נוגדן מכתים ב Published: October 14, 2013 doi: 10.3791/50664

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Janet S. Duerr¹

¹Department of Biological Sciences, Ohio University

Summary

"פיצוח להקפיא", שיטה לחשיפת הרקמות הפנימיות של ג נמטודות elegans לנוגדנים ללוקליזציה חלבון, בא לידי ביטוי.

Abstract

כדי להכתים ג elegans עם נוגדנים, הציפורן יחסית בלתי חדירה חייבת לעקוף בשיטות כימיות או מכאניות. "להקפיא-פיצוח" הוא אחת שיטות המשמשות למשוך פיזי לציפורן מנמטודות ידי דחיסת נמטודות בין שתי שקופיות חסיד, להקפיא אותם, ומושך את השקופיות לגזרים. הקפאת פיצוח מספק דרך פשוטה ומהירה כדי לקבל גישה לרקמות ללא טיפול כימי והוא יכול לשמש במגוון רחב של fixatives. עם זאת, זה מוביל לאובדן רבים של הדגימות והדחיסה הנדרשות מכאנית מעוות את המדגם. בפועל נדרש על מנת למקסם את ההתאוששות של דגימות עם מורפולוגיה טובה. הקפאת פיצוח יכול להיות מותאם לתנאים ספציפיים קיבוע, התאוששות של דגימות, או כתמים שאינם ספציפיים נמוכים, אך לא לכל הפרמטרים ובעונה אחת. לנוגדנים שדורשים תנאי קיבעון קשים מאוד ולסבול את הטיפולים הכימיים הדרושים כדי permeabilize הציפורן כימי, treatment של נמטודות השלמה בפתרון עשוי להיות מועדף. אם הנוגדן דורש תיקון קל או אם תנאי הקיבעון האופטימליים אינם ידועים, בהקפאה פיצוח מספק דרך שימושית מאוד לassay במהירות נוגדנים ויכול להניב מידע לוקליזציה subcellular והסלולרי ספציפי לאנטיגן של עניין.

Introduction

כדי לקבוע את הלוקליזציה הסלולר וsubcellular של חלבונים, מדענים שכותרתו מסורתי רקמות עם נוגדנים שנבחרו להכיר באופן ספציפי חלבונים מסוימים ^1. בחלק מאורגניזמים מודל כגון ג elegans, מכתים נוגדן הוחלף לעתים קרובות על ידי טכניקות גנטיות מולקולריות, אשר יניבו תוצאות במהירות רבות יותר. אלה כוללים אורגניזמים הפיכה עם מבנים בהיקף של התכה גנים בין האמרגן ואזורי קידוד של הגן של עניין וחלבון פלואורסצנטי ירוק. עם זאת, טכניקות מולקולריות כפופות למספר החפצים, ובם בעיות עם ידיעת האמרגן ושינויים בביטוי של מבנים במספר גבוה עותק (טכניקות הרגילות ב C. elegans) ^2,3 האמיתיים. לכן, צביעה עם נוגדנים נשארת מטרה של מדענים רבים בחקר תפקוד חלבון in vivo.

מכתים את הרקמות עם נוגדנים יכולים להיות קשה, שכןtibodies רק יכול לזהות אנטיגן בקונפורמציה מסוימת ^1. לדוגמא, נוגדנים יכולים לזהות רק אנטיגן מפוגל או בשלמותה הקבוע בדרך מסוימת ואולי לא מזהים את האנטיגן באתרם. הבעיה של מכתים נוגדן בנמטודות מחריפה בשל העובדה שהציפורן של נמטודות יוצרת מחסום בלתי חדיר יחסית, החוסם את הגישה של נוגדנים לרקמות.

ישנן מספר שיטות שונות המשמשות למכתים נוגדן בג elegans (שנסקר בעבודה הקודמת שלנו ^4). כדי להכתים שלמים 'תולעים', שיטות פותחו כדי להקפיא ולהפשיר במקבע קשה יחסית (פורמלדהיד או glutaraldehyde); להקפיא להפשיר מחזורים לעזור לפצח את הציפורן כדי לאפשר חדירה מהירה של המקבע ^5. לאחר קיבוע, הציפורן הייתה permeabilized כדי לאפשר חדירה של הנוגדן; שיטות כללו טיפול עם צמצום סוכנים, collagenase, או שניהם ^5-7. לא אלהreatments השתמר מורפולוגיה, אך לעתים קרובות מופחת או נהרס הכרת נוגדן. שיטות אלטרנטיביים כוללות לנתיחה ⁸ כדי לאפשר חדירת נוגדן.

"להקפיא-פיצוח" הוא אחת דרכים כדי לקבל גישה לחלק הפנימי של התולעת חצי השלמה כדי לאפשר נוגדן מכתים ^9-10. הקפאת פיצוח יכול להתבצע עם מגוון רחב של תנאי קיבעון תוך הימנעות טיפולי collagenase וצמצום. נמטודות ממוקמות בין שתי שקופיות דבקים, קפואות, ולאחר מכן השקופיות מופרדות, ומשאירות את רוב נמטודות בשקופית התחתונה וחלק גדול מציפורן בשקופית העליונה. השקופית התחתונה יכולה להיות ממוקמת במקבעת וכל השקופית עם נמטודות דבקה מועברת בהליך מכתים נוגדן. השיטה עושה שני קשיים עיקריים כיום. ראשית, קשה להחיל את הסכום הנכון של לחץ דרוש כדי לפצל את נמטודות בלי לעוות אותם ברצינות. שנית, רבים של התולעים לא יהיה שלסמן לאו שקופיות, ויאבד במקבע או שטיפות. עם זאת, עם השקופיות ותרגול הנכונים, השיטה תהיה במהירות להניב נמטודות עם מורפולוגיה סבירה שבו ניתן להשתמש במגוון רחב של fixatives ונוגדנים.

