Antilichaamkleuring in Published: October 14, 2013 doi: 10.3791/50664

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Janet S. Duerr¹

¹Department of Biological Sciences, Ohio University

Summary

"Freeze-kraken," een werkwijze voor het blootstellen van de inwendige weefsels van de nematode C. elegans antilichamen voor eiwit lokalisatie, wordt aangetoond.

Abstract

Om C. vlek elegans met antilichamen, moet de doorlatende cuticula worden omzeild door chemische of mechanische methoden. "Freeze-kraken" is een methode die wordt gebruikt om fysiek trek de cuticula van nematoden door het comprimeren van nematoden tussen twee aanhangend dia's, ze in te vriezen, en de dia's uit elkaar te trekken. Freeze-kraken is een eenvoudige en snelle manier om toegang tot de weefsels krijgen zonder chemische behandeling en kan worden gebruikt met een verscheidenheid van fixeermiddelen. Dit leidt echter tot het verlies van veel van de monsters en de vereiste compressie mechanisch vervormt het monster. Praktijk is nodig om het herstel van de monsters met een goede morfologie maximaliseren. Freeze-kraken kan worden geoptimaliseerd voor specifieke fixatie voorwaarden terugwinning van monsters of lage niet-specifieke kleuring, maar niet voor alle parameters tegelijk. Voor antilichamen die zeer moeilijk fixatie omstandigheden dit vereisen en tolereren de chemische behandelingen nodig zijn om chemisch permeabiliseren de cuticula, treatment van intacte nematoden in oplossing de voorkeur. Wanneer het antilichaam is een lichtere oplossing of als de optimale fixatie voorwaarden bekend, vries-kraken levert een zeer nuttige manier om snel assay het antilichaam en kunnen specifieke subcellulaire en cellulaire lokalisatie informatie opleveren voor het antigeen van belang.

Introduction

Om de cellulaire en subcellulaire lokalisatie van eiwitten te bepalen, hebben wetenschappers traditioneel gemerkte weefsels met antilichamen geselecteerd om specifiek bepaalde eiwitten herkent ^1. In sommige model organismen zoals C. elegans, antilichaam kleuring is vaak vervangen door moleculaire genetische technieken, die sneller resultaten opleveren. Deze omvatten transformeren organismen constructen bestaande uit genfusies tussen de promoter en coderende regio van het gen van interesse en groen fluorescerend proteïne. Echter, moleculaire technieken zijn onderhevig aan een aantal voorwerpen, waaronder problemen met het kennen van de ware promotor en veranderingen in expressie van de constructen een groot aantal kopieën (gebruikelijke technieken in C. elegans) ^2,3. Daarom kleuring met antilichamen blijft een doel voor veel wetenschappers bestuderen eiwit functie in vivo.

Kleuring weefsels met antilichamen kan moeilijk zijn, omdat eentibodies mogen alleen hun antigeen herkennen in een bepaalde conformatie ^1. Bijvoorbeeld kunnen antilichamen alleen gedenatureerde of intacte antigeen vast op een bepaalde manier herkennen en het antigeen in situ niet herkennen. Het probleem van antilichaam kleuring in nematoden wordt verergerd door het feit dat de cuticula van de nematode vormt een betrekkelijk ondoordringbare barrière, toegang van antilichamen aan weefsels blokkeren.

Er zijn verschillende methoden voor antilichaam kleuring in C. elegans (besproken in onze vorige werk ^4). Intacte vlek "wormen werden methoden ontwikkeld om bevriezen en ontdooien in een relatief hard fixeermiddel (formaldehyde of glutaaraldehyde), de vries-dooi cycli helpen de cuticula kraken snelle penetratie van het fixeermiddel ⁵ toestaan. Na fixatie werd de cuticula permeabel de penetratie van het antilichaam mogelijk te maken; methoden inbegrepen behandeling met reductiemiddelen, collagenase of beide ^5-7. Deze treatments bewaard morfologie, maar vaak verminderd of vernietigd antilichaam herkenning. Alternatieve methoden omvatten dissectie ⁸ tot antilichaam penetratie mogelijk te maken.

"Freeze-kraken" is een manier om toegang tot het inwendige van de semi-intacte worm krijgen zodat antilichaam kleuring ^9-10. Freeze-kraken kan worden uitgevoerd met verschillende fixatie omstandigheden terwijl het vermijden collagenase en vermindering behandelingen. De nematoden worden geplaatst tussen twee kleefstoffen dia, bevroren, en de glijbanen zijn gescheiden, terwijl de meeste van de nematode aan de onderkant glijbaan en veel van de cuticula van de bovenste slede. De onderste dia kan in fixatief worden geplaatst en de gehele dia met gehandeld nematoden wordt overgedragen via de antilichaamkleuring procedure. De methode doet dit moment twee grote problemen. Ten eerste is het moeilijk om de juiste hoeveelheid druk nodig om de nematoden splitsen zonder serieus vervormen toepassen. Ook een in de wormen zal niet saankruisen om ofwel dia, en gaan verloren in de lijm of spoelingen. Echter, met de juiste glijbanen en praktijk de methode snel nematoden opleveren redelijke morfologie die kunnen worden gebruikt met een grote verscheidenheid van fixeermiddelen en antilichamen.

