / ml) door channeling inspiratoire flow van de ventilator door middel van een ultrasone vernevelaar.
- Na elke uitdaging met MCh (6,25, 12,5, 25, 50 en 100 mg / ml), terug de zuiger aan het leveren van een VT van 10 ml / kg bij 120 ademhalingen / min en neem impedantie metingen.
III. Meting van cellulaire infiltratie in het luchtruim
A. Perform bronchoalveolaire lavage (BAL)
- Na meting van de Ahr, euthanaseren muizen met CO 2, en plaats elke muis op zijn rug op de chirurgische pad.
- Geniet van het gebied met 70% EtOH.
- Beginnend bij de onderbuik, opengesneden de buikholte en verwijder de huid / bovenste spieren, het verplaatsen naar boven in de richting van de ribben.
- Zodra de ribben zichtbaar zijn, u met een schaar voorzichtig doorboren het middenrif. De longen moeten uit de buurt samen te vouwen van het middenrif. Wees vooral careful niet naar nick de longen of het hart.
- Knip de ribbenkast volledig bloot de longen / hart (vermijd het zagen geen grote bloedvaten om bloed te houden van het vullen van de site).
- Met behulp van een 1 ml spuit met een 27 gauge naald (BD spuiten, Franklin Lakes, New Jersey), doorboren het hart ventrikels en langzaam en voorzichtig terug te trekken tegen de spuit om het bloed te verzamelen. Let er op dat instortende het hart.
- Verzamel de serum van dit bloed met een standaardprotocol. Bewaren bij -70 ° C tot gebruik.
- Snijd de huid en weefsel van de keel tot de luchtpijp wordt onthuld. Ruim voldoende weefsel om gemakkelijk te werken binnen het veld (weer, vermijd het snijden van alle belangrijke bloedvaten).
- Met behulp van gebogen schaar, knip in de luchtpijp om een pad te wissen.
- Steek de punt van een gebogen pincet onder de luchtpijp en grijpen het einde van een stuk van hechtdraad. Teken de hechtdraad in de luchtpijp.
- Bind een losse halve knoop over de luchtpijp, laag in de keel.
- Carefully snijden een inkeping, voldoende groot zijn om de canule, boven de hechtdraad.
- Breng de canule in het gat en de luchtpijp voorbij het punt van de hechtdraad. Voorzichtig naar voren drukt u op totdat de canule komt net bij de ingang van de longen (te ver: punctie longen; te kort: ineenstorting luchtpijp bij een poging om te herstellen BAL).
- Draai hechtdraad en volledige knoop om trachea af te dichten rond canule.
- Lock spuit (met 1 ml PBS) op de canule, en voorzichtig op de vloeistof in de long. Longkwabben moet individueel langzaam op te blazen. Doe niet te veel vulling. Voor een volwassen muis 0,9-1,0 ml is het absolute maximum. 0,8 ml kan veiliger. Losjes Lock spuit canule, anders is het waarschijnlijk om schade te veroorzaken bij een poging om los te maken.
- Zuig vloeistof uit longen. Als weerstand wordt ondervonden (weefsel gezogen canule), drukt u canule langzaam verder in de longen en ga verder met het verwijderen. Probeer ook het draaien van de canule op zijn plaats. Als alle else niet lukt, trekken de canule een deel weg, de luchtpijp is veel meer kans om samen te vouwen in dit geval.
- Maak spuit van de canule, stort BAL vloeistof in container, en herhaal 2 keer met verse PBS oplossing.
- Houd de BAL oplossing op ijs tot afgedraaid.
- Gebruik de BAL vloeistof en serum om de OVA specifieke IgE in de handel verkrijgbare muis IgE-ELISA-kits (MD Bioproducts, St. Paul, MN) te meten.
B. Tel Cellen en bepalen Differentiëlen
- Centrifugeer de BAS vloeistof 5 min bij ongeveer 600 x g, 4 ° C.
- Voorzichtig Resuspendeer de cel pellet in PBS en blijf op ijs.
- Plaats een standaard Neubauer hemacytometer met de verdunde celsuspensie en tel de cellen.
- Verwijder aliquots van 2 x 10 4 cellen bij 10 tot 40 ul volume cytospins. Verdun cellen indien nodig.