השיטה עשויה להיות מגוונת במקצת, בהתאם למטרה של הנסיין. אם הכתמה של נמטודות אחת היא רצויה (למשל כדי לקבוע אם transformant אחת שינה מכתים נוגדן), ואז מחליק עם הידבקות מקסימלי (אבל מכתים רקע גבוה יותר) יכול לשמש, כמו שקופיות שהוכנה במעבדה עם polylysine נוסף (ראה בהמשך). לפורמלדהיד או קיבעון glutaraldehyde, יש להשתמש בשקופיות הידבקות גבוהות יותר (שקופיות polylysine הכנה מעבדה), שכן נמטודות לדבוק יותר גרועה לpolylysine לאחר הקיבעונות האלה. אם נמטודות פראית מהסוג שמתבצעת קבועה עם מתנול ו / או אצטון, ולאחר מכן שקופיות עם הידבקות נמוכה יותר ויש להשתמש בי מכתים רקע נמוך יותר (מסחרי או laboratory הכנה שקופיות). אם מגוון רחב של נוגדנים וfixatives נמצאים בשימוש במעבדה, מבחר השקופיות עשוי להיות מוכן מבעוד מועד ומאוחסן עד צורך.

לאחר הגישה לרקמות נמטודות כבר צברה, נהלי מכתים הנוגדן פעלו בשיטות סטנדרטיות (עם incubations יותר אופייני לרקמות ולא תאים ^1,11).

Protocol

הערה: צעדי פרוטוקול מרובים מוצגים עם אפשרויות להקמה והכנה בהתאם לתנאים הספציפיים של הניסוי. במקרים כאלה, צעדים אלטרנטיביים מוצגים כA, B, C, וכו 'הפרוטוקול בצעדים חלופיים מתואר באיור 1.

1. הכנת שקופיות polylysine מצופה

שלושה סוגים שונים של שקופיות יכולים לשמש, בהתאם לפשרה הרצויה בין קלות הכנה, הדבקה יחסית, והמחייב הלא ספציפית של הנוגדן. פרטים של חלופות הכנת שקופיות הם כדלקמן בצעדים 1A-1C על מנת להגדיל את ההידבקות ומורכבות. שקופיות שהוכנו על ידי שיטות השונות אלה יכולים לשמש יחד עבור ניסוי בודד.

1 א. הכנה לא שקופיות

שקופיות polylysine מצופים זמינות מסחרי לספק הידבקות נמוכה ורקע נמוך.

1 ב. יחסי ציבור שקופיותאופטימלי eparation לקיבעון מתנול אצטון

הידבקות בינונית ורקע נמוך.

1. הכן פתרון polylysine עבור טבילת השקופיות: הוסף 400 מ"ג של משקל מולקולרי גבוה מאוד (150,000 - 300,000 ד ') פולי-L-ליזין ל200 מיליליטר כפול מים מזוקקים. הוסף 2 מיליליטר 10% מניית אזיד הנתרן (ריכוז סופי 0.1%) כחומר משמר. זהירות: יבשה אזיד הנתרן הוא תגובתי וכל הצורות הן רעילות. ללבוש מסכה וכפפות ואילו אבקה במשקל כדי להפוך את מניית 10% במים מזוקקים פעמיים.
2. נגב שקופיות זכוכית חלבית סוף אחת עם מגבונים ללא סיבים, כתמי הסרת וחלקיקים. זה צריך להיעשות גם בשקופיות שנרכשו עם הייעוד "precleaned".
3. מקום מחליק גב אל גב בהחזיק שקופיות, צנצנת coplin או מיכל מכתים שקופיות אחרים, שמירה על קצוות חלבית ולא מיושר באופן מושלם למדי (לעשות הפרדה מאוחר יותר קלה יותר). הנח בעל פרוסה בכוס עם 70% אתנול (אלכוהול כיתה מגיב אין צורך) עם 1% HCl בdiנדם מים או למלא צנצנת מכתים לרמה של זיגוג. רוק שקופיות בפתרון למינימום של 5 דקות. זהירות: פתרון זה הוא מאכל, ללבוש כפפות. הערה: פתרון זה ניתן לעשות שימוש חוזר מספר פעמים (עד מספר חודשים).
4. יש לשטוף את השקופיות במים זורמים מזוקקים דקות 1.
5. מגלשות יבשים לחלוטין בסביבה נטולה אבק או על ידי הצבת בתנור C ° 40-60 ל30-60 דקות או על ידי שמירת הלילה בטמפרטורת חדר.
6. דגירה שקופיות בפתרון polylysine (כיסוי חלקי unfrosted) על נדנדה במשך 15 דקות.
7. חזור על ייבוש של שקופיות.
8. חזור על דגירה פתרון polylysine וצעדי ייבוש.
9. הפרד את השקופיות באמצעות חפץ מתכתי דק כגון מרית במשקל רזה. אם הם דבקו כראוי, הם קשים להפריד. ללבוש ציוד מתאים בטיחות (משקפי מגן) ולעבוד על נייר ספסל עליון (להיות מושלך לאחר שימוש), שכן חתיכות קטנות של זכוכית עשויות לטוס רופפות כאשר שקופיות מופרדות.
10. שקופיות חנות בנקיה(ללא אבק) תיבת שקופיות על 4 מעלות צלזיוס עד צורך.