De werkwijze kan enigszins variëren, afhankelijk van het doel van de experimentator. Indien kleuring van enkele nematoden gewenst (bijvoorbeeld om te bepalen of een transformant antilichaam kleuring is veranderd), dan schuift met maximale hechting (maar hogere achtergrondkleuring) kunnen worden gebruikt, zoals laboratorium bereide objectglaasjes met extra polylysine (zie hieronder). Voor formaldehyde of glutaaraldehyde fixatie, moeten hogere hechting slides (-laboratorium vervaardigde polylysine slides) worden gebruikt, omdat aaltjes zich meer slecht op polylysine na deze fixaties. Als wildtype nematoden worden gefixeerd met methanol en / of aceton, dan schuift met lagere hechting en lagere achtergrond kleuring worden gebruikt (commercieel of laboratory bereid dia). Indien verschillende antilichamen en fixeermiddelen worden gebruikt in het laboratorium, kan een selectie dia tevoren worden bereid en opgeslagen totdat ze nodig.

Nadat is toegang gekregen tot de nematode weefsel, antilichaamkleuring procedures te volgen standaard methoden (met een langere incubaties kenmerk van weefsels in plaats van cellen ^1,11).

Protocol

OPMERKING: Meerdere protocol stappen worden met opties voor de set-up en voorbereiding afhankelijk van de specifieke omstandigheden van het experiment. In deze gevallen worden alternatieve stappen voorgesteld als A, B, C, enz. Het protocol met alternatieve stappen is beschreven in figuur 1.

1. Voorbereiding van Polylysine gecoate glaasjes

Drie verschillende soorten dia worden gebruikt, afhankelijk van het gewenste compromis tussen gemak van bereiding, relatieve adhesie en niet-specifieke binding van het antilichaam. Details van dia voorbereiding alternatieven worden hieronder in stappen 1A-1C in volgorde van toenemende hechting en complexiteit gegeven. Slides van deze verschillende werkwijzen kunnen samen worden gebruikt voor een experiment.

1A. Geen glijbaan voorbereiding

In de handel verkrijgbare polylysine gecoate glaasjes bieden lage wrijvingscoëfficiënt en lage achtergrond.

1B. Slide preparation optimaal voor methanol-aceton fixatie

Medium hechting en lage achtergrond.

1. Bereid een polylysine oplossing dompelen van de dia: Voeg 400 mg zeer hoog molecuulgewicht (150.000 - 300.000 D) poly-L-lysine tot 200 ml dubbel gedestilleerd water. Voeg 2 ml 10% natriumazide voorraad (eindconcentratie 0,1%) als conserveermiddel. LET OP: droog natriumazide is reactief en alle vormen zijn giftig. Dragen masker en handschoenen, terwijl een gewicht poeder tot 10% voorraad te maken met tweemaal gedestilleerd water.
2. Veeg enkele einde matglas dia's met niet-pluizende doekjes, het verwijderen van vlekken en deeltjes. Dit moet ook gedaan worden op dia's gekocht met de aanduiding "voorgereinigde."
3. Plaats de glaasjes back-to-back in een houder, Coplin pot of andere dia vlekken container, houden berijpte randen en niet helemaal perfect uitgelijnd (later scheiding gemakkelijker te maken). Plaats slice houder bekerglas met 70% ethanol (reagenskwaliteit alcohol niet noodzakelijk) met 1% HCl in diverstilde water of vul vlekken potje om niveau van glazuur. Rock dia in oplossing gedurende ten minste 5 minuten. LET OP: Deze oplossing is bijtend, draag handschoenen. OPMERKING: Deze oplossing kan meerdere keren worden hergebruikt (tot enkele maanden).
4. Spoel dia's in running gedestilleerd water gedurende 1 minuut.
5. Droge dia volledig in een stofvrije omgeving ofwel door het plaatsen in een 40-60 ° C oven gedurende 30-60 minuten of door hem overnacht bij kamertemperatuur.
6. Incubeer dia's in polylysine oplossing (die unfrosted delen) op rocker gedurende 15 minuten.
7. Herhaal het drogen van dia's.
8. Herhaal polylysine oplossing incubatie en droogstappen.
9. Scheid de dia's met behulp van een slanke metalen voorwerp, zoals een dunne wegen spatel. Als ze goed worden nageleefd, zijn ze moeilijk te scheiden. Draag geschikte veiligheidsuitrusting (veiligheidsbril) en werken op de bank boven papier (na gebruik worden weggegooid), aangezien kleine stukjes glas kunnen vliegen los wanneer dia's worden gescheiden.
10. Store dia's in schoon(Stofvrij) dia doos bij 4 ° C totdat het nodig is.

