Summary
Experimentella musmodeller av allergisk astma ger nya möjligheter för att studera sjukdomar patogenes och utveckla nya läkemedel. Dessa modeller är väl lämpade för mätning faktorer som styr allergiska immunsvar, luftvägsinflammation och pulmonell patofysiologi.
Abstract
Astma är en viktig orsak till sjuklighet och dödlighet och drabbar cirka 300 miljoner människor över hela världen. 1 Mer än 8% av den amerikanska befolkningen har astma, med förekomsten ökar. 2 som med andra sjukdomar, djurmodeller av allergisk luftvägssjukdom i hög grad underlätta förståelse för den underliggande patofysiologin, hjälpa till att identifiera potentiella terapeutiska mål och möjliggöra preklinisk testning av eventuella nya behandlingar. Modeller av allergisk luftvägssjukdom har utvecklats i flera djurarter, men musmodeller är särskilt attraktiva på grund av den låga kostnaden, lättillgänglighet, och väl karakteriserade immunförsvar hos dessa djur. 3 Tillgång till en mängd av transgena stammar ökar ytterligare attraktionskraft av dessa modeller. 4 Här beskriver vi två musmodeller av allergisk luftvägssjukdom, både använder ovalbumin som antigen. Efter inledande sensibilisering genom intraperitoneal injektion, en modell leveERS provokation med antigen genom nebulisering, den andra genom intratrakeal leverans. Dessa två modeller erbjuder kompletterande fördelar med varje imitera de viktigaste egenskaperna hos människans astma. 5
De viktigaste funktionerna i akut astma inkluderar en överdriven luftvägar respons på stimuli såsom metakolin (luftvägsöverkänslighet, AHR) och eosinofil-rik luftvägsinflammation. Dessa är också framträdande effekter av allergen utmaning i våra musmodeller, 5,6 och vi beskriver tekniker för att mäta dem och på så sätt utvärdera effekterna av experimentell manipulation. Specifikt beskriver vi både invasiva 7 och icke-invasiv 8 tekniker för mätning av luftvägshyperresponsivitet och metoder för bedömning av infiltrering av inflammatoriska celler till luftvägarna och lungan. Luftvägarna inflammatoriska celler uppsamlas genom bronkoalveolar tvätt medan lunga histopatologi används för att bedöma markörer för inflammation i hela organet. Dessateknikerna ger kraftfulla verktyg för att studera astma på ett sätt som inte skulle vara möjligt i människor.
Protocol
I. Allergen Sensibilisering och Challenge (se figur 1)
A. För Intratrakeal Challenge
- För inledande sensibilisering, injicera manlig eller kvinnlig C57BL / 6 eller Balb / c-möss (6-8 veckor gamla) intraperitonealt på dag 0 och återigen på dag 7 med 20 | ig av ovalbumin (OVA; Sigma-Aldrich, St Louis, MO) emulgerad i 0,2 ml steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande 2 mg aluminiumhydroxid (Sigma-Aldrich) eller med 2 mg aluminiumhydroxid i 0,2 ml steril PBS som kontroll.
- Utmaning med antigen som är lämpligt (exempelvis på dag 14, 16, 18 och 20). Challenge förfarande följer.
- Bedöva mus med en intraperitoneal (ip) injektion av en blandning av ketamin (90 mg / kg) och xylazin (10 mg / kg). Se till att musen är helt bedövad i minst 10 min.
- Vinkel drift ytan vid 45 grader eller mer. Placera musen på denna yta att hålla ventrala sidan uppåt och huvudet på toppen.
- Krok thread under främre framtänder att hålla huvudet bakåt. Nivå tassarna med varandra för att säkerställa att luftstrupen är rak och använda etiketten tejp för att hålla benen. Blötlägg operationsområdet med 70% EtOH och torka.
- Tillämpas bupivicaine (0,1 till 0,2 ml 0,25%-ig lösning) topiskt vid incisionsstället.
- Nip huden på halsen med pincett och dra försiktigt utåt. Gör ett litet vertikalt snitt med kirurgiska sax. Minimera storleken av snittet.
- Bered en 1 ml spruta med 50 pl PBS eller 0,1% OVA i PBS och sätt in den i ett repetitivt pipett (Tridak Stepper, Torrington, CT). Ta pipetten i en hand och använda den andra för att hålla vävnaden tillbaka med pincetten och exponera luftstrupen.
