Summary
Fonksiyonel T-hücre deneylerinde antijen kaynağı olarak kullanılacak insan doku özleri hazırlamak için basit bir protokol tarif edilmektedir. Bu yöntem, doku-türetilmiş antijenleri ile T-hücresi yanıtı ölçülmesine imkan verir
Abstract
B ve T hücreleri tarafından tanınan adaptif immün yanıtı antijen hedefleri, çoğu 1 tanımlanmamıştır. Bu otoimmün hastalıklar ve kanser 2 özellikle doğrudur. Amacımız, otoimmün hastalığı tip 1 diyabet 1,3,4,5 olarak insan T-hücreleri tarafından tanınan antijenler araştırmaktır. T hücreleri tarafından tanınan antijen tespit edilmemiş doku karşı insan T-hücre yanıtlarını analiz etmek için fonksiyonel testler 6 ile uyumlu bir biçimde insan dokusunda protein antijenleri ayıklamak için bir yöntem geliştirdi. Ekstraksiyon yöntemleri, insan periferik kan mononükleer hücreleri için toksik olan deterjanlar içerdiği bir lizat verim nedeniyle arıtılmadan doku özleri önce, T-hücre yanıtlarını ölçülür edilemedi. Burada insan T hücreleri için toksik olmayan bir biçimde insan dokularından protein ayıklamak için bir protokol açıklar. Doku butan-1-ol, asetonitril ve wat bir karışımı içinde homojenize edilirer (BAW). Doku ekstraktı olarak protein konsantrasyonu ölçülür ve protein, bilinen bir kütle tüpler içine bölünüp edilir. Ekstraksiyon uygulandıktan sonra, organik çözücüler liyofilizasyon ile çıkarılır. Kullanılıncaya kadar liyofilize doku ekstreleri saklanabilir. Bağışıklık fonksiyonu, bağışıklık hücrelerinin bir süspansiyonu tahlillerde kullanım için, uygun bir kültür ortamı içinde, liyofilize özü doğrudan ilave edilebilir. Bu yöntemi kullanarak hazırlanan ekstreler cevaben PBMC tarafından sitokin üretimi ve proliferasyonu, kolayca ölçülmüştür. Dolayısıyla, yöntem, T-hücresi yanıtlarının analizi antijen kaynağı olarak kullanılabilecek insan doku lizatları hızlı hazırlanmasını sağlar. Bu yöntem nakli, kanser ve otoimmünitede dokulara adaptif immün yanıtların analizi kolaylaştıracaktır öneririz.
Protocol
1. Dalak Doku hazırlanması
- Not-tüm insan malzemesi potansiyel bulaşıcı ve bütün prosedürler Sınıf II Laminer Flow Kabin yapılmalıdır olarak tedavi edilmelidir. Steril makas ve forseps kullanarak, dalak bölümler (boyut olarak ~ 1-2 cm) yağ ve fibröz doku kaldırmak ve mümkün olduğunca dış kapsül malzemesinin kadar keserek.
- Dalak dokusunun küçük bir parça (1-2 cm 3) kesin ve steril 50 ml Falcon tüp içine her parça yerleştirin.
- Sıvı N 2 batırılarak doku parçaları Snap-dondur.
- -80 ° C de saklayınız Benzer bir protokol diğer doku (lar) için uygundur.
2. Depolama için İnsan Islet hazırlanması
- CMRL medya Kültür adacık. 10 ml lik konik alt tüp içinde adacıklar toplayın ve 5 dakika için 1500 rpm'de santrifüjleme ile PBS içinde iki kere yıkayın. PBS kapalı dökün ve bir kağıt havlu üzerinde kısaca ters tüp yerleştirerek kalan tampon boşaltın. Dikkatli olunadacıklar çıkarmak için.
- -80 Sıvı azot ve mağaza kez süzülmüş, re-cap tüp ve ek dondurma ° C.
3. Özü Hazırlama
- 4 de BAW karışımı (10:30:60% v / v) ile depo ° C hazırlanması
- -80 ° C'den tüpü çıkarın Oda sıcaklığında çözülme.