- Voor cytospins, mix 2 × 10 4 cellen, 130 ul PBS en 10 ui FBS. Voeg gehele cel mengsel Double Cytospin trechter en 10 min centrifugeren op 700 toeren per minuut, met behulp van dubbele cytoslides voor duplicaten van de monsters.
- Laat de dia te drogen bij kamertemperatuur gedurende 1 h voorafgaand aan kleuring.
- Vlekken op de dia's door gebruik te maken Diff-Quick vlek (Siemens, Newark, DE).
IV. Representatieve resultaten
Overmatige luchtwegvernauwing volgende provocatieve stimuli is een opvallend kenmerk van klinische astma. We beschrijven twee methoden voor het meten van dergelijke luchtweg hyperreactiviteit voor methacholine in OVA-gesensibiliseerde en uitgedaagd muizen: Whole-body plethysmografie (Figuur 2) en gedwongen oscillatie met behulp van de flexiVent systeem (figuur 3). Beide methoden aan te tonen dat OVA sensibilisatie en uitdaging luchtweg hyperreactiviteit bij muizen veroorzaakt.
Eosinofiel-rijke luchtwegontsteking is een ander opvallend kenmerk van zowel klinische als astma en allergische aandoeningen van de luchtwegen bij muizen. Zoals getoond in figuur 4
Er zijn aanwijzingen dat allergische luchtwegaandoeningen, het gevolg is van overproductie van IgE-antistoffen tegen sensibiliserende antigenen. Sensibilisatie en uitdaging OVA met de protocollen beschrijven we verhoogt IgE zowel serum BAS vloeistof behandelde muizen (figuur 5).
Figuur 1. Experimentele schema voor OVA geïnduceerde allergische astma. Muizen werden tweemaal gesensibiliseerd ip met 20 ug OVA geëmulgeerd in 2 mg aluminiumhydroxide in 0,2 ml steriele PBS of 2 mg aluminiumhydroxide in 0,2 ml steriele PBS alleen gevolgd de aangegeven tijdstippen door het uit te dagen met 0,1% OVA of steriel PBS oplossing of door de dagelijkse ex ling ondervinden gedurende 30 minuten verneveld 1% OVA in PBS of PBS alleen geleverd via een ultrasone vernevelaar (Buxco). Vierentwintig uur na de laatste OVA belichting werd luchtwegen voor bepaald. Vervolgens werden BAS vloeistof, bloedmonsters longcellen en weefsels verzameld voor verdere analyse.
Figuur 2. Beoordeling van de allergeen-geïnduceerde hyperreactiviteit luchtwegen door een niet-invasieve methode. Muizen (n = 4/group) waren gesensibiliseerd en uitgedaagd met OVA. Vierentwintig uur na de laatste uitdaging, werd luchtwegovergevoeligheid op geïnhaleerd methacholine bepaald met behulp van het hele lichaam plethysmografie zoals beschreven in het protocol. Penh is vastgesteld en uitgedrukt als Penh verhouding (gemiddelde Penh via 8 min tijdsinterval met methacholine gedeeld door het gemiddelde Penh via 8 min interval met PBS). *, P <0,05 versus PBS.
iles/ftp_upload/3771/3771fig3.jpg "/>
Figuur 3. Beoordeling van de allergeen-geïnduceerde hyperreactiviteit luchtwegen door een invasieve methode (gedwongen oscillatie). Muizen (n = 4/group) waren gesensibiliseerd en uitgedaagd met OVA. Vierentwintig uur na de laatste uitdaging, werd luchtwegovergevoeligheid de toenemende concentraties van geïnhaleerde methacholine bepaald door de gedwongen oscillatie (flexiVent)-methode, zoals beschreven in het protocol. A, B) weerstand van de luchtwegen; C) Lung elastantie. *, P <0,05 versus PBS.
Figuur 4. BAL vloeistof celgetal. Muizen (n = 4/group) waren gesensibiliseerd en uitgedaagd met OVA. Vierentwintig uur na de laatste uitdaging, (Top) BAL cellen werden verzameld en het totaal cellen geteld zoals beschreven in het protocol. (Onder) Cytospin dia's waren pgerepareerd en gekleurd met Diff-Quick. Tot = totaal cellen; Eos = eosinofielen; Neu = neutrofielen; Mac = macrofagen; Lym = lymfocyten. *, P <0,05 versus PBS.