- Håll sprutan som parallellt med luftstrupen som möjligt, in nålen genom luftstrupen väggen och injicera lösningen.
- Upprätthålla mus i ett vertikalt läge efter injektionen för att ge tid för lösning att bosätta sig i lungorna.
- Försiktigt och sterilt nära sårområdet medpincett och tätning med sutur.
- Placera musen bröstbenet och ner på en värmedyna och låt den återhämta sig förrän helt rörlig. Efter återhämtning tillbaka musen till djuromsorg anläggningen och övervaka det dagligen för tecken på seroma, inflammation eller infektion, och försämrad sårläkning tills såret är helt läkt.
B. För Challenge genom nebulisering
- Sensibilisera möss på dag 0 genom intraperitoneal injektion av 20 pg OVA (Sigma-Aldrich) emulgerad i 0,2 ml steril PBS innehållande 2 mg aluminiumhydroxid (Sigma-Aldrich) eller med 2 mg aluminiumhydroxid i 0,2 ml steril PBS som kontroll .
- På dag 14, öka allergi vid ip-injektion som beskrivs ovan.
- Den 21, 22 a, 23: e, 24: e och 25: e dagen efter första sensibilisering, utmana möss med exponering under 30 min för att nebuliserad 1% OVA eller enbart PBS levereras via en ultraljudsnebulisator (Buxco Research Systems, Wilmington, NC).
- Placera möss i största kammaren WBP, acklimatisera dem inom pletysmografi kammare under minst 10 min.
- Häll 1 ml av 0,1% OVA i steril PBS eller steril PBS ensam, som beskrivs i steg 4-6 nedan, via en nebulisator kopp. Finfördela under 30 min.
- Ta nebulisatorn cup och kasta eventuell kvarvarande lösning.
- Nebulisering kan utföras på alla möss samtidigt genom användning av en nebulisationskammaren.
II. Fastställande av luftvägsöverkänslighet mot metakolin
A. icke-invasiv mätning av luftvägshyperresponsivitet med hela kroppen pletysmografi (WBP, Buxco Research Systems, Wilmington, NC)
- Låt pulveriserade metakolin flaskan värmas upp till rumstemperatur innan den öppnas (metakolin är mycket hygroskopisk och kommer att utgöra onödiga klumpar om de tillåts att absorbera vatten). Framställa en 200 mg / ml stamlösning i steril PBS, sedan göra seriella 2-faldiga utspädningar (t ex 100, 50, 25, 12,5 och 60,25 mg / ml). Håll lösningar kallt.
- Ställ in utrustning enligt följande: Anslut huvudsakliga inloppet WBP till nebulisatorn, bias-flöde inloppet till luft-pump och WBP utlopp till gasfälla med tättslutande gummislang. Fäst tryckgivare att överbrygga utloppen för de viktigaste och referens kamrar WBP. Anslut tryckgivare för att förförstärkaren med de medföljande kablarna och ansluta förförstärkare till dator med specifika data förvärvet kort.
- Kalibrera förförstärkare med hjälp av programmet enligt tillverkarens rekommendationer.
- Placera möss i största kammaren WBP, acklimatisera dem inom pletysmografi kammare under minst 10 minuter, sedan in baslinjeavläsningar (Penhbase) under 3 min.
- Häll 1 ml av steril PBS i nebulisatorn koppen. Finfördela i 2 minuter och sedan övervaka respiratoriska variabler för ytterligare 6 min under torkningsfasen. Ta nebulisatorn cup och kasta resterande PBS.
- Häll 1 ml av 6,25 mg / ml metakolin i nebulisatorn koppen och rEPEAT nebuliseringen i 2 minuter plus en 6-min övervakningsomgången.
- Upprepa mätningen med 12,5, 25, 50 och 100 mg / ml metakolin med samma 2-min nebulisering perioden och 6-min övervakningsomgången.
- Ta bort mössen från kamrarna och återföra dem till sina burar.
- Fyll nebulisator kopp med 1 ml steril PBS och köra en annan sekvens för att spola slangen.
- Stäng ner luftflöden, demontera, och torka rent alla kamrar innan du kör en andra uppsättning av djur.
B. invasiv mätning av luftvägarna lyhördhet genom Datorstyrd Fläkt (flexiVent, SCIREQ Inc., Montreal, Kanada)
- Väg musen och bedöva genom intraperitoneal (ip) injektion av 60 mg per kg kroppsvikt pentobarbitalnatrium.
