Summary
Een ELISA kan gemakkelijk worden omgezet Luminex xMAP assay en door de voordelen van multiplexing verschillende antilichamen tegelijkertijd worden gescreend voor een optimale antilichaam paar identificeren resulteert in een verhoogde gevoeligheid en dynamisch bereik, met minder kosten assay.
Abstract
Het enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) is al lange tijd het belangrijkste instrument voor de detectie van analyten in biologische monsters voor zowel de life science onderzoek en klinische diagnostiek. Echter, ELISA heeft beperkingen. Het wordt doorgaans uitgevoerd in een 96-wells microplate en de putjes bekleed met capture antilichaam, waarbij een relatief grote hoeveelheid monster naar een antigeen van interesse hebben. Het grote oppervlak van de putten en de hydrofobe binding van capture antilichaam kan ook leiden tot niet-specifieke binding en meer achtergrond. Bovendien meeste ELISA vertrouwen op enzym-bemiddelde amplificatie van het signaal om redelijke gevoeligheid. Een dergelijke versterking is niet altijd lineair en kan dus scheef resultaten.
In de afgelopen 15 jaar, heeft een nieuwe technologie bleek dat biedt de voordelen van de ELISA, maar maakt ook een hogere doorvoersnelheid, meer flexibiliteit, minder monstervolume, en lagere kosten, met een vergelijkbare workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is een microsfeer (kraal) array-platform maakt het voor zowel monoplex en multiplex assays die kunnen worden toegepast op zowel eiwit en nucleïnezuur toepassingen 3-5. De korrels hebben capture antilichaam covalent geïmmobiliseerd op een kleiner oppervlak, waardoor minder capture antilichaam en kleiner monstervolumes, vergeleken met ELISA en niet-specifieke binding aanzienlijk wordt verminderd. Kleinere steekproef volumes zijn belangrijk bij het werken met het beperken van monsters, zoals de cerebrospinale vloeistof, synoviale vloeistof, enz. 6. Multiplexen de assay reduceert monstervolume eisen, waardoor diverse resultaten van een enkel monster.
Recente verbeteringen door Luminex zijn onder andere: het nieuwe MAGPIX systeem, een kleinere, minder dure, gemakkelijker te gebruiken analyzer, een lage concentratie Magnetic MagPlex microsferen die de noodzaak voor dure filter platen weg te nemen en komen in een werkende concentratie beter geschikt voor assay ontwikkeling enlage-throughput toepassingen, en de xMAP antilichaam Coupling (ABC) Kit, die een protocol, reagentia en verbruiksartikelen noodzakelijk voor het koppelen van kralen om de vangst antilichaam van belang omvat. (Zie Materialen sectie voor een gedetailleerde lijst van kit inhoud.)
In dit experiment zetten we een vooraf geoptimaliseerde ELISA-test voor TNF-alfa cytokine de xMAP platform en vergelijk de prestaties van de twee methoden 7-11. TNF-alpha een biomarker gebruikt bij het bepalen van ontstekingsreacties bij patiënten met auto-immuunziekten.
We beginnen door het koppelen van vier kandidaat-capture antilichamen tegen vier verschillende microsfeer sets of regio's. Bij het door elkaar, deze vier sets zorgen voor de gelijktijdige testen van alle vier de kandidaten met vier afzonderlijke detectie antistoffen tegen de beste antilichaam paar, het opslaan van reagentia, monster en tijd te bepalen. Twee xMAP assays worden dan uitgevoerd met de twee meest optimale antilichamen paren en hun prestatiesten opzichte van de oorspronkelijke ELISA assay met betrekking tot sterkte, dynamisch bereik en gevoeligheid.
Protocol
I. Bereiding van het reagens
- Antilichaam Selectie en voorbereiding
- Stel de antilichamen te gebruiken in het experiment.
- Vier capture antilichamen: specifiek voor humaan TNF-alfa, ofwel monoklonaal of polyklonaal, alle dezelfde host soorten.
- Vier detectie antilichamen: specifiek voor humaan TNF-alfa, hetzij ongewijzigd, gebiotinyleerd of PE-geconjugeerd.
- Een bevestiging antilichaam: PE-geconjugeerd en specifiek voor de gastheer soorten van de capture antilichamen.
- Reconstitueer alle antilichamen tegen de door de fabrikant aanbevolen concentratie te werken.