1 ג. הסט אופטימלי הכנה לקיבעון פורמלדהיד

ההידבקות הגבוהה ביותר, אך רקע גבוה.

1. מגלשות מקום מוכנים עם שטוח 1B שיטה ב, מנה נטולת אבק תנור בטוח (לייבוש בתנור) או על משטח נקי מאבק שטוח (לייבוש באוויר).
2. מניחים ירידת 20-60 μl של פתרון polylysine באמצע של כל שקופית.
3. מגלשות יבשים לחלוטין בתנור או בטמפרטורת חדר. Polylysine ישאיר מאחורי אליפסות בהירות כפי שהוא מתאדה. אליפסות אלה הן מאוד דביקות. למרבה הצער, הם גם להיקשר לנוגדנים הראשוניים ומשניים, גם לאחר החסימה.
4. שקופיות חנות בתיבת שקופית נקייה (ללא אבק) על 4 מעלות צלזיוס עד צורך.

2. הכנת קפואה נמטודות השקופיות

הכן נמטודות עבור מכתים ידי שטיפה חופשית לחלוטין של חיידקים באמצעות 2A שיטה (לצלחות של נמטודות) או2B (לנמטודות בודדת).

2A. הכנת שקופיות מצלחות של נמטודות

1. מניחים פיסת המתכת שטוחה על קרח יבש לprechill.
2. השתמש במים מזוקקים וטפטף זכוכית (יורד אובדן של תולעים) או micropipette לשטוף תולעים מצלחת NGM עם חיידקים לתוך צינור microfuge 1.5 מיליליטר. ניתן לסנכרן לוחות או מעורב גילים, לא משתמשים בצלחות עם dauers רבים (קשה לפיצוח) או תולעים רעבים (autofluorescence המוגבר) אלא אם יש צורך.
3. יש לשטוף את התולעים 3-4x עם מים מזוקקים עד ללא חיידקים. (כדי להקטין את האובדן של תולעים להשתמש באותו פיפטה מזכוכית.) לגלולת תולעים, גם לתת להם לשבת על הספסל במשך 3-5 דקות (כדי לאסוף בעיקר מבוגרים בחלק תחתון של צינור) או ספין 30 שניות ב ~ 1,000 סל"ד (~ 500 ז) בצנטריפוגה שולחן (כדי לאסוף מבוגרים, זחל, ועוברים).
4. להסיר את רוב המים מצינור עם תולעים, ומשאיר בערך פעמיים את נפח מים כתולעים (אך נפח כולל לפחות 25 μl).
5. יש מספר שווה של שקופיות רגילות (ניגבו נקיות אך לא טופלו polylysine) "עליונה" זמינות.
6. מקום ~ 25 תולעי μl במים בשקופית חסיד "מלמטה" ולהפיץ את הנוזל המכיל תולעים מעל החלק של השקופית באמצעות הצד של קצה פיפטה המרכזי.
7. בואו התולעים להסתפק 30 שניות עד 2 דקות. אם השקופיות היא כראוי דביקות, הקצוות של התולעים ידבקו כפי שהם ליצור קשר עם השקופיות.
8. החזק את השקופית התחתונה ביד אחת ולמקם את השקופית העליונה מעל השקופית התחתונה, כך שכל אבל החלקים החלבית חופפות. הנוזל צריך לשמור את השקופיות מעט זו מזו, כך שהתולעים עדיין להזיז מעט אל תתנו השקופיות להחליק על אחד אחרת -. זה מסובב את התולעים.
9. לחץ בזהירות כלפי מטה שלבקלילות על השקופית העליונה, באמצעות האגודלים ואצבעות של כל יד. עם הכמות האידיאלית של לחץ, כמה הרמפרודיטים הגדולים ביותר על קצה השקופיות יהיה קרע, בעוד שרוב המבוגרים והזחלים ייצרו קשר עם כל שקופית אבל יישארו על כנן.
10. מייד ובזהירות (ללא החלקה) לשים את השקופיות על חתיכת המתכת על קרח יבש. השקופיות צריכה להיראות קפואות בתוך דקה אחת. שמור על קרח יבש למשך 5 דקות, עד שקפא ביסודיות.
11. בשלב זה, שקופיות ניתן לאחסן בתיבה שכותרתה ב -80 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים. (אם הם נשמרים שבועות ב -80 מעלות צלזיוס, המים יתחילו נשגבים משם והתולעים לא יהיו כתם גם כן). אם שקופיות מאוחסנות ב-80 ° C, תן להם 'להתחמם' על קרח יבש ל10 דקות לפני הפיצוח.
12. המשך לשלב 3 (קיבעון).