- Efter adekvat anestesi, placera mössen ventro-dorsalt för trakeostomi.
- Desinficera halsen huden med 70% etanol. Tillämpas bupivicaine (0,1 till 0,2 ml 0,25%-ig lösning) topiskt vid den i:ncision plats. Incisionsfilm och öppna halsen huden. Separera nackmusklerna och exponera luftstrupen.
- Gör en 1 - till 2-mm snitt i luftstrupen med fina saxar (vara säker på att inte skära av luftstrupen) och sätt in trakealtuben försiktigt. Knyt en sutur runt luftstrupen för att förhindra en luftläckage.
- Låg musen i kroppspletysmograf kammaren och ansluta den insatta trakealröret till ventilatorn.
- Starta mekanisk ventilation. Ställ lämplig andningsfrekvens och tidal / slagvolymen (150 slag / min och 200 pl, respektive för en 20-g mus). Vara säker på att bröstkorgen rör sig synkront med fläkten. Om musen är "slåss" med ventilator (själv-respiration), injicera mer bedövning och vänta för synkroniseringen.
- Efter baslinjemätningar, underhålla möss under baslinje ventilation för ytterligare 3 min och sedan ta en 2: a uppsättning av impedansmätningar. Detta 2: a uppsättning av grundläggande mätningar används för att calculate de genomsnittliga utgångsvärden.
- Leverera PBS eller metakolin (MCH) utmaningar (6,25, 12,5, 25, 50 och 100 mg / ml) genom att kanalisera inandningsflödet från ventilatorn via en ultraljudnebulisator.
- Efter varje utmaning med MCh (6,25, 12,5, 25, 50 och 100 mg / ml), tillbaka kolven att leverera en Vt på 10 ml / kg vid 120 andetag per minut och ta impedansmätningar.
III. Mätning av cellulär infiltration in i luftrummet
A. Perform bronkoalveolar tvätt (BAL)
- Efter mätning av den AHR, euthanize möss med CO2, och positionera varje mus på rygg på det kirurgiska dynan.
- Blötlägg området med 70% EtOH.
- Med början vid den nedre delen av buken, klipp upp bukhålan och ta bort hud / övre muskler, rör sig uppåt mot revbenen.
- När revbenen är synliga, sax att noggrant punktera membranet. Lungorna skulle kollapsa bort från membranet. Var särskilt careful inte nick lungorna eller hjärtat.
- Skär bort bröstkorgen till fullo exponera lungorna / hjärtat (undvik att skära några större blodkärl för att hålla blodet från att fylla platsen).
- Med hjälp av en 1 ml spruta med en 27 gauge nål (BD sprutor, Franklin Lakes, New Jersey), punktera hjärtat ventriklar och långsamt och försiktigt dra tillbaka sprutan för att samla upp blodet. Undvik att kollapsa hjärtat.
- Samla upp serum från detta blod med användning av standardprotokoll. Lagra vid -70 ° C fram till användning.
- Skär bort hud och vävnad från halsen till luftstrupen avslöjas. Rensa bort tillräckligt vävnad att arbeta enkelt inom området (återigen, undvika att skära några större blodkärl).
- Med böjd sax, skurna i luftstrupen för att rensa en väg.
- Passera den punkt av en krökt tång under luftstrupen och ta tag i slutet av en bit sutur. Dra suturen tråden under luftstrupen.
- Knyt en lös halv-knot om luftstrupen, låg i halsen.
- Carefully skära en skåra, som är tillräcklig i storlek för kanylen, ovanför suturtråd.
- Försiktigt in kanylen i hålet och ner i luftstrupen förbi punkten i suturtråd. Tryck försiktigt framåt tills kanylen dyker precis vid ingången till lungorna (för långt: punktera lungorna, för korta: Dölj luftstrupe när man försöker att återhämta BAL).
- Dra suturtråd och fullständig knut att täta luftstrupen runt kanyl.
- Låset spruta (innehållande 1 ml PBS) på kanylen, och försiktigt tryck på fluiden in i lungan. Lungloberna bör individuellt blåsa långsamt. Inte över-fyllning. För en fullvuxen mus 0,9-1,0 ml är den absoluta maximum. 0,8 ml kan vara säkrare. Lås sprutan löst kanyl, annars är det sannolikt att orsaka skada när du försöker att koppla.
