Summary
मानव ऊतक के निष्कर्षों के लिए कार्यात्मक टी सेल assays में एंटीजन का एक स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा तैयार करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल में वर्णित है. इस विधि ऊतक व्युत्पन्न प्रतिजनों के लिए टी सेल प्रतिक्रिया मापा जा करने की अनुमति देता है
Abstract
अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के प्रतिजन लक्ष्य, बी और टी कोशिकाओं द्वारा मान्यता प्राप्त है, के कई 1 परिभाषित नहीं किया गया है. यह autoimmune रोग और कैंसर 2 में विशेष रूप से सच है. हमारा उद्देश्य autoimmune रोग प्रकार 1 मधुमेह 1,3,4,5 में मानव टी कोशिकाओं द्वारा मान्यता प्राप्त प्रतिजनों की जांच करने के लिए है. ऊतक जहां प्रतिजनों टी कोशिकाओं द्वारा मान्यता प्राप्त नहीं की पहचान कर रहे हैं के खिलाफ मानव टी सेल प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए हम एक प्रारूप कि कार्यात्मक 6 assays के साथ संगत है में मानव ऊतकों से प्रोटीन प्रतिजनों को निकालने के लिए एक विधि विकसित की है. Unpurified ऊतक के अर्क के लिए पहले, टी सेल प्रतिक्रिया क्योंकि निष्कर्षण तरीकों एक lysate कि डिटर्जेंट कि मानव परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं को विषाक्त थे निहित उपज नहीं मापा जा सकता है. यहाँ हम एक स्वरूप है कि मानव टी कोशिकाओं को विषाक्त नहीं है में मानव ऊतकों से प्रोटीन निकालने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. ऊतक Butan-1-राजभाषा acetonitrile, और वाट के एक मिश्रण में homogenized हैएर (Baw). ऊतक निकालने में प्रोटीन एकाग्रता मापा जाता है और प्रोटीन का एक ज्ञात ट्यूबों में बड़े पैमाने पर aliquoted है. निकासी के बाद, कार्बनिक सॉल्वैंट्स lyophilization से हटा रहे हैं. Lyophilized ऊतक के अर्क जब तक आवश्यक संग्रहीत किया जा सकता है. प्रतिरक्षा समारोह, प्रतिरक्षा कोशिकाओं का एक निलंबन assays में उपयोग के लिए उपयुक्त संस्कृति मीडिया में, lyophilized निकालने के लिए किया जा सीधे जोड़ा जा सकता है. Cytokine उत्पादन और PBMC द्वारा प्रसार, इस पद्धति का उपयोग करके तैयार अर्क के जवाब में, आसानी से मापा गया. इसलिए, हमारे विधि मानव ऊतकों lysates कि टी सेल प्रतिक्रिया के विश्लेषण में प्रतिजनों के स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है तेजी से तैयारी की अनुमति देता है. हमारा सुझाव है कि इस विधि प्रत्यारोपण, कैंसर और autoimmunity में ऊतकों को अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के विश्लेषण की सुविधा होगी.
Protocol
1. प्लीहा ऊतक की तैयारी
- नोट सभी मानव संभावित संक्रामक है और सभी प्रक्रियाओं को एक द्वितीय श्रेणी लैिमनार फ्लो कैबिनेट में आयोजित किया जाना चाहिए सामग्री के रूप में व्यवहार किया जाना चाहिए. बाँझ कैंची और संदंश का प्रयोग, तिल्ली वर्गों (~ आकार में 1-2 सेमी) से वसा और तंतुमय ऊतक को हटाने और बंद के रूप में संभव के रूप में बाहरी कैप्सूल सामग्री के बहुत ट्रिम.
- तिल्ली ऊतक का एक छोटा सा टुकड़ा (1-2 3 सेमी) काटें और एक बाँझ 50 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब में प्रत्येक टुकड़ा जगह.
- तरल N 2 में विसर्जन से ऊतक के टुकड़े स्नैप फ्रीज.
- -80 पर स्टोर डिग्री सेल्सियस एक समान प्रोटोकॉल अन्य ऊतकों (ओं) के लिए उपयुक्त है.
2. भंडारण के लिए मानव आइलेट की तैयारी
- CMRL मीडिया में संस्कृति islets. एक 10 मिलीलीटर शंक्वाकार नीचे ट्यूब में islets लीजिए और पीबीएस में दो बार 5 मिनट के लिए 1500 rpm पर centrifuging से धो. बंद पीबीएस डालो और उल्टे ट्यूब संक्षेप में एक कागज पर तौलिया रखने के द्वारा अवशिष्ट बफर नाली. सावधान नहीं रहोislets हटाना है.
- एक बार सूखा, पुनः टोपी और ट्यूब तरल नाइट्रोजन और दुकान में तस्वीर फ्रीज -80 डिग्री सेल्सियस
3. निकालें की तैयारी
- BAW मिश्रण (10:30:60% v / v) और दुकान 4 डिग्री सेल्सियस तैयार करें
- -80 डिग्री सेल्सियस से ट्यूब निकालें कमरे के तापमान पर पिघलना.