- Selecteer vier injectieflacons met lage concentratie MagPlex microsfeer (kraal) sets of regio's, bijvoorbeeld, Luminex onderdeelnummers MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID, en MC10015-ID.
- Stel de antilichamen te gebruiken in het experiment.
- Koppeling Antilichamen tegen MagPlex Microspheres, het gebruik van de xMAP antilichaam (ABC) Koppeling Kit
Refer naar de ABC Kit User's Manual (Part # 89-00002-00-319) voor de complete koppeling procedure. (Opmerking: Lichtgevoelige microsferen dient te worden beschermd tegen licht waar mogelijk.)- Breng de reagentia in de ABC kit tot kamertemperatuur en label vier reactiebuizen met de kraal regionummers geselecteerd voor de koppelingsreactie. De inhoud van de vier flacons MagPlex kralen (1 ml elk of 2,5 x 10 6 korrels) de vier labels reactiebuizen.
- Tweemaal wassen elke kraal sets in 500 pL Activering Buffer, zoals beschreven in het ABC kit handboek.
- Activeer elke kraal set met 480 pi Activering buffer, 10 pi van Sulfo-NHS, en 10 pi van de EDC reagens volgens de procedure van het ABC kit handleiding, en incuberen gedurende 20 minuten. (Let op:. EDC reagens moet worden opgelost in 250 ul van de activering Buffer onmiddellijk voorafgaand aan deze stap)
- Herhaal de vorige wasstap met de nu "geactiveerd" microsferen een totaal van THRee keer met 500 pi Activering Buffer, zoals beschreven in het ABC kit handboek.
- Bereid vier afzonderlijke oplossingen, met elk 7,5 microgram (dat wil zeggen, 3 ug / miljoen microbolletjes) van capture antilichaam in Activering buffer.
- Voeg deze vier capture antilichaam oplossingen voor hun respectieve reageerbuisjes, vortex elke buis onmiddellijk, en incubeer gedurende twee uur op een rotator.
- Herhaal de vorige wasstap met de nu "gekoppeld" microsferen totaal drie maal met 500 pi van de wasbuffer die bij het ABC kit.
- Na de laatste wasstap, voeg 500 ul wasbuffer aan elke reageerbuis tot een uiteindelijke concentratie voorraad van 5 miljoen antilichaam-gekoppelde beads per milliliter te bieden. Vortex en ultrasone trillingen de reageerbuisjes om de microsferen dispergeren.
NB: Gedeeltelijk onder te dompelen de gesloten microsfeer flacon in een ultrasone reiniger gevuld met DI-water biedt een effectieve sonicatie voor alle wasstappen. (Zie Materialen tabel eapparatuur in details.) - Bewaar de gekoppelde kralen bij 2-8 ° C en beschermd tegen licht totdat het nodig is.
- Bepaling van het aantal Coupled Microspheres
- Tel het aantal microsferen hersteld na de koppelingsreactie behulp van een mobiele teller of hemacytometer. Raadpleeg de handleiding van het telapparaat de gebruikershandleiding van passende instructies om dat te doen. Het herstel van de koppelingsreactie is gewoonlijk meer dan 90%.
- Koppeling Bevestiging
- Controleer de koppelingsreactie met succes door het bereiden van testoplossingen van de gekoppelde kraal voorraden voor elke set met eindconcentratie van 100 kralen / ul in Assay (PBS met 1% BSA). Bereid verdunningen van de fycoerythrine-(PE-) gelabelde anti-species IgG bevestiging antilichaam bij 4 pg / ml in assaybuffer.
- Aliquot 50 ul van elke testvloeistof vier putjes van een ronde bodem 96-wells plaat, voor een totaal van 16 putjes. Voeg vervolgens 50 μL of Assay Buffer in acht van de putten, om de achtergrond, en 50 ul van de verdunde bevestiging antilichaam in de acht resterende putten te meten.
- Voorzichtig Meng de reacties van en neer te pipetteren meerdere malen met een multi-channel pipet. Bedek de plaat en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een plaat schudder.
- Plaats de plaat op een magnetische plaat afscheider voor 1-2 minuten om de kralen te trekken uit de oplossing. Verwijder vervolgens de vloeistof door krachtig omkeren van de plaat, terwijl op de separator, deze boven een afvalbak.