- Dra tillbaka vätska från lungorna. Om motstånd uppstår (vävnad sugs in kanylen), tryck på kanyl långsamt vidare in i lungan och återuppta bort. Försök också vrida kanylen på plats. Om alla ELSe misslyckas dra kanylen del av vägen, i luftstrupen är mycket mer sannolikt att kollapsa i detta fall.
- Ta bort sprutan från kanylen, deposition BAL vätska i behållare, och upprepa 2 gånger med färsk PBS-lösning.
- Hålla BAL-lösning på is tills centrifugerades ned.
- Använda BAL-vätskan och serum för att mäta OVA-specifikt IgE med användning av kommersiellt tillgängliga mus-IgE-ELISA-kit (MD Bioproducts, St Paul, MN).
B. Räkna celler och bestämmer Differentialer
- Centrifugera BAL-vätskan 5 min vid ~ 600 x g, 4 ° C.
- Resuspendera cellpelleten försiktigt i PBS och hålla på is.
- Ladda en standard Neubauer hemacytometer med den utspädda cellsuspensionen och räkna cellerna.
- Ta bort alikvoter av 2 × 10 4 celler i 10 till 40 pl volym för cytospins. Späd celler om så är nödvändigt.
- För cytospins, blanda 2 × 10 4 celler, 130 pl PBS och 10 pl FBS. Lägg hela cellen blandningen DOUBle cytospin tratt och centrifugera i 10 min vid 700 rpm, med användning av dubbla cytoslides för dubbelprov.
- Låt bilderna torka i rumstemperatur i 1 timme före färgning.
- Färga objektglasen genom användning av Diff-Quick-färg (Siemens, Newark, DE).
IV. Representativa resultat
Överdriven luftvägssammandragning efter provokativa stimuli är ett framträdande inslag i klinisk astma. Vi beskriver två metoder för att mäta sådana luftvägsöverkänslighet att metakolin med ägg-sensibiliserade och utmanade möss: Hela-kroppspletysmografi (Figur 2) och tvingade svängningar med flexiVent systemet (Figur 3). Båda metoderna visar att OVA sensibilisering och utmaning producerar luftvägsöverkänslighet hos möss.
Eosinofil-rik luftvägsinflammation är en annan framträdande egenskap hos både klinisk astma och allergisk luftvägssjukdom hos möss. Såsom visas i figur 4
Bevis tyder på att allergiska resultat luftvägssjukdom från överproduktion av IgE-antikroppar mot sensibiliserande antigener. Sensibilisering och utmaning med OVA via de protokoll vi beskriver ökar IgE-nivåer i både serum och BAL vätska behandlade möss (Figur 5).
Figur 1. Experimentella schemat för OVA-inducerad allergisk astma. Möss sensibiliserades två gånger intraperitonealt med 20 ^ g OVA emulgeras i 2 mg aluminiumhydroxid i 0,2 ml steril PBS eller 2 mg aluminiumhydroxid i 0,2 ml steril PBS enbart, följt vid angivna tidpunkter genom att utmana med 0,1% OVA eller steril PBS lösning eller av daglig ex exponeringen under 30 minuter till nebuliserades 1% OVA i PBS eller PBS ensamt levereras via en ultraljudnebulisator (Buxco). Tjugofyra timmar efter den sista exponeringen OVA var luftvägsresponsivitet bestämdes. Därefter sattes BAL-vätskan, blodprover, lungcancerceller och vävnader uppsamlas för ytterligare analys.
Figur 2. Bedömning av allergen-inducerad luftvägshyperresponsivitet genom en icke-invasiv metod. Möss (n = 4/group) sensibiliserades och utmanades med OVA. Tjugofyra timmar efter den sista utmaningen, var luftvägsöverkänslighet att inhalerad metakolin fastställas med hjälp av hela kroppen pletysmografi som beskrivs i protokollet. Penh bestämdes och uttrycktes som Penh förhållandet (medelvärde Penh över 8 min långt tidsintervall med metakolin dividerat med det genomsnittliga Penh över 8-minuters intervall med PBS). *, P <0,05 vs PBS.
iles/ftp_upload/3771/3771fig3.jpg "/>
Figur 3. Bedömning av allergen-inducerad luftvägshyperresponsivitet genom en invasiv metod (forcerade oscillationsmetoden). Möss (n = 4/group) sensibiliserades och utmanades med OVA. Tjugofyra timmar efter den sista utmaningen var luftvägshyperresponsivitet till ökande koncentrationer av inhalerad metakolin bestäms av den forcerade oscillationsmetoden (flexiVent)-metoden som beskrivits i protokollet. A, B) Luftvägsmotståndet; C) Lung elastans. *, P <0,05 vs PBS.