- ऊतक के टुकड़े को कवर करने के लिए पर्याप्त बर्फ ठंड BAW जोड़ें. Islets 3-5 मिलीलीटर का उपयोग करें. तिल्ली ऊतक के लिए ऊतक के टुकड़े के आकार पर निर्भर करता है 10-20 मिलीलीटर का उपयोग करें.
- ऊतक homogenizer इकट्ठे. 70% इथेनॉल / पानी के 10-20 मिलीलीटर homogenizing 'से साफ करें.
- कई फटने में ऊतक ऊतक और BAW समाधान के साथ ट्यूब में homogenizer जांच रखने के बाद, homogenize. एक बर्फ बाल्टी में ट्यूब उसके बाद रखें.
- अच्छी तरह से 70% इथेनॉल / पानी की 10-20 मिलीग्राम और फिर BAW बफर homogenizing द्वारा नमूने के बीच homogenizer, साफ करने के लिए. यह 70% इथेनॉल / पानी के साथ हमारे बाद samples.Dismantleand साफ के बीच ऊतक के पार संक्रमण से बचाता हैई.
- यदि एक ही घुलनशील पदार्थ युक्त निकालने की आवश्यकता है, आरटी पर 4,000 rpm पर 10 मिनट के लिए homogenized ऊतक निकालने अपकेंद्रित्र. यदि एक अधिक कच्चे तेल निकालने की आवश्यकता है, आरटी पर 1,000 rpm पर 5 मिनट के लिए स्पिन. BAW अघुलनशील प्रोटीन निकालने के लिए सबसे उपयुक्त तकनीक प्रोटीन के बहाव के विश्लेषण पर निर्भर करता है. कार्यात्मक प्रतिरक्षाविज्ञानी assays में उपयोग के लिए हम 8 एम यूरिया में अघुलनशील अंश भंग जैसा कि हम पहले यह अच्छी तरह से 6 सहन पाया है करने का प्रयास करने का सुझाव जाएगा.
- एक साफ ट्यूब तैरनेवाला स्थानांतरण और बर्फ पर रख दिया.
- एक बीसीए परख या इसी तरह का उपयोग कर निकालने में प्रोटीन की एकाग्रता का निर्धारण करते हैं.
4. सुखाने अर्क स्थिर
- प्रोटीन की आवश्यकता की बड़े पैमाने पर निर्भर करता है (यानी, ट्यूब प्रति 100 ग्राम), homogenate तदनुसार कमजोर और 5.0 मिलीलीटर बाँझ लेबल, फाल्कन ट्यूब (12x75 मिमी) में aliquots बांटना. हम अक्सर 100 छ / ट्यूब का उपयोग करें.
- 1 का उपयोग8-20 गेज बाँझ सिरिंज सुई प्रत्येक ट्यूब की टोपी में 3 छेद कर.
- ट्यूब या तो रुक उन्हें ~ 10 मिनट के लिए सूखी बर्फ पर या एक -80 °> 1 घंटा के लिए सी फ्रीजर में रखने के द्वारा. -80 पर स्टोर डिग्री सेल्सियस तक को lyophilizer पर डाल करने के लिए तैयार है.
- फ्रीज सुखाने की मशीन पर स्विच और संतुलन में लाना की अनुमति (-100 डिग्री सेल्सियस). इस बारे में 30 मिनट लगते हैं.
- मात्रा पर निर्भर करता है, फ्रीज सुखाने के 3 घंटे के भीतर पूरा किया जा सकता है, लेकिन हम नियमित रूप से हमारे नमूने रातोंरात छोड़.
- सुखाने चक्र के पूरा होने के बाद, वैक्यूम पंप स्विच और धीरे धीरे चेंबर में दबाव की अनुमति. रैक निकालें.
- एक बाँझ हुड में, ट्यूब से छिद्रित टोपी हटाने और नए लोगों (352,032 फाल्कन) के साथ बदलें.
- -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ट्यूब नमूने संस्कृति, मीडिया, या अन्य buffers में पुनर्गठन किया जा सकता है, और समारोह या जैव रासायनिक assays में प्रयोग किया जाता है.
5. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1 एक प्रोटीन की धुंधला से पता चलता हैजेल प्लीहा और आइलेट समाप्त अग्नाशय के ऊतकों (लेबल कोष्ठकी) से निकालने और शुद्ध मानव islets (लेबल islets) के साथ भरी हुई है. परिणाम प्रत्येक ऊतक के लिए विभिन्न आणविक वजन के प्रोटीन का अच्छा प्रतिनिधित्व है.