2B. הכנת השקופיות של נמטודות בודדת

1. מניחים פיסת המתכת שטוחה על קרח יבש לPreCגבעה.
2. השתמש איסוף תולעת להעביר נמטודות פרט לטיפת מים על צלחת NGM כדי לשחרר אותם מחיידקים. נמטודות (ים) צריכה להיות מוזנת היטב כדי להקטין autofluorescence, אם אפשר. חזור על העברה למקומות חדשים של מים לפי צורך עד שהתולעת (ים) הן ללא חיידקים.
3. תווית צד חלבית של שקופיות polylysine עם מגלשות דיו ומקום בל תימחה על דלפק "התחתונה" ליד מיכל עם קרח יבש, בצד תווית למעלה. יש מספר שווה של "עליון" פחות חסיד שקופיות (ללא טיפול) זמינות.
4. מניחים ירידת μl 5-10 של מים באזור של השקופית התחתית כפול שטופלה עם polylysine. השתמש בנפח הגדול יותר אם העברה יותר תולעים, כדי למנוע מהמים מתאדים לפני ההשלמה.
5. העבר את התולעת (ים) לטיפה של מים עם בחירת התולעת, באמצעות מיקרוסקופ כדי לצפות כתולעים לשקוע לגעת במשטח השקופיות הדביק. העבר כמה כמו אחד תולעת רבות כמו 20 + תולעים לכל טיפה.
6. החזק את ים התחתוןLIDE ביד אחת ולמקם את השקופית העליונה מעל השקופית התחתונה, כך שכל אבל החלקים החלבית חופפים.
7. מייד ובזהירות (מבלי להחליק או דחיסה) לשים את השקופיות על חתיכת המתכת על קרח יבש. שמור על קרח יבש ל5-30 דקות. (אל תאחסן שקופיות אלה לטווח ארוך, כמו השקופיות בקלות להתייבש.)
8. המשך לשלב 3 (קיבעון).

3. קבעון

Fixatives נחוץ כדי "לתקן" את האנטיגן במקום בתא, או על ידי מזרז ("קיבעון אור") או cross-linking ("קיבעון קשה") אנטיגן. קיבעון עלול לשבש antigenicity; נוגדנים הידועים ביותר עבודה הטובה ביותר עם מצב קיבעון מסוים. לנוגדנים חדשים, מגוון של תנאי קיבוע צריך להיבדק.

לכל קיבעון, הצעד הראשון הוא להפוך את פתרון פוספט שנאגרו מלוח. שקופיות תיקון הבאה עם נמטודות עבור מכתים נוגדן בשיטה (אורלתקן באמצעות מתנול ואצטון) או B (תיקון קשה יותר באמצעות פורמלדהיד או glutaraldehyde).

1. הכן פתרון 10x PBS (בופר פוספט) המניה סטרילי ידי הוספת 80 גרם NaCl, 2.0 גרם KCl, 27.2 גרם Na ₂ HPO ₄ • H ₂ 0, 2.4 גרם KH ₂ PO _4, 20 מיליליטר 10% המניה אזיד הנתרן. כדי להפוך את פתרון מניות זה, לשקול את אבקה אזיד הנתרן לעשות פתרון 10% במים מזוקקים פעמיים. מערבבים מלח עם חום עדין עד שהיא נמסה. זהירות: יבשה אזיד הנתרן הוא תגובתי וכל הצורות הן רעילות. ללבוש מסכה וכפפות בעת עבודה עם אזיד הנתרן יבש או פתרונות.
2. בואו מגניב מלוח (טריס pH הוא טמפרטורה רגישה), ואז ה-pH ל 7.2 עם 1-10 M NaOH. למעלה 1 ליטר עם מים מזוקקים פעמיים וחיטוי לעקר. אחסן בטמפרטורת חדר ולדלל את 1x לפי צורך במים מזוקקים כפולים סטרילי. זהירות: NaOH הוא מאכל - ללבוש כפפות בעת השימוש.

3A. תיקון אור באמצעות מתנול אצטון

1. שים מתנול 100%, אצטון 100%, וופר פוספט 1x (PBS) בצנצנות מכתים על קרח לprechill לפחות 10 דקות. זהירות: מתנול ואצטון הם רעילים, ללבוש כפפות.
2. קח זוג תחתון ועליונות שקופיות מהקרח היבש, במהירות לסובב אותם לגזרים, ולטבול באופן מיידי את השקופית "מלמטה" במתנול הקר כקרח במשך 2 דקות. השקופית "העליונה" יכולה להיות מושלכת.
3. העבר את השקופיות ממתנול לקרח אצטון הקר למשך 4 דקות. אם היו לי שקופיות תולעים רבים, רוב (90%) ייפלו בתיקון, אפילו עם השקופיות שהוכנו הטוב ביותר. אם שקופיות תולעת אחת הוכנו כראוי, התולעים צריכים להישאר דבקים.
4. הנח או טובל את השקופיות בצנצנת עם PBS (כדי לשטוף את מקבע) והמשך לשלב 4 (מכתים).

3B. תיקון קשיח באמצעות פורמלדהיד או glutaraldehyde

1. לדלל פורמלדהיד כיתה מגיב או פתרון glutaraldehyde ב 1x PBS ל0.5-4% ריכוז סופי. ma aliquots (1.5 מיליליטר)y יאוחסן כתרים בחוזקה ב-20 ל-30 ° C; להפשיר aliquots על קרח רק לפני השימוש. הערה: פתרונות פורמלדהיד לבזות לאורך זמן ועם חשיפה לאוויר. זהירות: פורמלדהיד וglutaraldehyde הם רעילים, ללבוש כפפות ולעבוד במכסת המנוע.
2. קח זוג תחתון ועליונות שקופיות מהקרח היבש, במהירות לסובב אותם בנפרד, ומניח מייד את השקופית "התחתונה" עם תולעים בצלחת שטוחה עם מכסה. (יכולה להיות מושלכת השקופית העליונה).
3. מייד פיפטה 200 מקבע רעיל μl מעל מרכז השטח של השקופית עם תולעים. מקבע באופן חלקי יקפא במקום, ולאחר מכן להמס כדי לכסות את האזור גדול יותר של השקופיות.
4. אם התולעים לא לגמרי מכוסים במקבע, באופן מיידי ובזהירות להוסיף עוד מקבע באמצעות micropipette. אל תאפשר מקבע לזרום מעבר לקצה של השקופית.
5. מכסה את הצלחת עם מכסה ולהשאיר למשך לילה 10 דקות בטמפרטורת חדר. הקפד המנה humidified אם incubations יותר arדואר בשימוש - זה יכול להיעשות על ידי הוספת מגבונים ללא סיבים רטובים מקופלים לצלחת. אל תתנו למגבונים לגעת בשקופיות.
6. לאחר הקיבוע הושלם, פיפטה בזהירות מקבעת עם תולעים רופפים לתוך צינור 1.5 מ"ל וטובל את השקופיות בצנצנת מכתים עם PBS.
7. לסובב את הצינור עם תולעים שהשתחררו במהירות גבוהה למשך 30 שניות לגלולה. יש לשטוף את התולעים פעמיים עם PBS, ולאחר מכן לעבד במקביל לתולעים בשקופיות (עושה צעדים בצינורות microfuge, ולא בשקופיות).
8. המשך לשלב 4 (מכתים).