Figur 4. BAL-vätskan cellräkning. Möss (n = 4/group) sensibiliserades och utmanades med OVA. Tjugofyra timmar efter den sista utmaningen, (Top) BAL-celler uppsamlades och totala antalet celler räknades såsom beskrivits i protokollet. (Nederst) Cytospin bilder var prepared och färgades med Diff-Quick. Tot = totala celler; Eos = eosinofiler, Neu = neutrofiler; Mac = makrofager; Lym = lymfocyter. *, P <0,05 vs PBS.
Figur 5. OVA-specifikt IgE. Möss (n = 4/group) sensibiliserades och utmanades med OVA. Tjugofyra timmar efter den sista utmaningen var IgE mättes i BAL-vätska och i serum från blodet uppsamlades genom hjärtpunktion, såsom beskrivs i protokollet. *, P <0,05 vs PBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Djurmodeller av allergisk luftvägssjukdom utgör viktiga verktyg för studier som är relevanta för klinisk astma. Ett antal olika modeller, som utnyttjar olika arter och antigener, har utvecklats. Musen, en attraktiv och ofta används försöksdjur som erbjuder också ett antal fördelar för modeller av allergisk luftvägssjukdom. 9,10 Trots att sådana modeller inte efterlikna astma i alla avseenden, 11 med aspekter av kronisk sjukdom är särskilt svåra att reproducera, 12,13 vi bekräftar här att många av de viktigaste funktionerna återges. Vi visar också att, som i human astma, kan dessa omständigheter förknippade med ökad antigen-IgE i både serum och BAL vätska. Vi presenterar två musmodeller, både använder OVA som antigen men med användning av olika utmaning tekniker. Intratrakeal administrering är något komplex och tidskrävande, utan erbjuder den fördelen att leverera en känd kvantitet av antigenet direkt tilllungan. Det är också möjligt att denna metod ger antigenet djupare in i lungorna än vad alternativ. Vi beskriver en invasiv metod för intratrakeal leverans, men antigen kan också levereras intratrakealt via ett rör eller kanyl införd via den orala kaviteten. Denna metod beskrivs på annan plats i Jove. 14 Nebulisation är enklare och mer direkt efterliknar den vanliga vägen för människor. Kvantifiering är mer varierande, emellertid, och tillförsel till lungan kan vara mindre effektiva. 15 själva verket är det troligt att en betydande men okänd fraktion av dosen avsattes i de övre luftvägarna. Ett tredje alternativ, som inte beskrivs här, är intranasal avgivning. Återigen är det troligt att en betydande fraktion av dosen kommer att deponeras i de övre luftvägarna.
Även om vår demonstration utförs med hjälp av C57BL / 6 möss, tyder allt på att vissa andra stammar kan ge mer robusta resultat på specifika slutpunkter. I jämförelser av C57BL / 6 med BALB / c 16 eller med både BALB / c och FVB / NJ 17 möss, de C57BL / 6 möss visade den minsta ökningen av AHR. Å andra sidan visade C57BL / 6 möss större ökningar i eosinofili i en studie 16 men inte i andra. 17 Cytokin höjder var både stam-och cytokin-specifika. Den föredragna stammen kan därför bero på endpoint anses viktigast.
Två huvuddrag av allergisk luftvägssjukdom ofta väljs för bedömning för att fastställa effekterna av experimentella manipulationer: Ahr och omfattning av luftvägsinflammation. AHR kan mätas antingen genom hela kroppen pletysmografi (WBP) eller genom påtvingad svängning. I båda fallen metakolin används som provocerande utmaning. WBP är en funktionell in vivo mätningar som tillåter analys av luftvägarnas reaktivitet på medvetna, fritt flytta eller minimalt återhållna möss utan invasiv kirurgi och anestesi. Luftvägsresponsivitet uttrycks med hjälp av"Enhanced paus" (Penh) som en parameter av förändrad luftvägarna funktion. Penh är en empirisk parameter som återspeglar förändringar i rutan flödesvågformen från både inspiration och utandning och kombinerar det med en jämförelse mellan tidiga och sena exspiratoriskt box flöde. WBP har flera potentiella fördelar jämfört med invasiva metoder för mätning av lung motstånd, eftersom det är tekniskt mindre krävande och tillåter mätningar av luftvägarna lyhördhet för aerosoliserade stimulantia. Denna metod minimerar både effekterna av psykologisk stress och djur förberedelser tid, vilket gör den idealisk för upprepade mätningar (undersökning av samma djur vid olika tidpunkter) och mätning över långa tidsperioder (> 24 timmar), under vilken en rad olika aerosoler kan administreras i en kontrollerad och repeterbart sätt. Resultaten korrelerar starkt med de invasiva metoder, men det är snabbare och enklare.