- Doku parçasını örtmek için yeterli bir buz-soğuk BAW ekleyin. Adacıklar 3-5 ml kullanın. Dalak dokusu için doku parçasının büyüklüğüne bağlı olarak 10-20 ml kullanılır.
- Doku homojenizatörü birleştirin. % 70 etanol / su 10-20 ml 'homojenleştirici' ile temizleyin.
- Doku ve BAW çözeltisi ile tüp içine homojenleştirici sonda yerleştirdikten sonra, birden fazla patlamaları doku homojenize edilir. Sonra bir buz kovası içinde tüp tutun.
- İyice 10-20% 70 etanol / ml su ve sonra BAW homojenizasyon tampon ile, örnekler arasında homojenleştirici temizleyin. Bu bizden sonra% 70 etanol / su ile samples.Dismantleand temiz arasında doku çapraz kirlenmesini önlere.
- Sadece çözünür malzeme içeren bir ekstrakt gerekli ise, 10 dakika için oda sıcaklığında 4,000 rpm'de homojen doku ekstraktı santrifüjlenir. Daha ham ekstrakt gerekli ise, 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 1,000 rpm'de döndürün. BAW çözünmeyen proteinler ayıklanması için en uygun teknik, proteinlerin aşağı analiz bağlıdır. Fonksiyonel immünolojik testlerin kullanılması için biz daha önce bu iyi 6 tolere edilmesi bulduk 8 M üre erimeyen fraksiyon çözmek için çalışırken öneririm.
- Temiz bir tüpe supernatant aktarın ve buz üzerine koydu.
- Bir BCA tahlil ya da benzeri kullanılarak ekstre protein konsantrasyonu belirlenir.
4. Kurutma ayıklar dondur
- Protein gerekli kütlesi (yani, tüp başına 100 mikrogram) bağlı olarak, buna göre homojenat sulandırmak ve etiketli 5.0 ml steril, Falcon (12x75 mm) tüpler içine alikotları dağıtmak. Biz sık sık 100 mikrogram / tüp kullanın.
- Bir 1 kullanınHer tüp kapağında 3 delik yapmak için 8-20 ölçer steril şırınga iğnesi.
- ~ 10 dakika süreyle kuru buz veya> 1 saat için -80 ° C derin dondurucuda yerleştirerek ya tüpleri dondurun. -80 ° C'de saklayın liyofilizerde koymak için hazır olana kadar.
- Dondurarak kurutma makinesini açın ve (-100 ° C) gelmesini sağlayınız. Bu yaklaşık 30 dakika sürer.
- Hacmi bağlı olarak, dondurarak kurutma 3 saat içinde tamamlanır fakat rutin gecede bizim örnekleri terk edilebilir.
- Kurutma döngüsünün tamamlanmasından sonra, vakum pompası devre dışı geçer ve yavaş yavaş oda içine basınç sağlar. Raf çıkarın.
- Steril bir başlık olarak, tüplerinden perfore kapaklarını çıkarın ve yenilerini (Falcon 352.032) ile değiştirin.
- -20 ° C'de saklayın tüpler Örnekler kültür ortamı, ya da başka tampon içinde yeniden, ve fonksiyon ya da biyokimyasal tahlillerde kullanılabilir.
5. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1, bir proteinin boyanmalarıjel dalak ve adacık tükenmiş pankreatik doku (asiner etiketli) özü ve insan adacıklar (etiketli adacıkları) saflaştırılmış ile yüklenir. Sonuçlar, her bir doku için farklı moleküler ağırlıkları protein iyi bir temsilini göstermektedir.
Insan T hücre proliferasyonunu stimüle etmek için doku özleri kapasitesi CFSE proliferasyon tabanlı tahlil 7 (Şekil 2) kullanılarak test edilmiştir. Bu tahlilde kullanılan PBMC tip 1 diyabet ile tek bir izole edilmiştir. Tepki büyüklüğü antijen olmaksızın 5.000 CD4 +, CFSE parlak hücre başına CFSE sönük hücrelerin sayısının oranı olarak ifade edilir: 5000 CD4 başına CFSE sönük hücre +, üç kopya numuneler 7 antijen ile CFSE parlak hücreleri. Sonuçları zayıf gösteriyor, ancak asiner yanıt (CD1 = 3.5) ve adacık özütü (6.8) için güçlü bir yanıt olarak saptanabilir, yayılması. İnaktive Grip virüsü (CDI = 142.6) olarak dahildirpozitif kontrol.