Figuur 5. OVA-specifieke IgE. Muizen (n = 4/group) waren gesensibiliseerd en uitgedaagd met OVA. Vierentwintig uur na de laatste challenge werd gemeten IgE in BAS vloeistof en in serum van het bloed verzameld door hartpunctie zoals beschreven in het protocol. *, P <0,05 versus PBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Diermodellen van allergische luchtwegaandoeningen vindt u belangrijke hulpmiddelen voor het onderzoek relevant voor de klinische astma. Een aantal verschillende, gebruik verschillende soorten en antigenen, zijn ontwikkeld. De muis, een aantrekkelijke en veel gebruikte proefdieren, biedt ook een aantal voordelen voor de modellen van allergische luchtwegaandoeningen. 9,10 Hoewel dergelijke modellen hebben astma in alle opzichten, 11 niet na te bootsen met aspecten van chronische ziekten is bijzonder moeilijk te reproduceren, 12,13 bevestigen wij hier dat veel van de belangrijkste kenmerken zijn weergegeven. We tonen ook aan dat, zoals in de menselijke astma, deze functies worden geassocieerd met een verhoging van antigeen-specifieke IgE in zowel serum en BAL vloeistof. We presenteren twee muismodellen, zowel in dienst OVA als het antigeen, maar gebruik te maken van andere uitdaging technieken. Intratracheale toediening enigszins gecompliceerd en tijdrovend, doch biedt het voordeel biedt dat een bekende hoeveelheid antigeen rechtstreeks aan delongen. Het is ook mogelijk dat deze methode het antigeen levert dieper in de longen dan do alternatieven. We beschrijven een invasieve methode voor intratracheale levering, maar antigeen kan ook intratracheaal worden geleverd via een buis of canule ingebracht via de mondholte. Deze methode wordt elders beschreven in Jove. 14 Verneveling is eenvoudiger en directer bootst de gebruikelijke route blootstelling van de mens. Kwantificering is meer variabel, echter, en de levering aan de longen is misschien minder efficiënt. 15 Sterker nog, het waarschijnlijk is dat een aanzienlijke maar onbekend deel van de dosis wordt afgezet in de bovenste luchtwegen. Een derde alternatief, hier niet beschreven, is intranasale levering. Nogmaals, het is waarschijnlijk dat een aanzienlijke fractie van de dosis zal worden gedeponeerd in de bovenste luchtwegen.
Hoewel onze demonstratie wordt uitgevoerd met behulp van C57BL / 6 muizen zijn er aanwijzingen dat bepaalde andere stammen kunnen geven meer robuuste resultaten op specifieke eindpunten. In vergelijkingen van C57BL / 6 met BALB / c 16 of met beide BALB / c en FVB / NJ 17 muizen, de C57BL / 6 muizen toonden de kleinste stijging van de Ahr. Anderzijds, C57BL / 6 muizen grotere toename in eosinofilie in een studie 16 getoond, maar niet in de andere 17. Cytokine verhogingen zowel stam en cytokine-specifiek. De voorkeur stam kan daarom af van het eindpunt belangrijkste geacht.
Twee belangrijke kenmerken van allergische luchtwegaandoeningen worden gewoonlijk gekozen worden verricht om de effecten van experimentele manipulaties bepalen: AHR en mate van luchtwegontsteking. AHR kan worden gemeten door het gehele lichaam plethysmografie (WBP) of door gedwongen oscillatie. In beide gevallen wordt methacholine gebruikt als de provocerende uitdaging. WBP is een functionele in-vivo-meting die de analyse van reaktiviteit van de luchtwegen kan op bewust, vrij bewegende of minimaal ingetogen muizen zonder invasieve chirurgie en anesthesie. Airway reactie wordt uitgedrukt met behulp van de"Enhanced pauze" (Penh) als parameter van veranderde luchtweg functie. Penh is een empirische parameter die veranderingen in de doos stroom golfvorm van zowel inspiratie en expiratie weerspiegelt en combineert het met de vergelijking van vroege en late expiratoire box flow. WBP heeft verschillende potentiële voordelen vergeleken met invasieve middelen voor het meten long weerstand, omdat het technisch minder zwaar en kunnen metingen luchtwegen voor vernevelde genotmiddelen. Met deze methode kunnen zowel de effecten van psychologische stress en dierlijke voorbereidingstijd, waardoor het ideaal is voor herhaalde metingen (onderzoek van hetzelfde dier op verschillende tijdstippen) en meting over langere tijd (> 24 uur), tijdens welke een verscheidenheid van aërosolen kunnen toegediend worden in een gecontroleerde en herhaalbare manier. De resultaten sterk gecorreleerd met die van de invasieve, maar sneller en gemakkelijker.