Två alternativa icke-invasiv metoder ger mätningar som sägsvara mer direkt relaterade till luftvägssammandragning. I dubbel kammare pletysmografi musen tvingas att hålla sitt huvud genom ett hål i framsidan av thoracoabdominal kammaren. 18 A nasal kammaren sedan monteras på framsidan av thoracoabdominal kammaren och ett huvud hål skärs i tätande latexfilm mellan kamrarna. Detta hål är exakt dimensionerad för att ge en lufttät tätning mellan kamrarna utan att begränsa respirationsluftflödet. Pletysmografisk mätning tas sedan i båda kamrarna och fördröjningen mellan nasala och thoracoabdominal flöden används för att beräkna den specifika resistensen i luftvägarna (sRaw). Head-out pletysmografi är liknande förutom att luft strömmar fritt i nasala kammaren och inga pletysmografisk mätningar görs där. 19 Den primära beräknade parametern är Flöde vid midexpiratory fas (EF 50). Båda teknikerna, som WBP, är lämpliga för upprepade mätningar under ett antal timmar, vilket möjliggör bedömning av bOTH tidiga och sena svar. Men båda kräver att djuren är återhållsam, vilket kan ge felaktiga resultat om djuren är vana att apparaten under loppet av flera dagar. Det kan också vara svårt att säkerställa en effektiv lufttät tätning, vilket är viktigt i båda fallen. Dessutom har eftersom både Penh och sRaw visats korrelera starkt med invasiva mätningar och Penh och sRaw har visat sig korrelera direkt i marsvin, 20 det kan ifrågasättas om den ytterligare information som erhålls motiverar den ökade experimentella svårigheter.
I den forcerade oscillationsmetoden, är djupt sövda möss trakeotomiserades och en mekanisk ventilator är förbunden med röret. Tryck-flödesmätningar som fläkten blåser och tömmer lungan låt direkt mätning av pulmonell motstånd och dynamiska efterlevnad. Detta ger information om luftvägarna mekaniker som inte är tillgänglig med WBP. FörCED svängning är tekniskt svårare, dock, och är typiskt en terminal förfarande. Som experimentella effektmått, de två förfaranden ger i allmänhet liknande resultat. 19
Den andra framträdande särdrag hos klinisk astma som vanligen används för att bedöma effekten av experimentella manipulationer i murin allergisk luftvägssjukdom är eosinofil inflammation. Även om andra aspekter av inflammation kan mätas också, det mest handlar om bestämning av graden av inflammatoriska celler (särskilt eosinofila) infiltration i luftvägarna, lungorna, eller både och. Antalet och typen av celler i luftvägarna bestäms i BAL-vätska: Första totala antalet celler bestäms genom räkning i en hemacytometer och sedan celltyp bestäms genom differentiell färgning följande Cytospin. Även BAL Vätskeansamling i princip kan utföras i levande möss, som det är hos människor, det är mer vanligt och bekvämt utförda efter eutanasi. Eosinofilinfiltration i lungorna bedöms av lungan excision följt av vanliga histopatologiska tekniker.