1C. Schuif voorbereiding optimaal voor formaldehyde fixatie

Hoogste hechting maar hoge achtergrond.

1. Plaats de glaasjes bereid met methode 1B flat in een stofvrije, ovenvaste schaal (voor het drogen in de oven) of op een vlakke stofvrije ondergrond (voor de lucht drogen).
2. Plaats een 20-60 ul druppel van de oplossing polylysine midden op elke dia.
3. Droge dia geheel in de oven of bij kamertemperatuur. De polylysine zal achter bleke ovalen laten zoals het verdampt. Deze ovalen zijn zeer lijm. Helaas, ze binden ook aan de primaire en secundaire antilichamen, zelfs na het opspannen.
4. Store slides in schone (stofvrije) dia doos bij 4 ° C totdat het nodig is.

2. Voorbereiding van Frozen Nematoden Slides

Bereid nematoden voor kleuring door het volledig spoelen vrij van bacteriën met behulp van methode 2A (voor borden van nematoden) of2B (voor individuele nematoden).

2A. Voorbereiding van dia's uit platen van nematoden

1. Plaats een plat stuk metaal op droog ijs naar prechill.
2. Gebruik gedestilleerd water en een glazen pipet (vermindert verlies van wormen) of micropipet om wormen van NGM plaat met bacteriën te spoelen in een 1,5 ml microfugebuis. Platen kunnen worden gesynchroniseerd of gemengd leeftijden, doe platen niet met veel dauers (moeilijk te kraken) of uitgehongerd wormen (verhoogde autofluorescence), tenzij noodzakelijk.
3. Spoel de wormen 3-4x met gedestilleerd water tot vrij van bacteriën. (Om verlies van wormen verlagen gebruiken dezelfde glazen pipet.) Om wormen pellet, ofwel laat ze op de bank zitten voor 3-5 minuten (om vooral volwassenen te verzamelen aan de onderkant van de buis) of spin 30 sec bij ~ 1000 rpm (~ 500 g) in een tafelblad centrifuge (voor volwassenen, larven en embryo verzamelen).
4. Verwijder het meeste water uit buis met wormen, waardoor ongeveer tweemaal de hoeveelheid water wormen (maar tenminste 25 ui totaal volume).
5. Hebben een gelijk aantal vaste (schoongeveegd maar niet polylysine behandeld) "top" dia's beschikbaar.
6. Plaats ~ 25 ul wormen in water op de "bodem" hechtend glijden en verspreiden de vloeistof die de wormen over het centrale gedeelte van de schuif met de zijkant van pipetpunt.
7. Laat de wormen af ​​te wikkelen gedurende 30 seconden tot 2 minuten. Als de schuif geschikt kleverig, de uiteinden van de wormen houden zij contact met de dia.
8. Houd de onderkant dia in de ene hand en plaats de bovenste dia over de bodem glijden zodat alle, maar de bevroren delen elkaar overlappen. De vloeistof moet de dia's iets uit elkaar te houden, zodat de wormen iets bewegen nog steeds Laat de dia's glijden over elkaar -. Dit verdraait de wormen.
9. Druk voorzichtig recht naar beneden slicht op de bovenste dia, met behulp van de duimen en wijsvingers van elke hand. Met het ideale hoeveelheid druk, zal een paar van de grootste hermafrodieten aan de rand van de dia scheuren, terwijl de meeste volwassenen en larven contact met elkaar dia maar intact blijven.
10. Onmiddellijk en zorgvuldig (zonder slippen) zet de dia's op het stuk metaal op droog ijs. De dia's moeten lijken bevroren binnen een minuut. Blijf op droog ijs gedurende 5 minuten totdat het helemaal bevroren.
11. Op dit punt kan dia in gelabelde vakken bij -80 ° C worden bewaard gedurende enkele dagen. (Als ze worden bewaard weken bij -80 ° C, zal het water begint weg te sublimeren en de wormen zullen niet zo goed vlekken). Als dia's worden bewaard bij -80 ° C, laat ze 'opwarmen' op droog ijs gedurende 10 minuten vóór kraken.
12. Ga naar stap 3 (fixatie).

