Summary
Простой протокол для подготовки экстрактов тканей человека для использования в качестве источника антигенов в функциональных Т-клеточных анализов описаны. Этот метод позволяет Т-клеточный ответ на ткани антигенов для измерения
Abstract
Многие из антигена целей адаптивного иммунного ответа, признанного B и Т-клетки, которые не были определены 1. Это особенно актуально при аутоиммунных и онкологических заболеваний 2. Нашей целью является исследование антигенов признан человеческий Т-клеток в аутоиммунных болезней типа диабета 1 1,3,4,5. Для анализа человеческого Т-клеточного ответа против ткани, где антигенов признан Т-клетки не выявлены мы разработали метод извлечения белковых антигенов от человеческих тканей в формат, совместимый с функциональными анализы 6. Ранее, Т-клеточный ответ на неочищенных экстрактах ткани не может быть измерено, потому что добыча методы дают лизат, содержащий моющие средства, которые были токсичными для человека мононуклеарных клеток периферической крови. Здесь мы опишем протокол для извлечения белков из тканей человека в формате, который не является токсичным для человеческого Т-клеток. Ткани гомогенизируют в смеси бутан-1-ол, ацетонитрил и Ватэр (BAW). Концентрация белка в тканях экстракта измеряют и известная масса белка аликвоты в пробирки. После извлечения органических растворителей удаляются путем лиофилизации. Лиофилизированный экстракт ткани могут храниться до необходимости. Для использования в анализах функции иммунной системы, подвески иммунных клеток, в соответствующих средствах массовой информации культуре, может быть добавлена непосредственно в лиофилизированного экстракта. Производство цитокинов и пролиферацию PBMC в ответ на экстракты, приготовленные с помощью этого метода, было легко измерить. Таким образом, наш метод позволяет быстро подготовка человека лизатов ткани, которые могут быть использованы в качестве источника антигенов в анализе Т-клеточного ответа. Мы полагаем, что этот метод будет способствовать анализ адаптивного иммунного ответа тканей при трансплантации, рак и аутоиммунные заболевания.
Protocol
1. Подготовка ткани селезенки
- Обратите внимание, все человеческий материал следует рассматривать как потенциально инфицированные и все процедуры должны проводиться в ламинарном класса Кабинета потока II. Используя стерильные ножницы и пинцет, удаления жира и волокнистой ткани селезенки разделах (~ 1-2 см в диаметре) и обрезать, как большая часть внешнего материала капсулы насколько это возможно.
- Отрежьте небольшой кусочек (1-2 см 3) ткани селезенки и поместить каждую часть в стерильные 50 мл трубки Falcon.
- Snap-замораживать кусочки тканей путем погружения в жидкий N 2.
- Хранить при температуре -80 ° C. Аналогичный протокол подходит для других тканей (ы).
2. Подготовка человека островок для хранения
- Культура островков в CMRL СМИ. Сбор островков в 10 мл коническую трубку нижней и мыть дважды в PBS путем центрифугирования при 1500 оборотах в минуту в течение 5 мин. Вылейте PBS и слейте остаточную буфера путем размещения перевернутой пробирки на бумажное полотенце. Будьте осторожны, невыбить островков.
- После слить, снова крышку трубки и оснастки замораживание в жидком азоте и хранят при температуре -80 ° C.
3. Подготовка Extract
- Подготовка BAW смеси (10:30:60% объем / объем) и хранить при 4 ° C.
- Снимите трубку от -80 ° C. Разморозить при комнатной температуре.
- Добавьте достаточное количество ледяной BAW, чтобы покрыть кусок ткани. Для островков использовать 3-5 мл. Для ткани селезенки использовать 10-20 мл в зависимости от размера куска ткани.
- Соберите ткань гомогенизатора. Очистите от «гомогенизации» 10-20 мл 70% этанола / воды.
- Однородный ткани в несколько очередей, после размещения гомогенизатора зонд в трубу с тканью и BAW решение. Держите трубку в ведро льда в дальнейшем.
- Тщательно очистите гомогенизатор между образцами, путем гомогенизации 10-20 мл 70% этанола / воды, а затем BAW буфера. Это предотвращает перекрестное загрязнение ткани между samples.Dismantleand чисто с 70% этанол / вода после насе.
- Если экстракт, содержащий только растворимого материала не требуется, центрифуги гомогенизированный экстракт ткани при 4000 оборотов в минуту при комнатной температуре в течение 10 мин. Если более сырой экстракт требуется, спина при 1000 оборотов в минуту при комнатной температуре в течение 5 мин. Наиболее подходящий метод для извлечения BAW-нерастворимых белков зависит от вниз по течению анализа белков. Для использования в функциональных анализов иммунологических мы хотели бы предложить пытается растворить нерастворимую фракцию в 8 М мочевине как мы уже обнаружили, что это хорошо переносится 6.
- Передача супернатант в чистую пробирку и поставьте его на лед.
- Определить концентрацию белка в экстракте с использованием анализа BCA или аналогичный.
4. Сублимационной сушки экстрактов
- В зависимости от массы белка требуется (т.е. 100 мкг на трубке), разбавленные гомогенат, соответственно, и обойтись аликвоты в обозначенный 5,0 мл стерильного, Falcon (12x75 мм) труб. Мы часто используют 100 мкг / трубка.
- Используйте 18-20 калибровочных стерильной иглой шприца, чтобы сделать 3 отверстия в крышке каждой трубки.