- Was de twee elk door toevoeging van 100 pi assaybuffer en verwijderen van het supernatant van de plaat op een soortgelijke wijze met de magnetische plaatseparator.
- Resuspenderen de korrels in 100 pl assaybuffer door zachtjes en neer te pipetteren vijfmaal met een multi-kanaal pipet.
- Analyseer op een Luminex xMAP instrument, zoals de MAGPIX instrument. De intensiteit van het fluorescentiesignaal van deze reactie is directly evenredig met de hoeveelheid eiwit op het oppervlak van de korrels, die een snelle evaluatie van de relatieve hoeveelheid eiwit gekoppeld met de parels.
- Koppeling Biotine niet gemodificeerd antilichamen voor detectie
- Bij gebruik van niet-gemodificeerde detectie antilichamen, biotinylate deze antistoffen met de Thermo Fisher EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotine Reagens (cat. nr. PI-21335) en de procedure beschreven in de bijsluiter. Na gebiotinyleerd kan de detectie-antilichamen later worden voorzien met streptavidine fycoerythrine (PE-SA) in de assay (stap III.6.) Zodat ze kunnen worden gedetecteerd met de xMAP analysator.
II. Assay Setup
- Een inleidend mengsel van vier sets kraal door 10 pi van elk 0,96 ml PBS met 1% BSA (assaybuffer. Zie Materialen tabel) te bepalen die het meest effectief het xMAP Assay.
- Bereid de detectie-antilichaam oplossingen door dilzowel bijdraagt elk 1 ug / ml in assaybuffer.
- Bereid de R & D Systems TNF-α eiwit standaard bij 2000 pg / mL in Assay Buffer.
- Verdun de streptavidine-rPhycoerythrin (SA-PE) (verstrekt bij 1 mg / ml) 8 ug / ml in assaybuffer.
III. Antistofscreening
- Voeg 50 ul van het antilichaam-gekoppelde microsfeer mengsel elk 16 putjes van een Costar ronde bodem 96-wells plaat voor de screening test.
- Voeg 50 ul assay buffer 8 van de 16 putjes, om de achtergrond te meten.
- Voeg 50 ul van R & D Systems TNF-α standaard (bij 2000 pg / ml) aan de andere 8 wells tot reactie te meten.
- Incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur beschermd tegen licht schudden op een testplaat schudder.
- Voeg 50 pi van elk van de vier detectie-antilichamen vier wells (twee achtergrond en twee respons) en geïncubeerd gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht schudden op een testplaat shaker.
- Voeg 50 pi van de SA-PE reagens alle wells en geïncubeerd 15 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht schudden op een testplaat schudder.
- Plaats de plaat op een magnetische plaat afscheider voor een minuut en verwijder vervolgens de vloeistof door met kracht het omkeren van de plaat.
- Voeg 100 ul Assay Buffer aan elk van de 16 putten, plaats de plaat op de magnetische plaat afscheider gedurende een minuut en daarna de vloeistof te verwijderen door krachtig omkeren van de plaat, terwijl op de afscheider.
- Voeg 100 ul van Assay Buffer aan elk van de 16 putten en lees de plaat met de Luminex MAGPIX instrument, verwijzend naar de handleiding voor een goede werking.
- Selecteer een antilichaam paar dat het gewenste signaal sterkte voldoet.
IV. xMAP functionele test
- Na het selecteren van de beste capture antilichaam, verdunnen 100 pi van dat antilichaam-gekoppelde kraal voorraad (van Stap IB8) tot 10 ml met Assay Buffer.
- Voeg 50 ul vanhet verdunde korrels 78 putjes van twee Costar ronde bodem 96-wells platen. (78 wells platen x 2 = 156 wells) Elke plaat wordt gebruikt om de prestatie van een ander detectie-antilichaam bepalen.
- Bereid een 12-punts standaardcurve, te beginnen bij 8000 pg / mL en eindigt op 4 pg / mL, met de R & D Systems TNF-α-standaard. Voeg zes 50 ul herhalingen van elke verdunning van elk van de platen en zes putjes met 50 ul assay buffer elk als achtergrond voor een totaal 78 putjes / plaat.
- Incubeer de platen gedurende een uur bij kamertemperatuur beschermd tegen licht schudden op een testplaat schudder.