I vissa fall kan det också vara lämpligt att bedöma i vilken utsträckning antigen sensibilisering och utmaning stimulerar bägaren (slem-producerande) cellproliferation. Detta uppnås enkelt genom att färga lungsektioner med perjodsyra-Schiff-, som är specifik för slem. Antigen-specifikt IgE kan också mätas i BAL-vätska och serum genom användning av lätt tillgängliga kit. IgE mätning kan vara viktigt i miljöer där graden av sensibilisering, till skillnad från de slutliga orgeln svar, är en avgörande parameter. Det finns ett stort antal andra mätningar, bland cytokiner och T-cellsvar, som är värdefulla hjälpmedel till studiet av allergisk luftvägssjukdom i djurmodeller som vi inte har beskrivits här. Det är olika relevanta svar som antigen sensibilisering och utmaning kan framkalla att göra sådana modeller värdefull i study av denna sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Experiment på djur utfördes i enlighet med de riktlinjer och regler som anges i Atlanta VAMC lACUC kommittén enligt protokollet # V010-10.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH Grant HL093196 (RCR) och Atlanta forskning och utbildning Foundation (AREF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A5503 | |
| Aluminum hydroxide | Sigma-Aldrich | 239186 | |
| Acetyl-β-methylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A2251 | |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Whole body plethysmography (WBP) system | Buxco Research Systems | http://www.buxco.com | |
| FlexiVent | SCIREQ, Inc. | http://www.scireq.com | |
| Light microscope | Leica Microsystems | ||
| Cytospin 4 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Diff-Quick stain | Siemens AG | B4132-1A | |
| Repetitive pipette | Tridak | STP4001-0025 |
References
- Braman, S. S.
- Akinbami, L. J., Mooman, J. E., Liu, X. Asthma Prevalence, Health Care Use, and Mortality: 2005-2009. National Health Statistics Reports. 32, National Center for Health Statistics. Hyattsville, MD. 2005-2009 (2011).
- Bates, J. H., Rincon, M., Irvin, C. G.
- Drazen, J. M., Finn, P. W., De Sanctis, G. T. Mouse models of airway responsiveness: physiological basis of observed outcomes and analysis of selected examples using these outcome indicators. Annu. Rev. Physiol. 61, 593-625 (1999).
- Epstein, M. M. Do mouse models of allergic asthma mimic clinical disease. Int. Arch. Allergy Immunol. 133, 84-100 (2004).
- Blyth, D. I., Pedrick, M. S., Savage, T. J., Hessel, E. M., Fattah, D. Lung inflammation and epithelial changes in a murine model of atopic asthma. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 425-438 (1996).
- Martin, T. R., Gerard, N. P., Galli, S. J., Drazen, J. M. Pulmonary responses to bronchoconstrictor agonists in the mouse. J. Appl. Physiol. 64, 2318-2323 (1988).
- Hamelmann, E. Noninvasive measurement of airway responsiveness in allergic mice using barometric plethysmography. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156, 766-775 (1997).
- Gelfand, E. W. Pro: mice are a good model of human airway disease. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 166, 5-8 (2002).
- Shapiro, S. D. Animal models of asthma: Pro: Allergic avoidance of animal (model[s]) is not an option. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 174, 1171-1173 (2006).
- Zosky, G. R. Ovalbumin-sensitized mice are good models for airway hyperresponsiveness but not acute physiological responses to allergen inhalation. Clin. Exp. Allergy. 38, 829-838 (2008).
- Nials, A. T., Uddin, S. Mouse models of allergic asthma: acute and chronic allergen challenge. Dis. Model. Mech. 1, 213-220 (2008).
- Wenzel, S., Holgate, S. T. The mouse trap: It still yields few answers in asthma. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 174, 1173-1178 (2006).
- Rayamajhi, M. Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (51), e2702 (2011).
- Swedin, L. Comparison of aerosol and intranasal challenge in a mouse model of allergic airway inflammation and hyperresponsiveness. Int. Arch. Allergy Immunol. 153, 249-258 (2010).
- Gueders, M. M. Mouse models of asthma: a comparison between C57BL/6 and BALB/c strains regarding bronchial responsiveness, inflammation, and cytokine production. Inflamm. Res. 58, 845-854 (2009).
- Zhu, W., Gilmour, M. I. Comparison of allergic lung disease in three mouse strains after systemic or mucosal sensitization with ovalbumin antigen. Immunogenetics. 61, 199-207 (2009).
- Flandre, T. D., Leroy, P. L., Desmecht, D. J. Effect of somatic growth, strain, and sex on double-chamber plethysmographic respiratory function values in healthy mice. J. Appl. Physiol. 94, 1129-1136 (2003).
- Hoymann, H. G. Invasive and noninvasive lung function measurements in rodents. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 55, 16-26 (2007).
- Chong, B. T., Agrawal, D. K., Romero, F. A., Townley, R. G. Measurement of bronchoconstriction using whole-body plethysmograph: comparison of freely moving versus restrained guinea pigs. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 39, 163-168 (1998).