4. נוגדן מכתים

הפרוטוקול מכתים נוגדנים דומה לפרוטוקולים סטנדרטיים לרקמה כלשהי בשקופיות. פרוטוקול זה הוא זהה עבור כל השקופיות ללא קשר להכנה בשלבי 1-3.

1. הכן את נוגדן הצפת על ידי ערבוב 700 מיליליטר מים מזוקקים פעמיים, 100 מיליליטר 10x PBS, 5 מיליליטר טריטון X-100 (0.5% סופיים), 2 מיליליטר 0.5 M-pH EDTA 8 (1 מ"מ סופי), BSA 1 גר '(0.1% סופיים), 5 מיליליטר 10% AZ נתרןפתרון IDE (0.05% סופיים). pH 7.2 עם HCl, ואז להוסיף מים מזוקקים פעמיים לL 1; לאחסן ב 4 ° C.
2. הכן את הבלוק על ידי בנייה מחדש של סרום חמור במים מזוקקים פעמיים, ולאחר מכן מוסיף 5 מיליליטר סרום ל45 מיליליטר חיץ נוגדן (סרום 10% סופיים).
3. הכן את פתרונות נוגדן ראשוניים ומשניים על ידי דילול נוגדן במאגר נוגדן בתוספת BSA 1%. דילולים מומלצים הם 1:50-1:2,000 עבור נוגדנים ראשוניים ו1:1,000-1:5,000 לנוגדנים משני (נוגדני Cy3or OG488 מצומדות חמורים נגד מינים המשמשים להעלאת נוגדן ראשוני).
4. הכן את מניית DAPI ידי ערבוב 2.5 מ"ג / מיליליטר במים מזוקקים כפולים; חנות ב8 aliquots μl קפוא ב-30 ° C. זהירות: DAPI הוא צבע-DNA מחייב רעיל, ללבוש כפפות בעת שקילה ומהחלק לaliquots.
5. הכן בינוני הרכבה 10 מיליליטר ידי ערבוב gallate n-propyl 200 מ"ג, 0.3 מיליליטר 1 M טריס 9 pH, מים מזוקקים כפולים 2.7 מיליליטר בצינור חרוטי 15 מיליליטר. חום ב65 מעלות צלזיוס למשך כ -10 דקות עד שהיא נמסה.הוסף 7 מיליליטר גליצרול וaliquot 8 μl של DAPI ומערבולת היטב. בינוני aliquot לתוך צינורות 1.5 מיליליטר, לעטוף בנייר כסף, ולאחסן בחושך ב 4 ° C (שניהם אוויר והאור לבזות את המדיום - אם זה הופך להיות צהוב יותר, להשליך פסולת בBiohazard). זהירות: gallate n-propyl הוא נוגד חמצון תגובתי, ללבוש כפפות בעת שקילה.
6. העבר את השקופיות לצנצנת מכתים עם בלוק לשעה 1 בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 ° C (לילה עדיף לתיקון קשה). הימנע רועד, כדי למנוע תולעים לאבד.
7. העברת שקופיות מכתים צנצנת עם מגלשות נוגדן או מקום העיקרי שטוחות בצלחת והעליונה humidified כל אחד עם 100-500 נוגדן ראשוני μl. דגירה שקופיות הלילה בשעה 4 ° C בלי לרעוד.
8. לאחר דגירה נוגדן ראשוני, העברת שקופיות מכתים צנצנת של PBS.
9. סנן בלוק דרך המשפך מרופד בנייר המסנן ולאחסן ב 4 ° C, ואם כל 1-2 שבועות מסוננים סטרילי, בלוק ניתן לעשות שימוש חוזר ל1 חודשים או יותר. בדומה לכך, לסנן ולשמורנוגדן ראשוני ב4 ° C לשימוש חוזר (לתקופה של עד 10 או יותר סיבובים של צביעה).
10. יש לשטוף את שקופיות שלוש פעמים (~ 20 דקות כל אחד) במאגר נוגדנים.
11. הנח שקופיות בנוגדנים משני במכל מכתים אור חזק ודגירת 4 שעות בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 ° C.
12. העברת שקופיות מכתים צנצנת של PBS. סינון ולחסוך נוגדנים משני ב4 ° C לשימוש חוזר (לתקופה של עד 10 או יותר סיבובים של צביעה).
13. יש לשטוף את שקופיות שלוש פעמים (~ 20 דקות כל אחד) במאגר נוגדנים.
14. העברת שקופיות PBS ולהשאיר ב-PBS (דקות לילה לעל 4 מעלות צלזיוס) עד מוכן לעלות.
15. לעבוד במהירות בשקופיות בודדות, כך שהתולעים על מול שקופיות להישאר רטובים. הסר שקופית אחת מPBS, לייבש אחורי של השקופיות עם לנגב נטולי סיבים, ומניחים על מגבת נייר.
16. מקום ~ 20 μl של הרכבה בינונית על תולעים, כך שיש חלקים שווים בערך בינוניים וPBS בשקופית ושקופית להטות בעדינות לתערובת את שני פתרונות. CAUTION: בינוני הרכבה הוא רעיל.
17. שקופיות הטיה קצה כל כך חלבית הוא נמוך ופתרון אוסף ליד זיגוג, ואז למקם את הקצה אחד של 24 x 60 coverslip מ"מ על פתרון.
18. בעדינות להוריד את coverslip כדי למזער את בועות אוויר (המגדילות הלבנת ולשבש צפייה). אם בועות להיווצר, להרים את הקצה של coverslip לאט, ואז relower זה בלי להכניס את coverslip על פני התולעים.
19. לייבש בזהירות מקצה השקופית מבלי להזיז את coverslip, על ידי דחיסת הקצוות עם לנגב ונטול מוך. הקצה היבש יחסית של השקופית חייב להיות גלוי בכל רחבי קצה coverslip
20. לאטום את coverslip עם 2-3 שכבות של לק. ניתן להציב שקופיות בהחזיק שקופיות שטוחות במהלך הכנה ואחסון כדי להגן מפני אור. ברגע שקופיות אטומה ויבשה היטב, לנקות את coverslip ואחורי של השקופיות.
21. יכולות להישמר שקופיות ובכן אטומות בחושך במשך ימים על 4 מעלות צלזיוס או שבועות ב -20 ° C. במשך זמן רב יותר תקופות, STA DAPIining של ה-DNA ואת רוב הצבעים הירוקים (למשל עירור ננומטר 488) לדעוך. לאטום את coverslip עם יותר לק לפי צורך, למשל לאחר השימוש בכל עדשת טבילת שמן.