- Voeg 50 ul van de eerste detectie-antilichaam alle 78 putjes van de eerste plaat. Herhaal dit voor de tweede detectieantilichaam op de tweede plaat.
- Incubeer de platen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur van licht schudden op een testplaat schudder.
- Voeg de 50 ul van de SA-PE reagens alle putjes van elke plaat.
- Broedende twee platen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur van licht schudden op een testplaat schudder.
- Plaats de borden op magnetische plaat separatoren voor een minuut, en verwijder de vloeistof door krachtig omkeren van de plaat, terwijl op de afscheider.
- Voeg 100 ul assay buffer aan elk van de 78 putjes op de platen, de platen magnetische plaat scheiders een minuut plaats, vervolgens de vloeistof door krachtig omkeren van de plaat.
- Voeg 100 ul assay buffer aan elk van de 78 putjes op de platen en geanalyseerd op de MAGPIX instrument onder verwijzing naar de handleiding voor een goede werking.
V. ELISA
- Na de instructies die bij de R & D Systems Human TNF-α/TNFSF1A DuoSet ELISA kit (R & D-onderdeel DY210), de respons gegenereerd door de standaard voorzien van het R & D-kit. Herhaal de ELISA-test drie keer, vervanging van de R & D Systems capture en detectie mieribodies de antilichamen van de andere leveranciers. Voor de eenvoud, een paar van de antilichamen door leverancier (bijvoorbeeld Millipore capture antilichaam met Millipore detectieantilichaam, Abcam capture antilichaam met Abcam detectieantilichaam, etc.).
- Onafhankelijk evalueren elk paar, zoals door de ELISA formaat, met elk van de drie TNF-α eiwit normen.
VI. Representatieve resultaten
Dit protocol toont hoe een typische ELISA kan worden omgezet in de xMAP platform ook van het multiplex vermogen van de techniek snel optimaliseren assay. De ELISA wordt gebruikt in dit voorbeeld was de menselijke Tumor Necrosis Factor-alpha (TNF-α) DuoSet ELISA kit van R & D Systems (R & D-onderdeel DY210).
Naast het antilichaam paar in de kit werden drie paren antilichaam uit verschillende bronnen (zie Materialen tabel) gelijktijdig geëvalueerd met de xMAP platform. Four van de antilichamen werden aangewezen als capture antilichamen en werden gekoppeld aan MagPlex lage concentratie microsferen. De andere vier antilichamen werden als detectie-antilichamen, waarvan drie verkoop biotine-gekoppelde vierde en werd gebiotinyleerd zoals beschreven in het.
De antilichamen voor deze studie werden gekozen op basis van beschikbaarheid en leverancier. Echter, in praktische instelling, moet antilichamen worden gekozen op basis van de individuele gebruiker de voorkeuren en de prestaties in het verleden ervaring met dat antilichaam. Hoewel dit experiment is de geschiktheid van een antilichaam niet getest als opname antilichaam tegen detectieantilichaam kan dit protocol eenvoudig worden aangepast voor dat doel.
De Luminex xMAP assays werden uitgevoerd zoals een multiplex vier capture antilichamen evalueren als mengsel door vier sets van TNF-α antilichaam gekoppeld MagPlex microsferen. De opname antilichamen werden geëvalueerd met elk van de viergebiotinyleerde detectie-antilichamen afzonderlijk, zodat de interactie van een detectie-antilichaam met elk van de vier capture antilichamen kunnen tegelijkertijd worden bepaald. Vier dergelijke tests uitgevoerd in parallel, de interacties van vier detectie-antilichamen bepaald vier capture antilichamen. Figuur 1 toont de vergelijkende gegevens van deze screeningstests.
De resultaten gaven aan dat het antilichaam paar van de R & D Systems DuoSet best uitgevoerd met als gevolg een respons bij 6183 mediane fluorescentie-intensiteit (MFI) eenheden. Er werd ook waargenomen dat de detectie-antilichamen van Millipore (86% van de R & D antilichaam paar reactie) en Abcam (67%) een redelijke gevoeligheid bij xMAP assay die in combinatie met R & D Systems capture antilichaam. De capture antilichamen van Abcam, Millipore en Novus produceerde een minder wenselijk antwoord in de xMAP test.