Twee andere niet-invasieve methoden leveren metingen die worden gezegdom meer direct verband houden met luchtwegvernauwing. In dubbele kamer plethysmografie de muis wordt gedwongen de kop houden door een gat in de voorzijde van de thoracoabdominal kamer 18. Een nasale kamer wordt vervolgens aan de voorzijde van de thoracoabdominal kamer en een kop-gat wordt gesneden in de afdichting latexfilm tussen de kamers. Dit gat is precies passend voor een luchtdichte afdichting tussen de kamers te bieden zonder het beperken van de luchtwegen luchtstroom. Plethysmografische metingen worden dan in beide kamers en de vertraging tussen de neus en thoracoabdominal stromen worden gebruikt om de specifieke luchtwegweerstand (sRAW) berekenen. Hoofd-out plethysmografie is vergelijkbaar behalve dat de lucht vrij stroomt in de neus-kamer en geen plethysmografisch metingen worden er gemaakt. 19 De primaire berekende parameter is debiet bij midexpiratory fase (EF 50). Beide technieken zoals WBP geschikt zijn voor herhaalde metingen gedurende een aantal uren, waardoor evaluatie van both vroege en late reacties. Zowel de dieren moeten worden beveiligd, die onregelmatige resultaten wanneer de dieren gewend aan de inrichting in de loop van enkele dagen. Het kan ook moeilijk om een effectief luchtdichte afdichting, hetgeen essentieel is in beide gevallen verzekeren. Bovendien hebben omdat zowel Penh en sRAW blijkt sterk te correleren met invasieve metingen, en Penh en sRAW is aangetoond dat direct tot uiting in een cavia's, 20 kan de vraag of de verkregen aanvullende informatie de toegenomen experimentele moeilijkheidsgraad rechtvaardigt.
In het ge-methode, diep verdoofde muizen tracheotomized en mechanische ventilator is aangesloten op de buis. De druk-flow metingen als de ventilator blaast en ontlucht de longen dan de mogelijkheid de directe meting van de pulmonale weerstand en dynamische compliance. Deze geeft informatie over de luchtwegen monteurs die niet beschikbaar is met de WBP. VoorCED oscillatie technisch echter lastig en doorgaans een terminal procedure. Als experimentele eindpunten, zijn de twee procedures over het algemeen geven vergelijkbare resultaten. 19
De andere belangrijke eigenschap van klinische astma gebruikt om het effect van experimentele manipulaties in muizen allergische luchtwegaandoeningen beoordelen is eosinofiele ontsteking. Hoewel andere aspecten van ontsteking kan worden gemeten en is dit meestal betrekking bepalen van de mate van inflammatoire cellen (in het bijzonder eosinofiel) infiltratie in de luchtwegen, de long, of beide. Het aantal en type van de cellen in de luchtwegen wordt bepaald BAS vloeistof: Eerste totale aantal cellen bepaald door telling op een hemacytometer en celtype wordt bepaald via kleuring volgende cytospin. Hoewel BAL vochtophoping kan in principe uitgevoerd in levende muizen, zoals in de mens is het meestal geschikt uitgevoerd en na euthanasie. Eosinofielinfiltratie in de longen wordt beoordeeld door long-excisie gevolgd door standaard histopathologische technieken.