Representative Results

כאשר תולעים הם דחוסים כמו שצריך, סדוקים, וקלילות קבועה, כמעט את כל התולעת יכולה להיות נגישה למכתים נוגדן (ראה איור 2). המיקום של הגרעינים כפי שצוין על ידי מכתים DAPI מציין איזה חלקים של התולעת הם שלמים כאשר התולעים חשופים למקבעים קשה יותר, כגון פורמלדהיד, המורפולוגיה של התולעת עלולה להיות מעוותת (כפי שניתן לראות על ידי הופעתו בצורה לא טבעית הגלי של שרירים באיורים 3A-D). בעיה נוספת נפוצה היא קיבעון או חדירה של רקמות מסוימות לא אחידים. דוגמא לכך היא מוצגת איורים 3E-H, שבו השריר מוכתם רק בחלק של התולעת, למרות שנוכחותם של כתמים אחרים, כוללים צביעת ה-DNA, עולה כי לפחות חלק מהגוף היה נוכח ( כלומר, לא יוסר במהלך הקפאת פיצוח). הדפוס של מכתים חלקי וכתוצאה מכך יכול להיות מזוהה בקלות עם תרגול, כך שכל חלוקהעל של מכתים ניתן לקבוע גם אם כל תולעת אחת תערוכות מכתים לא אחיד.

בעיות נפוצות נתקלו בשימוש בכל מצב קיבעון פיצוח ההקפאה באות לידי ביטוי בדמות הסופית (איור 4). הבעיה הנפוצה ביותר היא מתפתלת מהמדגם בשל תנועה היחסית של שתי השקופיות במהלך דחיסה. העובדה שהגוף של התולעת הוא מעוות רק אחורי של הלוע ניתן לראות על ידי המורפולוגיה של הרקמות המוכתמות. תמונה זו מראה גם את הבעיה עם מכתים רקע, בשל נוגדני דבק poly-ליזין ציפוי השקופיות. שים לב, עם זאת, שכל התמונות הללו נאספו באמצעות שקופיות שנעשו במהלך ניסיונות מכתים הנוגדן הראשונים של סטודנטים לתואר ראשון בקורס מעבדה בביולוגיה של תא. אפילו עם בפועל, רבים תולעים בודדים יציגו את הבעיות לראות באיור 4. עם זאת, על כל שקופית אחת, תולעים כמו אלה שראו באיורים 2 ו -3 יכולים להיות founד ונבדק.

איור 1. קווי המתאר של נהלים. תרשים זרימה המצביע על צעדים כדי לבצע את הליך פיצוח הקפאה המוחלט. חלופות לתנאי קיבעון מגוונים ומספרים של תולעים מצוינות.

איור 2. תולעים קבועים באורח קל, צבעוניים גם ראשי שני הרמפרודיטים מבוגר קבועים עם מתנול אצטון ומסומן עם נוגדנים מרובים וצבעים:.) נוגדן ראשוני לשוחח (acetyltransferase כולין) ונוגדנים משני Cy3 מצומדות, לינה) DAPI (DNA הכחול) , C) בצרגון 488-אנטי-GFP גרין (חלבון פלואורסצנטי ירוק), ד ') מראה את הכיסוי (עם שני סמנים הכולינרגית, Cy3-אנטי צ'אט וCy5-אנטי VAChT (טרנספורטר ועי אצטילכולין) כפי שמוצג אדום). זן זה מהונדס (PS4657) מבטא שילוב תרגום בין ה-GFP וAJM-1, שנמצא בצמתים פסגת בלוע. התמונות הן תחזיות מקסימליים של סדרה של תמונות confocal; סרגל קנה מידה הוא 50 מיקרומטר.