Het is belangrijk op te merken, dat de PURvormen van dit onderzoek is niet noodzakelijk te benadrukken verschillen tussen bepaalde antilichamen of verkopers, maar alleen om te illustreren dat er waarneembare verschillen in hun prestaties bij gebruik onder vergelijkbare omstandigheden, en dat de xMAP platform kan een efficiënt middel om de beoordeling van deze verschillen.
De R & D Systems DuoSet protocol gebruikt om de vier paren antilichaam vergelijken in een ELISA formaat. De R & D Systems protocol werd gebruikt met alle antilichaam paren, omdat het een afspiegeling is van typische ELISA-protocollen op grote schaal gebruikt vandaag de dag en het is analoog aan protocollen die worden gebruikt met xMAP technologie. De Elisa-tests toonden aan dat het antilichaam paar van R & D Systems opnieuw de beste resultaten (figuur 2) gaf. Het antilichaam paar van Abcam leverde geen reactie en het antilichaam paren van Millipore en Novus geproduceerd bescheiden reacties.
Om eventuele variatie in antilichaamreactiviteit beoordelen of aan de standaard, alle vier de Antibody paren werden getest met drie verschillende recombinant TNF-α eiwit normen, van drie verschillende leveranciers (zie de materialen tabel). De gegevens in fig. 2 blijkt dat de recombinante TNF-α eiwit normen van de drie leveranciers gelijkwaardige resultaten gaf.
De TNF-α eiwit van R & D Systems gebruikt standaardcurves de ELISA (Tabel 1) en de xMAP assays (tabellen 2 en 3) te genereren. Terwijl de ELISA-test werd gedaan met de R & D Systems antilichaam paar, de xMAP testen gebruik gemaakt van de R & D Systems capture antilichaam en ofwel de detectieantilichaam van R & D Systems of Millipore. De TNF-α eiwit van R & D Systems werd verdund tot een reeks concentraties 8000 tot 4 pg / ml te produceren. Alleen het antilichaam paar van R & D Systems de verwachte resultaten in de xMAP assay met een reactie> 20000 MFI, zoals weergegeven in Tabel 2 enFiguur 3. Wanneer de detectie-antilichaam van Millipore werd de xMAP Assay in plaats van R & D Systems detectie-antilichaam (tabel 3), de reactie (6000 MFI) was ongeveer 30% van de reactie verkregen met het detectie-antilichaam van R & D Systems, zoals in Figuur 3.
De gegevens in tabel 1 is de standaardcurve van de ELISA, dat een fabrikant aanbevolen TNF-α van 16 tot 1000 pg / ml. Dit bereik zeer beperkt omdat de OD 1000 pg / ml was iets groter dan 2 OD-eenheden en de spectrofotometer is kan meten dan 3 OD. Door de grens met de spectrofotometer, was het niet mogelijk om het bereik van de ELISA-test verder toenemen. Daarnaast is de gegevens in Tabel 1 geven aan dat de R & D Systems DuoSet ELISA niet voor het opsporen TNF-α bij concentraties minder dan 16 pg / ml. Anderzijds is de xMAP assay kan meeting TNF-α in een concentratie van minder dan 7,8 pg / ml met het vangen antilichaam R & D Systems, gecombineerd met het detectie-antilichaam van een R & D Systems of Millipore.
Het dynamisch bereik en gevoeligheid van beide methoden is beter geïllustreerd wanneer zijn uitgezet in een log-log schaal (figuur 4). Een duidelijk onderscheid tussen de helling van de ELISA reacties en de antwoorden van de xMAP assays te zien dat verder een beperkt vermogen voor de detectie van TNF-α met de ELISA, zowel hogere en lagere concentraties aangeeft.
De grenzen van detectie (LOD) voor de twee functionele TNF-α xMAP testen werden benaderd door het identificeren van de laagste TNF-α concentratie met een waargenomen respons niveau (MFI) van meer dan achtergrond, plus drie maal de standaarddeviatie (SD). Om statistische significantie, zesvoud werden gebruikt om de SD bepalen zowel xMAP en ELISA-methoden. These schattingen van LOD zijn optimistisch en bedoeld om een "best-case" scenario, om te voorzien met dien verstande dat onder normale omstandigheden slechts twee of drie duplo's zal worden gebruikt. In Tabel 2 kan worden opgemerkt dat bij gebruik van de R & D Systems paar de laagste TNF-α concentratie 3,91 pg / ml een reactie van 66 MFI, die groter is dan de reactie van de achtergrond + 3SD geproduceerd voldoen aan dit criterium . Wanneer de Millipore detectie antilichaam werd gebruikt met de R & D Systems Capture antilichaam (tabel 3), de detectiegrens was minder dan 7,81 pg / ml. In dit geval, de 2e laagste concentratie TNF-α geproduceerd aanvaardbare reactie 17 MFI, groter dan de reactie van de laagste concentratie TNF-α en drie maal de standaardafwijking. (10 MFI + 3 (2,4) = 16,29 MFI) Evenzo werd de grens van detectie voor de R & D Systems DuoSet ELISA geschat op tussen 63 pg / ml en 31 pg / ml (tabel 1).