Şekil 1. Protein jel.
Asiner ve adacık özü karşı KAKE tabanlı çoğalması tahlil Şekil 2'de. Sonuçlar. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz deterjan gibi toksik kimyasallar ücretsiz insan dokusunda bir özü oluşturmak istedim, çünkü bu protokol geliştirilmiştir. Özellikle in vitro insan bağışıklık işlevi metodlarda kullanılan insan doku özleri hazırlamak için kullanılmıştır. Bu protokol kullanılarak hazırlandı özler eşit herhangi bir tampon içinde yeniden oluşturulmuş ve bu gibi western blot ya da sıvı kromatografi gibi pek çok biyokimyasal analizler için de kullanılabilir. Bu birçok downstream uygulamalar için geçerli bu tekniği yapar.
Bizim protokolünü kullanarak doku özleri yanıtı güçlü değildir. Biz 'öz' antijenlere yanıt arıyoruz çünkü bu beklenmektedir; bizim durumumuzda adacık antijenlerine karşı T-hücre yanıtlarını sıklıkla 1 zayıftır. Daha önce biz insan CD4 + rekombinant proinsülin ve glutamik asit dekarboksilaz (GAD), T hücre yanıtlarının, tip 1 diyabet otoantigen, bizim KAKE tabanlı kullanılarak tespit edilebileceği bulunduproliferasyonu tayininde 7,8. Biz 10 9 sentetik peptidler kullanılarak ve rekombinant proteinler ile ilişkili sorunları önlemek için doku özleri kullanmayı seçtiniz.
Biz rutin çekimlerine proteaz inhibitörleri eklemeyin. Proteaz inhibitörlerinin varlığı antijen işleme ve sunumu 11 inhibe eden ve dolayısıyla T-hücresi yanıtı inhibe edebilir. Bunun yerine biz proteaz-aracılı yıkımı engellemek için bir girişim buz üzerinde çıkarımı yapmak. Protein degradasyonu bir sorun ise, diğer uygulamalar için, proteaz inhibitörlerinin eklenmesi yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu eser Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC # 559007) ve Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı (JDRF 4-2006-1025) ve Victoria Hükümeti Operasyonel Altyapı Programı hibeleri ile desteklenmektedir. Biz insan dokuları sağlamak için Tom Mandel Islet Nakli Programı Islet İzolasyon Takımı üyelerine teşekkür ediyorum. İnsan dokularında yerel etik kurul onayı ile toplandı ve kullanıldı (St Vincent Hastanesi HREC-A 011/04 ve St Vincent Sağlık HREC-A 135/08).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ml 12 x 75 mm sterile polystyrene tubes | BD Falcon | 352054 | |
| Caps for tubes polystyrene tubes (above) | BD Falcon | 352032 | |
| 50ml sterile tubes | Becton Dickinson | 352070 | |
| Acetonitrile | Mallinckradt Chemicals | 2856-10 | |
| Butan-1-ol | Sigma Aldrich | 537993-IL | |
| Homogenizer: PRO200 | Bio-strategy | 01-01200 | 10 x 115 mm saw-tooth generator |
| Lyophilizer | Virtis, Benchtop 4K | ||
| Sterile Needle 18-20 gauge | Becton Dickinson | REF 302032 | |
| CMRL-1066 Medium | Sigma | C0422 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
Table 1. Specific reagents and equipment. |
|||
References
- Mannering, S. I. Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).
- Beckhove, P. Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation. J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).
- Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes. Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).
- Mannering, S. I. The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).
- Mannering, S. I. The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified. J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).
- Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays. Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).
- Mannering, S. I. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).
- Mannering, S. I. CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).
- Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide. Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).
- Peakman, M. Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes. Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).
- Honey, K., Rudensky, A. Y. Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation. Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).