2B. Voorbereiding van de dia's van de individuele nematoden

1. Plaats een plat stuk metaal op droog ijs naar voorgheuvel.
2. Gebruik een worm pick individuele nematoden dragen aan een druppel water op een NGM plaat om ze te bevrijden van bacteriën. Nematoden (s) moet goed gevoed aan autofluorescentie afnemen, indien mogelijk. Herhaal transfer naar nieuwe plekjes van water als nodig tot worm (s) zijn vrij van bacteriën.
3. Label matte kant van de "onderkant" polylysine dia's met onuitwisbare inkt en plaats dia's op teller naast de container met droog ijs, het label naar boven. Hebben een gelijk aantal minder adherent "top" (onbehandeld) slides beschikbaar.
4. Plaats een 5-10 ul druppel water op het gebied van de onderste schuif dubbel-behandeld met polylysine. Gebruik het grotere volume als de overdracht van meer wormen, te voorkomen dat het water verdampt voordat deze is voltooid.
5. Breng de worm (s) om de daling van water met de worm oogst, met behulp van de microscoop om te kijken als de wormen zinken om de kleverige dia oppervlak aanraakt. Breng zo weinig als een worm tot wel 20 + wormen per druppel.
6. Houd de onderkant slide in de ene hand en plaats de bovenste dia over de bodem glijden zodat alle, maar de bevroren delen elkaar overlappen.
7. Onmiddellijk en zorgvuldig (zonder slippen of comprimeren) de dia's die op de stuk metaal op droog ijs. Blijf op droog ijs gedurende 5-30 minuten. (Niet deze dia's op te slaan op lange termijn, als de dia's gemakkelijk uitdrogen.)
8. Ga naar stap 3 (fixatie).

3. Bevestiging

Fixatieven zijn nodig om 'fix' het antigeen op zijn plaats in de cel, door ofwel precipitatie ("lichte fixatie") of cross-linking ("harde fixatie") het antigeen. Fixatie kan antigeniciteit verstoren; meest bekende antilichamen werken het beste met een bepaalde fixatie aandoening. Voor nieuwe antilichamen, moet een reeks fixatie omstandigheden getest.

Voor bevestiging, de eerste stap is fosfaatgebufferde zoutoplossing maken. Volgende fix dia's met nematoden voor antilichaamkleuring volgens methode A (lichtlossen met behulp van methanol en aceton) of B (harder fix met behulp van formaldehyde of glutaaraldehyde).

1. Bereid een steriel 10x PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing) stock-oplossing door het toevoegen van 80 g NaCl, 2,0 g KCl, 27,2 g Na ₂ HPO ₄ • H ₂ 0, 2,4 g KH ₂ PO _4, 20 ml 10% natriumazide voorraad. Om deze stamoplossing te maken, wegen uit natriumazide poeder tot 10% oplossing te maken met tweemaal gedestilleerd water. Roer zoutoplossing met zacht vuur totdat het is opgelost. LET OP: droog natriumazide is reactief en alle vormen zijn giftig. Dragen masker en handschoenen tijdens het werken met droge natrium azide of oplossingen.
2. Laat zoutoplossing cool (Tris pH is temperatuurgevoelig), vervolgens de pH tot 7,2 met 1-10 M NaOH. Top tot 1 L met dubbel gedestilleerd water en autoclaaf te steriliseren. Bewaren bij kamertemperatuur en verdun tot 1x zo nodig met steriel dubbel gedestilleerd water. LET OP: NaOH is bijtend - draag handschoenen tijdens het gebruik.

3A. Licht vast te stellen met behulp van methanol-aceton

1. Put 100% methanol, 100% aceton en 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in kleurbakjes op ijs prechill minstens 10 minuten. LET OP: Methanol en aceton zijn giftig, draag handschoenen.
2. Neem een ​​paar van de onderste en bovenste dia's uit het droogijs, snel draai ze uit elkaar, en onmiddellijk dompel de "onderkant" slide in ijskoud methanol gedurende 2 minuten. De "top" slide worden weggegooid.
3. Overdracht dia uit methanol koude aceton ijs gedurende 4 minuten. Als de dia's had veel wormen, de meeste (90%) zal eraf vallen in de fix, zelfs met de best voorbereide dia's. Als enkele worm dia's goed waren voorbereid, moet de wormen blijven aangehouden.
4. Plaats of dompel de dia's in de pot met PBS (af te spoelen fixatief) en ga verder met stap 4 (vlekken).

3B. Hard fix formaldehyde of glutaaraldehyde

1. Verdun reagenskwaliteit formaldehyde of glutaaraldehyde oplossing 1x PBS tot 0,5-4% eindconcentratie. Aliquots (1,5 ml) may opgeslagen stevig afgedicht bij -20 tot -30 ° C, ontdooien monsters op ijs net voor gebruik. OPMERKING: formaldehyde oplossingen verloop van tijd en blootstelling aan de lucht. LET OP: formaldehyde en glutaaraldehyde zijn giftig, draag handschoenen en werken in de kap.
2. Neem een ​​paar van de onderste en bovenste dia's uit het droogijs, snel draai ze uit elkaar, en onmiddellijk het "bottom" slide met wormen in de platte schaal met deksel. (De bovenste dia kan worden weggegooid).
3. Onmiddellijk Pipetteer 200 ul toxische fixatief boven het midden van het gebied van de dia met wormen. De fixerende zal gedeeltelijk bevriezen in plaats, dan smelten tot een groter gebied van de dia te dekken.
4. Als de wormen zijn niet volledig bedekt met fixatief, onmiddellijk en voorzichtig meer fixatief met behulp van een micropipet. Sta niet toe dat fixatief te stromen over de rand van de dia.
5. Bedek de schaal met een deksel en laat gedurende 10 minuten tot overnacht bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de schotel wordt bevochtigd indien langer incubaties are gebruikt - dit kan worden gedaan door het toevoegen van gevouwen natte-pluizende doekjes aan het gerecht. Laat de doekjes de dia's te raken.
6. Na fixatie is voltooid, voorzichtig pipet het fixeermiddel met losse wormen in een 1,5 ml buis en dompel de dia in een kleuring pot met PBS.
7. Draai de buis met wormen die los op hoge snelheid kwam gedurende 30 sec tot pellet. Spoel de wormen tweemaal met PBS, dan verwerken parallel aan de wormen op de glijbaan (van stap in microfuge buizen, niet op dia).
8. Ga verder met stap 4 (vlekken).