Figuur 1. De gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van de R & D Systems standaard (@ 2.000 pg / ml) voor elke mogelijke combinatie van de vier capture antilichamen (gekoppeld aan vier verschillende microsfeer regio's) en de vier detectie-antilichamen. Klik hier voor vergroting figuur .
Figuur 2. De optische dichtheid (OD) drie verschillende recombinante standaarden (@ 1000 pg / mL) gedurende vier vangen en detectieantilichaam paar combinaties. Vastleggen en detectie antilichamen werden willekeurig gekoppeld door de leverancier, voor eenvoud. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
| pg / mL | OD | Std Dev | +3 SD |
| 1000 | 2,084 | 0,035 | 2,187 |
| 500 | 1,328 | 0,038 | 1,441 |
| 250 | 0,787 | 0,025 | 0,863 |
| 125 | 0,476 | 0,026 | 0,554 |
| 63 | 0,304 | 0,023 | 0,374 |
| 31,3 | 0,212 | 0,025 | 0,287 |
| 15,6 | 0,167 | 0,244 | |
| 0 | 0,118 | 0,021 | 0,182 |
Tabel 1 De optische dichtheid (OD) van de 2-voudige verdunningsreeks die door de R & D Systems DuoSet bijsluiter, voor gebruik als een standaard curve;. Waaronder standaard deviatie (SD) en de geschatte aantoonbaarheidsgrens (LOD), tussen 31,3 pg / ml en 63 pg / ml.
| R & D Systems Capture and Detection Antilichamen | |||
| pg / mL | MFI | Std Dev | +3 SD |
| 8000 | 20.320 | 463 21.707 | |
| 4000 | 15.594 | 223 | 16.263 |
| 2000 | 11.098 | 79 | 11.336 |
| 1000 | 6985 | 160 | 7465 |
| 500 | 4149 | 80 | 4390 |
| 250 | 2233 | 30,0 | 2323 |
| 125 | 1199 | 43,8 | 1330 |
| 63 | 636 | 14,0 | 678 |
| 31,3 | 340 | 12,9 | 379 |
| 183 | 5,9 | 201 | |
| 7,8 | 103 | 2,2 | 109 |
| 3,9 | 66 | 2,4 | 73 |
| 0 | 11 | 0,8 | 13,8 |
Tabel 2 De gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van een standaard verdunningsreeks gemeten door xMAP technologie, waarbij het antilichaam paar die bij de R & D Systems DuoSet;. Waaronder standaard deviatie (SD) en de verwachte detectielimiet (LOD), minder dan 3,91 pg / ml.
| R & D Systems Capture Ab met Millipore Detection Ab | |||
| pg / mL | MFI | | +3 SD | |
| 8000 | 5800 | 143 | 6229 |
| 4000 | 3881 | 120 | 4242 |
| 2000 | 2176 | 73 | 2396 |
| 1000 | 1138 | 32,1 | 1234 |
| 500 | 578 | 31,3 | 671 |
| 250 | 289 | 6,2 | 307 |
| 125 | 142 | 3,1 | 151 |
| 63 | 75 | 5,3 | 91 |
| 31,3 | 44 | 3,3 | 54 |
| 15,6 | 28 | 2,6 | 35,5 |
| 7,8 | 17 | 1,5 | 21,2 |
| 3,9 | 10 | 2,0 | 16,3 |
| 0 | 7 | 1,4 | 11,4 |
Tabel 3 De gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van een standaard verdunningsreeks gemeten door xMAP technologie, met behulp van de R & D Systems capture antilichaam en de EMD Millipore detectieantilichaam;. Waaronder standaard deviatie (SD) en de verwachte detectielimiet (LOD), minder dan 7,81 pg / ml.