איור 3. תמונות המבוגרים קבועים העיוותים הקשורים פורמלדהיד. פורמלדהיד המוכתם בCy3-phalloidin (נקשר אקטין פילמנטיות), DAPI (DNA הכחול), ואורגון גרין 488-אנטי-GFP. הספירה) רביעיות של הגוף רק אחוריות של הפות (שמאל קיצוני) באותו נמטודות, מראה מורפולוגיה לא טבעי גלית כתוצאה מעיוות באין לשכפל ידי קיבעון.) Red-phalloidin מציג מורפולוגיה שרירים מעט לא סדירה. ב ') גרעינים (כחול) מפוזר באופן שווה לאורך כל התולעת. C) ירוק מציג את ההתפלגות של חלבון :: GFP היתוך CED-1 בקרום הפלזמה של תא נדן האשכים, מונע על ידי אמרגן Lim-7 (MD701 זן). ד ') מציג את הכיסוי של שלושת הצבעים הללו תיוג. EH) יכול להשתנות עם צבעים שונים באותו נמטודות. E) Phalloidin (אדום) תוויות רק חלק השרירים בצד אחד של התולעת. F) הגרעינים (כחול) מצויים כעת בכל התולעת (למרות מוכתמים בעוצמה לא אחידה). G) OG488-אנטי-GFP תוויות קולגן-19 :: ה-GFP בציפורן בצד שני של התולעת שאין כתמים של רקמת השריר המרכזית יותר, המצביע על השריר שנמצאה אך לא מכתים על משטח אחד. H) מציג את הכיסוי של שלושה הצבעים. התמונות הן מקסימוםתחזיות imal של סדרה של תמונות confocal; ברים בקנה מידה הן 50 מיקרומטר.

איור 4. זחל קבוע העיוותים הקשורים לדחיסה. פורמלדהיד מוכתם) Cy3-phalloidin (נקשר אקטין פילמנטיות) כיסוי, B) DAPI (DNA הכחול), C) אורגון ירוקה 488-אנטי-GFP, ד '). טוויסט בגוף רק אחורי של הלוע הוא נראה לעין, כמו התא הירוק הפרשה וצלב חוט עצב הגחון על שאר הגוף. מכתים רקע גבוה באו לידי הביטוי גם בCy3-phallodin. מתח זה מבטא :: חלבון GFP היתוך VHA-8, הממוקם בעיקר בתא ההפרשה. התמונות הן תחזיות מקסימליים של סדרה של תמונות confocal שהשתרעו על פני השטח של השקופית (שמוביל למכתים רקע גבוה); סרגל קנה מידה הוא 50 מיקרומטר.

Discussion

פרוטוקול פיצוח ההקפאה הוא אחת מכמה שיטות למכתים נוגדן בג elegans. הוא מספק דרך פשוטה יחסית להכתים תולעים, אבל דורש חומרים כימיים מסוימים ולתרגל לתוצאות מיטביות. שלבים קריטיים (שמתוארים באיור 1) כוללים: 1) הכנת שקופיות (ראה שלבים 1 ו 2) דחיסה ידנית של נמטודות (ראה שלבים 2 ו -3) קיבעון מהיר (ראה שלב 3). ראשית, על מנת למקסם את ההידבקות של נמטודות לשקופיות, עדיף להכין שקופיות עם משקל מולקולרי גבוה (פולימר ארוך) polylysine, במקום להסתמך על שקופיות מוכנות מסחרי. שקופיות מסחריות מצופות בpolylysine כדי לאפשר לתאים לדבוק, בעוד שקופיות פיצוח הקפאה נועדו להיצמד לציפורן של כל נמטודות. שנית, את ההליך לדחיסה הנכונה של התולעים בין השקופיות לפני ההקפאה הוא קריטי. זה דורש ידיים ותרגול יציבים ללחוץ שקופיות יחד באמצעות הסכום הנכון שללחץ, כך שתולעים בודדים לפנות שני השקופיות מבלי להרוס המורפולוגיה שלהם. או יותר מדי או מעט מדי דחיסה מובילה לאובדן מוגבר של תולעים בקיבעון. יש צורך בטיפול נוסף כדי להעביר שקופיות על גבי המשטח המקורר בקרח היבש להקפאה מבלי להזיז את השקופיות יחסי אחד לשני. כל תנועה כזאת תגרום לתולעים לדמעה או לעוות. שלישית, כמו בכל טכניקת קיבעון, יש להציב את התולעים הקפואים ישירות לתוך מקבע לפני ההפשרה. אחרת, עלול לנטרל אנטיגן, מתן מידע מטעה על לוקליזציה subcellular. אם צעדים אלה קריטיים כולם נעשו כראוי, לקבלת התוצאות הטובות ביותר הוא עדיין נחוץ כדי לסרוק כמה שקופיות צבעוניות למצוא תולעים עם המורפולוגיה הטובה ביותר.

היבט בלתי נמנע אחד של טכניקה זו הוא שהתולעים יהיו דחוסים בממד אחד. הדחיסה היא בולטת ביותר במבוגרים, שבו לכאורה בקוטר של הגוף העגול בZ-הציר עשוי להיות 1-4 בלבדה שראה בx ו-y הצירים. דחיסה זו נוטה להפחית בזחלים קטנים יותר, והוא יכול להיות זניח בעוברים. בשל אופן שבי נמטודות החיים לעבור במהלך הכנת שקופיות, התולעים המוכתמים הם לעתים קרובות על צדם. זה מחקה את הכיוון של תולעים על צלחות אגר, עם קו האמצע לרוחב שוכב הארכה למטה באמצע של התולעת המוכתמת (ראה איורים 2-4). לפיכך, הדחיסה היא בדרך כלל בממד הרוחב. אמנם זה בעצם עושה מיקרוסקופ פלואורסצנטי הסטנדרטי קל יותר (יותר של הדגימה יהיה בפוקוס בו זמנית), זה אומר ששחזורי 3-D לא יהיו מדויקים.