4. Antilichaam kleuring

Het antilichaam kleuring protocol is vergelijkbaar met standaardprotocollen voor elk weefsel op dia. Dit protocol is hetzelfde voor alle dia ongeacht de bereiding in stap 1-3.

1. Bereid antilichaambuffer door mengen van 700 ml dubbel gedestilleerd water, 100 ml 10 x PBS, 5 ml Triton X-100 (0,5% eind), 2 ml 0,5 M EDTA pH 8 (1 mM eind), 1 g BSA (0,1% eind), 5 ml 10% natrium azide-oplossing (0,05% definitief). pH op 7,2 met HCl, voeg vervolgens dubbel gedestilleerd water tot 1 liter, bewaar bij 4 ° C.
2. Bereid Block door aanmaken ezel serum met dubbel gedestilleerd water, dan is het toevoegen van 5 ml serum tot 45 ml antilichaam buffer (laatste 10% serum).
3. Bereid primaire en secundaire antilichaam Solutions door verdunning van antilichaam in antilichaam buffer plus 1% BSA. Aanbevolen verdunningen zijn 1:50-1:2,000 voor primaire antilichamen en 1:1,000-1:5,000 voor secundaire antilichamen (Cy3or OG488 geconjugeerde ezel antilichamen tegen species gebruikt om primaire antilichaam te verhogen).
4. Bereid DAPI voorraad door het mengen van 2,5 mg / ml in dubbel gedestilleerd water; winkel in 8 ul porties ingevroren bij -30 ° C. LET OP: DAPI is een giftige DNA-bindende kleurstof, draag handschoenen bij het wegen en doseren in porties.
5. Bereid 10 ml Mounting Medium door het mengen van 200 mg n-propylgallaat, 0,3 ml 1 M Tris pH 9, 2,7 ml dubbel gedestilleerd water in een 15 ml conische buis. Verhit bij 65 ° C gedurende ongeveer 10 minuten totdat het is opgelost.7 ml glycerol en een 8 pi aliquot van DAPI en vortex goed. Aliquot medium in 1,5 ml buizen, wikkel in folie en bewaar in het donker bij 4 ° C (zowel lucht en licht degraderen de middellange - als het wordt meer geel, gooi in Biohazard afval). LET OP: n-propylgallaat is een reactieve anti-oxidant, draag handschoenen bij het wegen.
6. Overdracht dia een kleuring pot met Blok 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C (gedurende de nacht voorkeur voor harde fix). Vermijd het schudden aan het verliezen wormen voorkomen.
7. Transfer glijdt naar pot met primair antilichaam of plaats dia's flat in een bevochtigde schotel en top elk met 100-500 ul primair antilichaam kleuring. Incubeer dia's overnacht bij 4 ° C zonder schudden.
8. Na het primaire antilichaam incubatie, overdracht glijdt naar pot PBS kleuring.
9. Filter Block via trechter filtreerpapierbekleding en bewaar bij 4 ° C, als steriel gefiltreerd elke 1-2 weken, kan Block opnieuw worden gebruikt voor 1 of meerdere maanden. Evenzo, filteren en op te slaanprimaire antilichaam bij 4 ° C voor hergebruik (tot 10 of meer ronden van kleuring).
10. Rinse schuift drie keer (~ 20 min elk) in antilichaam buffer.
11. Plaats objectglaasjes secundair antilichaam in een lichtdichte houder kleuring en incubeer 4 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.
12. Transfer glijdt naar pot PBS kleuring. Filter en bewaar secundair antilichaam bij 4 ° C voor hergebruik (tot 10 of meer ronden van kleuring).
13. Rinse schuift drie keer (~ 20 min elk) in antilichaam buffer.
14. Transfer schuift aan PBS en laat in PBS (minuten tot overnacht bij 4 ° C) tot klaar om te monteren.
15. Werk snel op afzonderlijke dia's, zodat de wormen aan de voorzijde van dia nat blijven. Verwijder een dia uit de PBS, droog weer van de dia met een pluisvrije doek, en leg ze op keukenpapier.
16. Plaats ~ 20 pi fixeermiddel dan wormen zodat er ongeveer gelijke delen medium en PBS op dia tilt Schuif de twee oplossingen te mengen. CautION: Mounting medium is giftig.
17. Tilt slide dus matrand lager en oplossing verzamelt buurt glazuur, plaats dan een rand van 24 x 60 mm dekglaasje on oplossing.
18. Sluit voorzichtig het dekglaasje om luchtbellen (die bleken te verhogen en verstoren bezoeker) te minimaliseren. Wanneer u zeepbellen, til de rand van het dekglaasje langzaam, relower het dan zonder het schuiven van de dekglaasje over de wormen.
19. Droog voorzichtig de rand van de dia zonder het verplaatsen van het dekglaasje, door het comprimeren van de randen met een niet-pluizende doek. De relatief droge rand van de glijbaan moet zichtbaar zijn rondom de rand van het dekglaasje
20. Dicht de dekglaasje met 2-3 lagen nagellak. Dia's kunnen in een vlakke dia houder worden geplaatst tijdens de bereiding en de opslag te beschermen tegen licht. Zodra slide goed afgesloten en droog, reinig het dekglaasje en achterkant van de glijbaan.
21. Goed afgesloten dia's in het donker dagen houdbaar bij 4 ° C of weken bij -20 ° C. Over langere perioden, DAPI staining van DNA en de meeste groene kleurstoffen (bijv. 488 nm excitatie) vervagen. Verzegelt het dekglaasje met meer nagellak als nodig is, bijvoorbeeld na het gebruik van olie-immersie lens.