Figuur 3. De standaard curves van de twee xMAP assays en de R & D Systems DuoSet ELISA. Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 4. Een vergelijking van de xMAP standaard curven en de ELISA standaard curve in een log-log schaal. Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .
Discussion
De omzetting van een ELISA-test op de Luminex xMAP platform kan zo simpel zijn als vervanging van streptavidine mierikswortelperoxidase (SA-HRP) in een typisch ELISA kit met streptavidine phycoerythrin (SA-PE), en het optimaliseren van prestaties. Voor degenen die willen een xMAP immunoassay te maken van de grond af, kan dit worden bereikt met een eenvoudig protocol dat maakt het ook mogelijk de snelle, multiplex evaluatie van het antilichaam paren. De reagentia voor de xMAP assay werden gemakkelijk bereid met xMAP antilichaam koppeling kit te koppelen aangewezen opname antilichamen MagPlex lage concentratie microsferen. Het gebruik van lage concentratie microsferen vermindert de kosten van assay ontwikkeling en biedt dezelfde test de prestaties van hogere concentratie microsferen. De hoeveelheid tijd die nodig is om gekoppeld MagPlex microsferen voor te bereiden is ongeveer 3 uur, dat is veel sneller dan de 22 - 24 uur nodig is om de vacht van de put van een ELISA-plaat, gevolgd door een behandelingvan het gecoate putjes. De prestaties van de xMAP assay ook boven de ELISA qua detectielimiet (<4 pg / ml tegen> 31 pg / ml) en het dynamisch bereik (<4 pg / ml tot> 8000 pg / ml tegen 16 pg / ml tot 1,000 g / ml). Plaat lezers hebben een beperkt bereik OD die ofwel is 3 of 4 OD, het beperken van de bovengrens van het dynamisch bereik voor een test.
Ongetwijfeld zullen niet alle antistoffen werken in een ELISA-formaat en niet alle antistoffen die goed werken in een ELISA zijn gemakkelijk overdraagbaar naar de xMAP test-formaat. Aangezien xMAP assays worden gemultiplext (dwz uitgevoerd gelijktijdig), is het mogelijk om meerdere vangen en detectie-antilichaam combinaties gelijktijdig evalueren de beste paar vast te gebruiken voor een bepalingsmethode. Dit proces bespaart veel tijd en reagentia ten opzichte van de ELISA ontwikkeling procedure, die de evaluatie van een paar beperkt tegelijk. Indien twee of meer paren antilichaam voeren equivalent, andere parameters van de test kangeacht geschikt het paar (bijvoorbeeld beschikbaarheid, prijs, enz.) te bepalen.
Naast de verbeterde uitvoering van de assay en flexibiliteit met de xMAP test, zijn er ook aanzienlijke kostenbesparingen. De aanbevolen hoeveelheid antistoffen die nodig voor het coaten van een goed van een ELISA-plaat is 400ng, dat de hoeveelheid die nodig is voor de kralen gebruikt in een put van een xMAP test is ongeveer 7,5 ng. Aldus is de hoeveelheid antilichaam dat voor een ELISA en zal meer dan 50 testresultaten, indien gebruikt in een xMAP assay. Voor toepassingen waarbij kostbare stalen, xMAP heeft ook een belangrijk voordeel. De hoeveelheid monster aanbevolen voor de ELISA 100 pi dat het volume vereist voor de xMAP assay kan helft van dat of minder.
In het kort, conversie van een ELISA-test op de Luminex xMAP platform is eenvoudig, efficiënt en kostenbesparend, terwijl het produceren van een test met een superieure dynamisch bereik en gevoeligheid.
Disclosures
Dit werk werd gedaan op Luminex Corporation met materiaal dat is vervaardigd op Luminex Corporation.
