"Freeze-craqueo," un método para exponer los tejidos internos del nematodo C. elegans a anticuerpos para la localización de proteínas, se demuestra.
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Artículo de método
Tinción de anticuerpos en
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Resumen
Resumen
Para la tinción de C. elegans con anticuerpos, la cutícula relativamente impermeable deben ser anuladas por métodos químicos o mecánicos. "Freeze-cracking" es un método utilizado para extraer físicamente la cutícula de los nematodos mediante la compresión de nematodos entre dos diapositivas adherentes, la congelación, y tirando de las diapositivas aparte. Freeze-craqueo proporciona una manera simple y rápida para obtener acceso a los tejidos sin tratamiento químico y se puede utilizar con una variedad de fijadores. Sin embargo, conduce a la pérdida de muchas de las muestras y la compresión requerida distorsiona mecánicamente la muestra. Se requiere práctica para maximizar la recuperación de muestras con buena morfología. Freeze-craqueo puede ser optimizado para condiciones específicas de fijación, de recuperación de muestras, o bajo la tinción no específica, pero no para todos los parámetros a la vez. Para los anticuerpos que requieren fijación de condiciones muy duras y toleran los tratamientos químicos necesarios para permeabilizar químicamente la cutícula, treatmenpuede ser preferido t de nematodos intactas en solución. Si el anticuerpo requiere una solución más ligero o si las condiciones óptimas de fijación son desconocidos, congelar-craqueo proporciona una manera muy útil para ensayar rápidamente el anticuerpo y puede proporcionar información específica de localización subcelular y celular para el antígeno de interés.
Introducción
Para determinar la localización celular y subcelular de las proteínas, los científicos han denominado tradicionalmente tejidos con anticuerpos seleccionados para reconocer específicamente las proteínas particulares 1. En algunos organismos modelo como C. elegans, tinción de anticuerpos a menudo ha sido sustituido por técnicas genéticas moleculares, que dan resultados más rápidamente. Estos incluyen los organismos de transformación con constructos que consisten en fusiones de genes entre el promotor y las regiones codificantes del gen de interés y la proteína fluorescente verde. Sin embargo, las técnicas moleculares están sujetas a una serie de art....
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Protocolo
NOTA: los pasos de protocolo múltiple se presentan con opciones para la puesta a punto y preparación en función de las condiciones específicas del experimento. Para estos casos, pasos alternativos se presentan como A, B, C, etc El protocolo con pasos alternativos se describe en la Figura 1.
1. Preparación del portaobjetos recubiertos Polilisina
Se dispone de tres tipos diferentes de diapositivas, dependiendo del equilibrio deseado entre la facilidad de preparación, la adhesión relativa y la unión no específica del anticuerpo. Detalles de alternativas de preparación de portaobjetos se da....
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Resultados
Cuando los gusanos se comprimen correctamente, agrietados, y ligeramente fijos, prácticamente todo el gusano puede ser accesible para la tinción de anticuerpos (ver Figura 2). La ubicación de los núcleos, como se indica por la tinción DAPI indica qué partes del gusano están intactos Cuando los gusanos se someten a un fijador más duro, tal como formaldehído, la morfología del gusano puede distorsionarse (como se ve por la aparición no natural ondulado de la músculos de las figuras 3A-D)........
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Discusión
El protocolo de congelación de craqueo es uno de varios métodos para la tinción de anticuerpos en C. elegans. Proporciona una manera relativamente fácil de manchar los gusanos, pero requiere de reactivos específicos y práctica para obtener resultados óptimos. Los pasos críticos (descritos en la Figura 1) son: 1) la preparación de diapositivas (consulte los pasos 1 y 2) la compresión manual de los nematodos (consulte los pasos 2 y 3) de fijación rápida (ver paso 3). En primer lugar, para maximiz.......
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Divulgaciones
El autor declara que no tiene intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
El financiamiento fue proporcionado por la NSF CCLI # 0633618 y la Universidad de Ohio. Algunas cepas fueron proporcionados por el Centro de Genética Caenorhabditis. El estudiante de posgrado Reetobrata Basu aparece en el video.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| portaobjetos de poli-L-lisina (marca ESCO) | Fisher | 12-545-78 | Los portaobjetos de la marca Sigma también son adecuados |
| el hidrobromuro de poli-L-lisina | Sigma | P1524 | IMPORTANTE: Marca y alto peso molecular de los portaobjetos de borde esmerilado único crítico de polilisina |
| Fisher | 48312-002 | Otras marcas son adecuadas | |
| azida de sodio | Sigma | S2002-25G | TOXIC, use guantes y mascarilla mientras pesa el polvo para hacer un 10% de caldo. Use guantes cuando pipetee la solución madre |
| frasco de tinción coplin | VWR | 47751-792 | Otras marcas son adecuadas |
| Sobre de 5 portaobjetos | Microscopía Electrónica Science | 71549-01 | Una de las muchas marcas diferentes de portaobjetos pequeño, adecuado para teñir |
| Paraformaldehído | VWR | MK262159 | IMPORTANTE: Las soluciones regulares de formalina (37% de formaldehído) NO son adecuadas. 1) Disolver el paraformaldehído crisatlano en tampón de fosfato y almacenar en pequeñas alícuotas congeladas. O 2) comprar paraformaldehído de grado de microscopía electrónica en alícuotas. TÓXICO -use guantes; Deseche el exceso de plumón del fregadero con agua. |
| Solución de glutaraldehído, 25% en agua | Sigma | G 5882 | IMPORTANTE: comprar glutaraldehído de grado de microscopía electrónica en ampollas; TÓXICO -use guantes; Deseche el exceso de plumón del fregadero con agua. |
| Triton X-100 | VWR | EM-9410 | Otras marcas son adecuadas |
| Albúmina sérica bovina | Fisher ICN820451 | Otras marcas son adecuadas | |
| Suero de burro, liofilizado | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | Otras marcas son adecuadas |
| Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-marcaje | Jackson Immunoresearch | 715-165-150 | Esta empresa está recomendada para anticuerpos multi-etiqueta (afinidad depleida) de alta calidad. Seleccione el colorante y el antígeno apropiados (animal utilizado para producir anticuerpos primarios). |
| galato de n-propilo | Fisher | ICN10274750 | Otras marcas son adecuadas |
| DAPI, 4',6'-diamidino-2-fenilindol diclorhidrato | Sigma | D 9542 | TOXIC. Use guantes y dispense en pequeñas alícuotas y se mueva para minimizar la exposición |
| Whatman #1 filtros de 15 cm de diámetro | Fisher | 09805G | |
| Coverslip #1 1/2 rectángulo 24 x 60 mm | VWR | 48393-252 | #1 1/2 de grosor es ópticamente mejor |
| Carpeta de portaobjetos de microscopio | VWR | 48429-092 | Otras marcas son adecuadas |
Referencias
- Harlow, E., Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York City, New York. (1988).
- Mello, C., Fire, A. DNA Transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
- Boulin, T., Etchberger, J. F., Hobert, O. Reporter gene fusions.
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Reimpresiones y permisos