Representative Results

Wanneer wormen behoren worden gecomprimeerd, gebarsten, en licht vast kan vrijwel de gehele worm toegankelijk antilichaam kleuring (zie figuur 2). De locatie van de kernen zoals aangegeven door DAPI kleuring geeft aan welke delen van de worm intact Wanneer de wormen worden onderworpen aan een hardere fixeermiddel, zoals formaldehyde, kan de morfologie van de worm vervormen (zoals gezien door de onnatuurlijke golvende uiterlijk van de spieren in figuren 3A-D). Een ander veel voorkomend probleem ongelijk fixatie of penetratie van bepaalde weefsels. Een voorbeeld hiervan is weergegeven in figuren 3E-H, waarbij de spier gekleurd slechts een gedeelte van de worm, ondanks het feit dat de aanwezigheid van andere vlekken, waaronder DNA kleuring geeft aan dat ten minste een deel van het lichaam aanwezig was ( dat wil zeggen, niet verwijderd tijdens vries-kraken). Het resulterende patroon van gedeeltelijke kleuring kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd met de praktijk, zodat de hele DISTRIBUTIop van kleuring kan worden vastgesteld, zelfs als een enkele worm toont ongelijke kleuring.

Problemen die zich met gevries kraken met elke fixatie toestand wordt geïllustreerd in het definitieve cijfer (figuur 4). De meest voorkomende probleem verdraait van het monster door relatieve beweging van de beide schuiven tijdens compressie. Het feit dat het lichaam van de worm gedraaid juist achter de keelholte kan worden gezien door de morfologie van de gekleurde weefsels. Deze afbeelding toont ook het probleem achtergrondkleuring vanwege antilichaam vasthouden aan de polylysine coating de dia. Merk echter op dat elk van deze beelden werden verzameld met behulp van dia tijdens het eerste antilichaam kleuring pogingen studenten in celbiologie practicum. Zelfs met de praktijk zullen veel individuele wormen problemen gezien in figuur 4 tonen. Echter, op een bepaalde dia, wormen zoals die blijkt uit de figuren 2 en 3 kan worden stichtingend en onderzocht.

Figuur 1. Overzicht van procedures. Stroomdiagram aangeeft stappen om de volledige bevriezing kraken procedure uit te voeren. Alternatieven voor uiteenlopende fixatie voorwaarden en aantallen wormen worden aangegeven.

Figuur 2. Licht vast, goed gekleurd wormen hoofden van twee vaste met methanol-aceton en gelabeld met meerdere antilichamen en kleurstoffen volwassen hermafrodieten:. A) Primaire antilichaam om te chatten (cholineacetyltransferase) en Cy3-geconjugeerd secundair antilichaam, B) DAPI (blauw DNA) , C) Ertsgon Green 488-anti-GFP (green fluorescent protein), D) toont de overlay (met twee cholinerge markers, Cy3-anti-chat en Cy5-anti-Vacht (vesiculaire acetylcholine transporter) weergegeven als rood). Deze transgene stam (PS4657) drukt een vertaling fusie tussen GFP en AJM-1, gevonden op keelholte apicale kruispunten. De beelden zijn maximale projecties van reeks confocale beelden; schaal bar is 50 micrometer.