- Замораживание труб или путем размещения их на сухом льду в течение ~ 10 мин или в -80 ° C морозильнике в течение> 1 часа. Хранить при температуре от -80 ° C до готовности положить на лиофилизатор.
- Включение стоп-сушилка и позволяет уравновесить (-100 ° C). Это займет около 30 мин.
- В зависимости от объема, сублимационной сушки может быть завершена в течение 3 часов, но мы обычно оставлять наши образцы в течение ночи.
- После завершения цикла сушки, выключите вакуумный насос и медленно позволяют давления в камере. Удалить стойку.
- В стерильных капот, снимите колпачки с перфорированной трубы и заменить на новые (Falcon +352032).
- Магазин труб при температуре -20 ° C. Образцы могут быть восстановлены в культуре средств массовой информации, или других буферов, и используются в функции или биохимических анализов.
5. Представитель Результаты
На рисунке 1 показано окрашивание белкаГель загружены выписки из селезенки и островок обедненного ткани поджелудочной железы (обозначенный ацинарных) и очищают человека островков (обозначение островков). Результаты показывают хорошее представление о белках различного молекулярного веса для каждой ткани.
Емкость тканевые экстракты, чтобы стимулировать человека пролиферацию Т-клеток была проверена с помощью CFSE на основе анализа пролиферации 7 (рис. 2). PBMC, используемые в этом анализе были изолированы от человека с сахарным диабетом 1 типа. Величина реакции выражается как отношение числа CFSE тусклом клеток на 5000 CD4 +, CFSE яркие клетки без антигена: из CFSE тусклом клеток на 5000 CD4 +, CFSE яркие клеток с антигеном из трех образцов 7. Результаты показывают слабое, но обнаруживается, распространение в ответ на ацинарных (CD1 = 3,5) и более сильную реакцию на островке экстракт (6,8). Инактивированный вирус гриппа (CDI = 142,6) включен в качествеположительного контроля.
Рисунок 1. Белки гель.
Рисунок 2. Результаты CFSE на основе анализа пролиферации против ацинарных и островок экстракта. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол был разработан, потому что мы хотели создать выписку из тканей человека, которая была свободна от токсичных химических веществ, таких как моющие средства. В частности, мы использовали его для подготовки экстрактов тканей человека, которые могут быть использованы в анализах человеческой иммунной функции в пробирке. Экстракты, приготовленные с использованием этого протокола в равной степени могут быть восстановлены в любой буфер и использовать для многих биохимических анализов, такие как вестерн-блоттинга или жидкостной хроматографии. Это делает этот метод применим ко многим вниз по течению приложений.
Используя наш протокол ответа на тканевые экстракты не сильны. Ожидается, что это потому, что мы ищем ответы на "я" антигенов, в нашем случае Т-клеточного ответа против антигенов островка часто являются слабыми 1. Ранее мы обнаружили, что человеческий CD4 + Т-клеток ответы на рекомбинантного проинсулина и глутаминовой кислоты декарбоксилазы (ГИР), аутоантигенов в диабетом типа 1, могут быть обнаружены с помощью наших CFSE основепролиферации 7,8. Мы решили использовать тканевые экстракты, чтобы избежать проблем, связанных с использованием синтетических пептидов, 9 и рекомбинантных белков 10.
Мы обычно не добавляют ингибиторы протеазы нашей экстракции. Присутствие ингибиторов протеазы может препятствовать обработке антигена и презентации 11 и, следовательно, ингибирует Т-клеточного ответа. Вместо этого мы проводим добычи на льду в попытке предотвратить протеазы-опосредованной деградации. Для других приложений включения ингибиторов протеазы может быть полезно, если деградации белка является проблемой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке грантов от Австралийского национального здравоохранения и медицинских исследований Совета (NHMRC # 559007) и детского диабета исследовательский фонд (JDRF 4-2006-1025) и схема работы инфраструктуры правительства штата Виктория. Мы благодарим членов Tom Mandel трансплантации островков Программа Команда изоляции островок для обеспечения тканей человека. Ткани человека были собраны и использованы с местными этические утверждения (больница Святого Винсента HREC-A 011/04 и здоровью Сент-Винсент HREC-A 135/08).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ml 12 x 75 mm sterile polystyrene tubes | BD Falcon | 352054 | |
| Caps for tubes polystyrene tubes (above) | BD Falcon | 352032 | |
| 50ml sterile tubes | Becton Dickinson | 352070 | |
| Acetonitrile | Mallinckradt Chemicals | 2856-10 | |
| Butan-1-ol | Sigma Aldrich | 537993-IL | |
| Homogenizer: PRO200 | Bio-strategy | 01-01200 | 10 x 115 mm saw-tooth generator |
| Lyophilizer | Virtis, Benchtop 4K | ||
| Sterile Needle 18-20 gauge | Becton Dickinson | REF 302032 | |
| CMRL-1066 Medium | Sigma | C0422 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
Table 1. Specific reagents and equipment. |
|||
References
- Mannering, S. I. Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).
- Beckhove, P. Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation. J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).
- Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes. Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).
- Mannering, S. I. The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).
- Mannering, S. I. The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified. J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).
- Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays. Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).
- Mannering, S. I. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).
- Mannering, S. I. CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).
- Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide. Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).
- Peakman, M. Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes. Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).
- Honey, K., Rudensky, A. Y. Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation. Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).