R & D Systems & EMD Millipore zijn strategische partners van Luminex Corporation, een vergunning voor het ontwikkelen en commercialiseren multiplex xMAP gebaseerde testen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door Luminex Corporation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human TNF-α/TNFSF1A DuoSet ELISA kit | R D Systems | DY210 | Includes monoclonal and biotin coupled polyclonal antibodies and recombinant TNF-α protein standard |
| Monoclonal Antibody to TNF-α | Abcam | Ab18696 | Capture Antibody, clone CH8820 |
| Monoclonal Antibody to TNF-α | Abcam | Ab16166 | Biotin coupled Detection Antibody, clone AS1 |
| TNF alpha protein | Abcam | Ab9642 | Recombinant TNF-α protein standard |
| Monoclonal Antibody to TNF-α | Novus | NBP1-50115 | Capture Antibody, clone 4H31 |
| Monoclonal Antibody to TNF-α | Novus | NB100-78162 | Biotin coupled Detection Antibody, clone MAb11 |
| TNF alpha protein | Novus | NBC1-18460 | Recombinant TNF-α protein standard |
| Monoclonal Antibody to TNF-α | EMD Millipore | MAB1141 | Capture Antibody, clone 3C7.2 |
| Polyclonal Antibody to TNF-α | EMD Millipore | 654250 | Rabbit polyclonal Detection Antibody |
| Streptavidin-Phyc–rythrin | Moss | SAPE-001 | Fluorescent reporter reagent for Luminex xMAP Assay |
| MAGPIX w/ xPONENT Software | Luminex Corporation | MAGPIX-XPONENT | Luminex Instrument |
| xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit | Luminex Corporation | 40-50016 | Includes EDC reagent, Sulfo-NHS reagent, activation buffer, wash buffer, 1.5 mL reaction tubes, and disposable pipettes |
| MagPlex Microspheres, Low Concentration | Luminex Corporation | MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID, MC10015-ID | Low concentration beads (@ 2.5 x 106 bead/mL) |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Fisher | PI-21335 | Biotinylation kit for unmodified detection antibody |
| Tecan Infinite F200 Reader | Tecan | ELISA plate reader | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P-3688 | 1% PBS-BSA, Assay Buffer |
| One-Pint Compact Ultrasonic Cleaner, 115 VAC | Cole-Parmer | WU-08849-00 | Produce an effective operating frequency of 55 kHz |
| Magnetic Tube Separator | Luminex Corporation | CN-0288-01 | For single 1.5mL tube magnetic separation in coupling wash steps |
| Magnetic Plate Separator | Luminex Corporation | CN-0269-01 | For 96-well plate magnetic separation in assay wash steps |
References
- Fulton, J. R., McDade, R. L., Smith, P. L., Kienker, L. J., Kettman, J. R. Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system. Clinical Chemistry. 43, 1749-1756 (1997).
- Carson, R. T., Vignali, A. A. Simultaneous quantation of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay. J. Immunol. Methods. 227, 41-52 (1999).
- Peck, D., Crawford, E. D., Ross, K. N., Stegmaier, K., Golub, T. R., Lamb, J. A method for high-throughput gene expression signature analysis. Genome Biol. 7, 61 (2006).
- VanDerMeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex. Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).
- Liu, J., Kibiki, G., Maro, V., Maro, A., Kumburu, H., Swai, N., Taniuchi, M., Gratz, J., Toney, D., Kang, G., Houpt, E. Multiplex reverse transcription PCR Luminex assay for detection and quantitation of viral agents of gastroenteritis. J. Clin. Virol. 50, 308-313 (2011).
- de Jager, W., Prakken, B. J., Bijlsma, J., WJ Kuis, W., Rijkers, G. T. Improved multiplex immunoassay performance in human plasma and synovial fluid following removal of interfering heterophilic antibodies. J. Immunol. Methods. 300, 124-135 (2005).
- Codorean, E., Nichita, C., Albulescu, L., Raducan, E., Popescu, I. D., Lonita, A. C., Albulescu, R. Correlation of xMAP and ELISA cytokine profiles; development and validation for immunotoxicological studies in vitro. Roum. Arch. Microbiol. Immunol. 69, 3-19 (2010).
- de Jager, W., te Velthuis, H., Prakken, B. J., Kuis, W., Rijkers, G. T. Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).
- DuPont, N. C., Wang, K. H., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. Validation and comparison of Luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: Determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants. J. Reprod. Immunol. 66, 175-191 (2005).
- Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits. Journal of Biomolecular Screening. 15, 562-568 (2010).
- Rizzi, G., Zhang, Y. J., Latek, R., Weiner, R., Rhyne, P. W. Characterization and development of a Luminex-based assay for the detection of human IL-23. Bioanalysis. 2, 1561-1572 (2010).