Figuur 3. Formaldehyde bijbehorende vervormingen. Formaldehyde vaste volwassenen gekleurd met Cy3-phalloidin (bindt filamenteuze actine), DAPI (blauw DNA), en Oregon Green 488-anti-GFP. AD) Fours beelden van het lichaam juist achter de vulva (uiterst links) in dezelfde nematode, die een onnatuurlijk golvende morfologie als gevolg van vervorming inceerd door fixatie. A) Rood-phalloidin toont licht onregelmatige spiermorfologie. B) Kernen (blauw) worden gelijkelijk over de worm. C) Groen toont de verdeling van een CED-1 :: GFP fusie-eiwit in de plasmamembraan van de gonadale mantel cel, gedreven door de lim-7 promotor (stam MD701). D) Toont de overlay van deze drie kleurstoffen. EH) Labeling kan variëren met verschillende kleurstoffen op dezelfde nematode. E) Phalloidin (rood) etiketten slechts een deel van de spieren aan een zijde van de worm. F) Kernen (blauw) gedurende de worm aanwezig (hoewel gekleurd met ongelijke intensiteit). G) De OG488-anti-GFP labels collageen-19 :: GFP in de cuticula aan een zijde van de worm die kleuring van de meer centrale spierweefsel ontbreekt, wat aangeeft dat de spier aanwezig is maar niet vlekken op een oppervlak. H) Toont de overlay van de drie kleurstoffen. De beelden zijn maxiMAL projecties van reeks confocale beelden; schaal bars zijn 50 micrometer.

Figuur 4. -Compressie dat vervormingen. Formaldehyde vaste larve gekleurd met A) Cy3-phalloidin (bindt filamenteuze actine), B) DAPI (blauw DNA), C) Oregon-Groen 488-anti-GFP, D) overlay. De twist in het lichaam juist achter de keelholte blijkt, als de groene uitscheidingsstelsel cel en buikzenuwkoord kruis over de rest van het lichaam. Hoge achtergrond kleuring is ook duidelijk met Cy3-phallodin. Deze stam drukt een VHA-8 :: GFP-fusie-eiwit, voornamelijk gelegen in de excretory cel. De beelden zijn maximale projecties van reeks confocale beelden die uitgebreid tot het oppervlak van de schuif (leidend tot hoge achtergrondkleuring), schaal bar is 50 urn.

Discussion

De gevries kraken protocol is een van de manieren voor antilichaamkleuring in C. elegans. Het biedt een relatief eenvoudige manier om wormen te kleuren, maar vereist specifieke reagentia en de praktijk voor een optimaal resultaat. Kritische stappen (geschetst in figuur 1) zijn: 1) de voorbereiding glijbaan (zie stap 1 en 2) manuele compressie van de nematoden (zie stap 2 en 3) snelle fixatie (zie stap 3). Ten eerste, om de hechting van de nematoden op de dia maximaliseren, is het het beste om dia bereiden met hoog molecuulgewicht (lange polymeerketens) polylysine, in plaats van te vertrouwen op commercieel bereide objectglaasjes. Commerciële dia's worden gecoat met polylysine om cellen te houden, terwijl de-vries kraken dia's zijn ontworpen om zich aan de cuticula van de gehele nematoden. Voorts heeft de procedure voor de juiste compressie van de wormen tussen de dia vóór het invriezen kritisch. Het vereist een vaste hand en praktijk om de dia's samen te drukken met behulp van de juiste hoeveelheiddruk zodat afzonderlijke wormen contact beide dia's zonder het vernietigen van hun morfologie. Ofwel te veel of te weinig compressie leidt tot een toegenomen verlies van wormen tijdens fixatie. Verder zorg is nodig om de dia verplaatsen naar het droogijs gekoelde oppervlak bevriezen zonder dat de dia opzichte van elkaar. Een dergelijke beweging zal de wormen te scheuren of verdraaien. Ten derde, als bij elke fixatie techniek, de bevroren wormen moeten worden direct in fixatief voor het ontdooien geplaatst. Anders kan het antigeen te verspreiden, het verstrekken van misleidende informatie over subcellulaire lokalisatie. Als deze kritische stappen zijn allemaal goed gedaan, voor de beste resultaten is het nog steeds noodzakelijk om verschillende gekleurde coupes scannen naar wormen met de beste morfologie vinden.

Een onvermijdelijk aspect van deze techniek is dat de wormen worden gecomprimeerd in een dimensie. De compressie is vooral merkbaar bij volwassenen, waarbij de schijnbare diameter van de ronde lichaam in de z-as slechts 1-4 kanth die bij de x-en y-assen. Deze compressie neiging te dalen in kleinere larven en kunnen verwaarlozen in embryo. Door de manier waarop de vrijlevende aaltjes bewegen tijdens voorbereiding glijbaan, de gebrandschilderde wormen zijn vaak op hun kant. Dit bootst de oriëntatie van wormen op agar gerechten, met de laterale middellijn liggen uitbreiding in het midden van de gebrandschilderde worm (zie figuren 2-4). Aldus, de compressie algemeen in de laterale dimensie. Terwijl dit wel doet norm fluorescentiemicroscopie eenvoudiger (meer van het monster tegelijkertijd scherp), betekent dit dat 3-D reconstructies niet accuraat is.