In sommige gevallen kan het ook nuttig zijn om de mate waarin antigeen overgevoeligheid en uitdaging stimuleert beker (slijm-producerende) celproliferatie te beoordelen. Dit wordt gemakkelijk bewerkstelligd door het kleuren van de longcoupes met periodieke zuur-Schiff, die specifiek is voor slijm. Antigeen-specifieke IgE kan ook worden gemeten in BAL-vloeistof en serum met behulp van direct beschikbare kits. IgE-meting van belang kunnen zijn in de instellingen waar de mate van sensibilisatie, in tegenstelling tot de eind-orgel reactie, is een cruciale parameter. Er zijn vele andere metingen, zoals cytokines en T-cel reacties die waardevol toevoegsels voor de studie van allergische luchtwegaandoeningen diermodellen Wij hebben hier beschreven. Het is de grote verscheidenheid aan relevante antwoorden dat antigeen overgevoeligheid en de uitdaging kan uitlokken, dat maakt dergelijke modellen waardevol in study van deze ziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften opgesteld door de Atlanta VAMC IACUC comite dat is ingesteld op grond van Protocol # V010-10.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH Grant HL093196 (RCR) en de Atlanta onderzoek en onderwijs Foundation (AREF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A5503 | |
| Aluminum hydroxide | Sigma-Aldrich | 239186 | |
| Acetyl-β-methylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A2251 | |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Whole body plethysmography (WBP) system | Buxco Research Systems | http://www.buxco.com | |
| FlexiVent | SCIREQ, Inc. | http://www.scireq.com | |
| Light microscope | Leica Microsystems | ||
| Cytospin 4 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Diff-Quick stain | Siemens AG | B4132-1A | |
| Repetitive pipette | Tridak | STP4001-0025 |
References
- Braman, S. S.
- Akinbami, L. J., Mooman, J. E., Liu, X. Asthma Prevalence, Health Care Use, and Mortality: 2005-2009. National Health Statistics Reports. 32, National Center for Health Statistics. Hyattsville, MD. 2005-2009 (2011).
- Bates, J. H., Rincon, M., Irvin, C. G.
- Drazen, J. M., Finn, P. W., De Sanctis, G. T. Mouse models of airway responsiveness: physiological basis of observed outcomes and analysis of selected examples using these outcome indicators. Annu. Rev. Physiol. 61, 593-625 (1999).
- Epstein, M. M. Do mouse models of allergic asthma mimic clinical disease. Int. Arch. Allergy Immunol. 133, 84-100 (2004).
- Blyth, D. I., Pedrick, M. S., Savage, T. J., Hessel, E. M., Fattah, D. Lung inflammation and epithelial changes in a murine model of atopic asthma. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 425-438 (1996).
- Martin, T. R., Gerard, N. P., Galli, S. J., Drazen, J. M. Pulmonary responses to bronchoconstrictor agonists in the mouse. J. Appl. Physiol. 64, 2318-2323 (1988).
- Hamelmann, E. Noninvasive measurement of airway responsiveness in allergic mice using barometric plethysmography. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156, 766-775 (1997).
- Gelfand, E. W. Pro: mice are a good model of human airway disease. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 166, 5-8 (2002).
- Shapiro, S. D. Animal models of asthma: Pro: Allergic avoidance of animal (model[s]) is not an option. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 174, 1171-1173 (2006).
- Zosky, G. R. Ovalbumin-sensitized mice are good models for airway hyperresponsiveness but not acute physiological responses to allergen inhalation. Clin. Exp. Allergy. 38, 829-838 (2008).
- Nials, A. T., Uddin, S. Mouse models of allergic asthma: acute and chronic allergen challenge. Dis. Model. Mech. 1, 213-220 (2008).
- Wenzel, S., Holgate, S. T. The mouse trap: It still yields few answers in asthma. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 174, 1173-1178 (2006).
- Rayamajhi, M. Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (51), e2702 (2011).
- Swedin, L. Comparison of aerosol and intranasal challenge in a mouse model of allergic airway inflammation and hyperresponsiveness. Int. Arch. Allergy Immunol. 153, 249-258 (2010).
- Gueders, M. M. Mouse models of asthma: a comparison between C57BL/6 and BALB/c strains regarding bronchial responsiveness, inflammation, and cytokine production. Inflamm. Res. 58, 845-854 (2009).
- Zhu, W., Gilmour, M. I. Comparison of allergic lung disease in three mouse strains after systemic or mucosal sensitization with ovalbumin antigen. Immunogenetics. 61, 199-207 (2009).
- Flandre, T. D., Leroy, P. L., Desmecht, D. J. Effect of somatic growth, strain, and sex on double-chamber plethysmographic respiratory function values in healthy mice. J. Appl. Physiol. 94, 1129-1136 (2003).
- Hoymann, H. G. Invasive and noninvasive lung function measurements in rodents. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 55, 16-26 (2007).
- Chong, B. T., Agrawal, D. K., Romero, F. A., Townley, R. G. Measurement of bronchoconstriction using whole-body plethysmograph: comparison of freely moving versus restrained guinea pigs. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 39, 163-168 (1998).