ऊतक अर्क की क्षमता मानव टी सेल प्रसार को प्रोत्साहित प्रसार CFSE आधारित 7 परख (चित्रा 2) का उपयोग कर परीक्षण किया गया था. इस परख में इस्तेमाल PBMC टाइप 1 मधुमेह के साथ एक व्यक्ति से अलग थे. प्रतिक्रिया की भयावहता प्रतिजन बिना प्रति पचास सौ +, CFSE उज्ज्वल कोशिकाओं CD4 CFSE मंद कोशिकाओं की संख्या के अनुपात के रूप में व्यक्त किया जाता है: 5,000 CD4 प्रति CFSE मंद कोशिकाओं के CFSE प्रतिजन के साथ तीन प्रतियों 7 नमूनों से उज्ज्वल कोशिकाओं. परिणाम एक कमजोर दिखाने के लिए, लेकिन कोष्ठकी के लिए प्रतिक्रिया (= CD1 3.5) और एक मजबूत आइलेट निकालने (6.8) के लिए जवाब में detectable प्रसार. निष्क्रिय इन्फ्लूएंजा वायरस (142.6 = CDI) के रूप में शामिल किया गया हैसकारात्मक नियंत्रण.
चित्रा 1 प्रोटीन जेल.
कोष्ठकी और आइलेट निकालने के खिलाफ एक CFSE आधारित प्रसार परख से चित्रा 2 परिणाम बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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Discussion
इस प्रोटोकॉल विकसित किया गया था, क्योंकि हम एक मानव ऊतकों कि डिटर्जेंट जैसे जहरीले रसायनों से मुक्त किया गया था से निकालने उत्पन्न करना चाहता था. विशेष रूप से हम इसे इस्तेमाल किया है मानव ऊतक के निष्कर्षों की है कि इन विट्रो में मानव प्रतिरक्षा समारोह के assays में इस्तेमाल किया जा सकता है तैयार. इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर तैयार निष्कर्षों को समान रूप से किसी भी बफर में का पुनर्गठन किया जा सकता है और पश्चिमी सोख्ता या तरल क्रोमैटोग्राफी के रूप में कई जैव रासायनिक विश्लेषण, के लिए इस्तेमाल किया. यह यह कई बहाव के आवेदन करने के लिए लागू तकनीक बनाता है.
हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग ऊतक के अर्क के जवाब में मजबूत नहीं कर रहे हैं. इसका कारण यह है कि हम 'स्व' एंटीजन को प्रतिक्रिया के लिए देख रहे हैं उम्मीद है, हमारे मामले में आइलेट प्रतिजनों के खिलाफ टी सेल प्रतिक्रिया अक्सर 1 कमजोर हैं. इससे पहले हमने पाया है कि मानव सीडी 4 + टी सेल प्रतिक्रिया रीकॉम्बीनैंट proinsulin और glutamic एसिड decarboxylase (जीएडी), टाइप 1 मधुमेह में autoantigens, हमारे CFSE आधारित का उपयोग कर पता लगाया जा सकता हैप्रसार परख 7,8. हम सिंथेटिक पेप्टाइड्स 9 का उपयोग कर और पुनः संयोजक प्रोटीन 10 के साथ जुड़े समस्याओं से बचने के ऊतक के अर्क का उपयोग करने के लिए चुना है.
हम नियमित रूप से हमारे extractions protease inhibitors जोड़ नहीं है. protease inhibitors की उपस्थिति प्रतिजन प्रसंस्करण और प्रस्तुति 11 को बाधित और फलस्वरूप टी सेल प्रतिक्रिया को बाधित कर सकते हैं. इसके बजाय हम एक protease-मध्यस्थता के क्षरण को रोकने के प्रयास में बर्फ पर निकासी करते हैं. Protease inhibitors का समावेश अन्य अनुप्रयोगों के लिए फायदेमंद हो सकता है अगर प्रोटीन गिरावट एक समस्या हो सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम ऑस्ट्रेलियाई राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (NHMRC 559,007) और किशोर मधुमेह अनुसंधान फाउंडेशन (4-2006-1025 JDRF) और विक्टोरियन सरकार का परिचालन इन्फ्रास्ट्रक्चर योजना से अनुदान द्वारा समर्थित है. हम मानव ऊतकों प्रदान करने के लिए टॉम मेंडल आइलेट प्रत्यारोपण कार्यक्रम आइलेट अलगाव टीम के सदस्यों को धन्यवाद. मानव ऊतकों एकत्र थे और स्थानीय नैतिक अनुमोदन के साथ इस्तेमाल किया (सेंट विन्सेंट अस्पताल HREC ए / 04 011 और सेंट विन्सेंट स्वास्थ्य HREC - 135/08).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ml 12 x 75 mm sterile polystyrene tubes | BD Falcon | 352054 | |
| Caps for tubes polystyrene tubes (above) | BD Falcon | 352032 | |
| 50ml sterile tubes | Becton Dickinson | 352070 | |
| Acetonitrile | Mallinckradt Chemicals | 2856-10 | |
| Butan-1-ol | Sigma Aldrich | 537993-IL | |
| Homogenizer: PRO200 | Bio-strategy | 01-01200 | 10 x 115 mm saw-tooth generator |
| Lyophilizer | Virtis, Benchtop 4K | ||
| Sterile Needle 18-20 gauge | Becton Dickinson | REF 302032 | |
| CMRL-1066 Medium | Sigma | C0422 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
Table 1. Specific reagents and equipment. |
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References
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