כמו בכל מכתים נוגדן, חשוב לבדוק הספציפיות של כריכה. ברוב המינים, זה נעשה על ידי פקדים כגון זיקה מדלדלת הנוגדנים שלך או אי שימוש ראשוני. בג elegans, אמצעים ספציפיים יותר של בדיקה ספציפיות הם לעתים קרובות זמינים. מוטציות Null לגן והחלבון של עניין לספקשליטה מצוינת עבור סגוליות מכתים. שני הזנים צריכים להיות קבועים בתנאים זהים לפני ההשוואה, שכן צביעה היא בדרך כלל קיבוע תלויה. אם לא מוטציה null זמינה, אז זה קל יחסית בג elegans לירידה ברמות חלבון עם RNAi (RNA עיכוב ¹²⁾ ולחפש כתמים ירדו בתולעים שטופלו RNAi.

נוגדני polyclonal לעתים קרובות להראות מכתים שאינו ספציפי, גם אם מטוהר זיקה לאנטיגן. לעתים קרובות, קיבעון אור באמצעות מתנול ואצטון (אשר לתקן את החלבונים על ידי מזרזם ולא crosslinking) נותן צביעה שאינה ספציפית נמוכה יותר מאשר פורמלדהיד או glutaraldehyde (אשר יוצרים יותר אפיטופים גרסה בשל cross-linking המגוון) ^1,11. עם זאת, בג הצביעה שאינה ספציפית elegans היא נפוצה מאוד בשום תנאי קיבוע, בעיקר במעיים. אם אנטיגן שלך בא לידי ביטוי בבטן, ולאחר מכן צביעה שאינה ספציפית זה עשויה להסוות staini הספציפי שלךng. אם מוטציות null זמינות לחלבון שלך, אז תולעים קבועים בשיטה זו ניתן להשתמש בזיקה לרוקן בסרום שלך. מאז antigenicity תלוי תנאי קיבעון, התולעים המשמשים לרוקן הנוגדנים שלך צריכים להיות מוכנים באותה הצורה כמו wild-type תולעים אתה מכתים. אחרי סיבוב של דלדול של מכתים שאינו ספציפי, מוטציה ותולעים פראי מסוג אחד יכול להיות מוכתם במקביל עם הסרום המדולדל לשליטה מצוינת. סיבוב של דלדול עם מוטנטים נוספים יכול להיעשות בהתאם לצורך.

טכניקה זו שימושית מאוד לבדיקת נוגדנים חדשים עבור מכתים ספציפי תחת מגוון רחב של תנאים. אלה עשויים להיות נוגדנים שנוצרו נגד ג elegans חלבונים או נוגדנים שנוצרו נגד חלבונים נשמרים ממינים אחרים. בעוד ששיטה זו נותנת את המורפולוגיה הטובה ביותר עם נמטודות קבועה באורח קל, זה פשוט יחסית כדי לנסות מגוון של fixatives כדי לקבוע אילו תנאים, אם בכלל, נותן תוצאה מסוימתs. בניגוד לשיטות אחרות לקיבוע קשיח באמצעות פורמלדהיד או glutaraldehyde, אנזימטי או צמצום טיפולים לא נחוצים להכנת מדגם. מאז טיפולים אלה עלולים להפחית antigenicity, זה מגדיל את היכולת לזהות נוגדנים ספציפיים ותנאי הקיבוע האופטימליים שלהם. אם תנאי קיבעון קשים עבודה הטובה ביותר, הנסיין אז יכול לפנות לשיטות מבוצעות על תולעים בשלמותה כדי להשיג מורפולוגיה טובה יותר (סיכמה בעבודה הקודמת שלנו ^4). אם קיבוע אור משמר antigenicity, אז טכניקה זו עשויה לשמש לכל מכתים נוסף למיקרוסקופ אור.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
poly-L-lysine slide (ESCO brand)	Fisher	12-545-78	Sigma brand slides also suitable
poly-L-lysine hydrobromide	Sigma	P1524	IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical
single frosted edge slides	Fisher	48312-002	Other brands are suitable
sodium azide	Sigma	S2002-25G	TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution
coplin staining jar	VWR	47751-792	Other brands are suitable
5-slide mailer	Electron Microscopy Science	71549-01	One of many different brands of small slide holder, suitable for staining
Paraformaldehyde	VWR	MK262159	IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Glutaraldehyde solution, 25% in water	Sigma	G 5882	IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Triton X-100	VWR	EM-9410	Other brands are suitable
Bovine Serum Albumin	Fisher	ICN820451	Other brands are suitable
Donkey Serum, lyophilized	Jackson Immunoresearch	017-000-121	Other brands are suitable
Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling	Jackson Immunoresearch	715-165-150	This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody).
n-propyl gallate	Fisher	ICN10274750	Other brands are suitable
DAPI, 4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	Sigma	D 9542	TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
Whatman #1 15 cm diameter filters	Fisher	09805G
Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm	VWR	48393-252	#1 1/2 thickness is optically best
Microscope slide folder	VWR	48429-092	Other brands are suitable