Zoals bij elk antilichaam kleuring, is het belangrijk om de specificiteit van binding controleren. Bij de meeste soorten, dit wordt gedaan door controles, zoals affiniteit uitputten uw antilichaam of gebruiken, wordt geen primaire. In C. elegans, meer specifieke middelen voor de controle op de specificiteit zijn vaak beschikbaar. Null mutanten voor de gen-en eiwit van belang te verleneneen uitstekende controle voor kleuring specificiteit. Beide stammen moeten onder identieke omstandigheden worden vastgesteld voor de vergelijking, omdat kleuring meestal fixatie afhankelijk. Indien geen null-mutant beschikbaar is, dan is het in C. relatief eenvoudig elegans om eiwit te verlagen met RNAi (RNA inhibitie ¹²⁾ en kijk voor verminderde kleuring in RNAi behandeld wormen.

Polyklonale antilichamen vertonen vaak niet-specifieke kleuring, zelfs als affiniteit-gezuiverd met het antigeen. Vaak licht fixatie met behulp van methanol en aceton (welke eiwitten op te lossen door het neerslaan van hen in plaats van verknoping hen) geeft lagere niet-specifieke kleuring dan formaldehyde of glutaaraldehyde (waarvan meer variant epitopen te wijten aan uiteenlopende verknoping genereren) ^1,11. In C. elegans niet-specifieke kleuring is heel gebruikelijk onder alle fixatie voorwaarde, met name in de darm. Als antigeen wordt uitgedrukt in de darm, dan is deze niet-specifieke kleuring kan bepaalde staini maskerng. Als null mutanten zijn beschikbaar voor eiwit vervolgens met deze methode vastgesteld wormen kunnen worden gebruikt om de affiniteit afbrekende serum. Sinds antigeniciteit hangt af van fixatie voorwaarden, moet de wormen die u gebruikt om uw antilichaam afbrekende worden bereid op dezelfde manier als de wild-type wormen je kleuring. Na een ronde van uitputting van niet-specifieke kleuring, mutant en wildtype wormen kunnen worden gekleurd parallel met de uitgeputte serum voor een uitstekende controle. Aanvullende ronde depletie met mutanten kan zoals nodig.

Deze techniek is zeer nuttig voor het testen van nieuwe antilichamen voor specifieke kleuring onder verschillende omstandigheden. Deze kunnen antilichamen gegenereerd tegen C. elegans eiwitten of antilichamen gegenereerd tegen geconserveerde eiwitten van andere species. Hoewel deze methode de beste morfologie met licht vaste nematoden, is het relatief eenvoudig om een ​​reeks fixatieven waaraan voorwaarden vast proberen eventueel moeten bijzondere resultaats. In tegenstelling tot andere methoden voor het harde fixatie met behulp van formaldehyde of glutaaraldehyde, enzymatische of verlagende behandelingen zijn niet nodig voor de monstervoorbereiding. Omdat deze behandelingen antigeniciteit afnemen, dit vergroot de mogelijkheid om specifieke antilichamen en hun optimale fixatie voorwaarden aangeeft. Als de harde fixatie omstandigheden het beste werken, kan de onderzoeker vervolgens aan de manieren uitgevoerd op intacte wormen beter morfologie (samengevat in onze eerdere werk ⁴⁾ te verkrijgen. Als lichte fixatie behouden antigeniciteit, dan is deze techniek kan worden gebruikt voor alle verdere kleuring voor lichtmicroscopie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
poly-L-lysine slide (ESCO brand)	Fisher	12-545-78	Sigma brand slides also suitable
poly-L-lysine hydrobromide	Sigma	P1524	IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical
single frosted edge slides	Fisher	48312-002	Other brands are suitable
sodium azide	Sigma	S2002-25G	TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution
coplin staining jar	VWR	47751-792	Other brands are suitable
5-slide mailer	Electron Microscopy Science	71549-01	One of many different brands of small slide holder, suitable for staining
Paraformaldehyde	VWR	MK262159	IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Glutaraldehyde solution, 25% in water	Sigma	G 5882	IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Triton X-100	VWR	EM-9410	Other brands are suitable
Bovine Serum Albumin	Fisher	ICN820451	Other brands are suitable
Donkey Serum, lyophilized	Jackson Immunoresearch	017-000-121	Other brands are suitable
Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling	Jackson Immunoresearch	715-165-150	This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody).
n-propyl gallate	Fisher	ICN10274750	Other brands are suitable
DAPI, 4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	Sigma	D 9542	TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
Whatman #1 15 cm diameter filters	Fisher	09805G
Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm	VWR	48393-252	#1 1/2 thickness is optically best
Microscope slide folder	VWR	48429-092	Other brands are suitable