Summary
「凍結割れ、「線虫C.の内部組織を露出させるための方法をタンパク質の局在化のための抗体に虫が 、実証されている。
Abstract
C.を染色する抗体を用いた虫は 、比較的不透過性のキューティクルは、化学的または機械的な方法でバイパスする必要があります。 「凍結割れを「物理的に二つのスライド間の接着性の線虫を圧縮し、それらを凍結し、そして離れてスライドを引っ張ることにより線虫のクチクラをプルするために使用される一つの方法である。凍結割れは、化学処理をせずに、組織へのアクセスを獲得するための簡単かつ迅速な方法を提供し、様々な固定剤と共に使用することができる。しかしながら、標本の多くの損失をもたらし、必要な圧縮は、機械的にサンプルを歪める。実際には、良好な形態を有するサンプルの回収を最大化するために必要とされる。凍結割れは、特定の固定条件、サンプルの回収、または低非特異的染色のために最適ではなく、すべてのパラメータの一度にすることができます。非常に難しいの固定条件を必要とし、化学的にキューティクルを透過性にするために必要な化学処理を容認する抗体について、treatmen溶液中のインタクトな線虫のtが好ましい場合がある。抗体が必要な場合は軽量化の修正や最適な固定条件が不明である場合には、凍結割れが急速に抗体をアッセイすると、目的の抗原に特異的な細胞内および細胞内局在情報を得ることができる非常に便利な方法を提供します。
Introduction
タンパク質の細胞と細胞内局在を決定するために、科学者たちは、伝統的には特定のタンパク質1を認識するように選択された抗体を有する組織のラベルが付いています。 Cなどのいくつかのモデル生物でのエレガンス 、抗体染色は、多くの場合、より迅速に結果が得られた分子遺伝学的技術、により置換されている。これらは、プロモーターと関心と緑色蛍光タンパク質の遺伝子のコード領域の間の遺伝子の融合からなる構築物で形質転換する生物を含む。しかし、分子技術は、真のプロモーターと高コピー数（C. elegansの通常の技術） の2,3での構築物の発現の変化を知ることで問題を含むアーティファクトの数、対象となります。したがって、抗体を用いた染色は、生体内でのタンパク質の機能を研究する多くの科学者のための目標である。
抗体を用いて組織を染色することは、困難な場合がありますので、tibodiesは、特定の立体構造1にそれらの抗原を認識することができる。例えば、抗体は、特定の方法で修正されただけの変性または完全な抗原を認識することができるし、 その場で抗原を認識しない場合があります。線虫における抗体染色の問題は、線虫のクチクラは、組織への抗体のアクセスをブロックし、比較的不透過性のバリアを形成するという事実によって悪化する。
Cの抗体染色のために使用される、いくつかの異なる方法があります。 （私たちの以前の研究4に概説されている） 虫 。無傷で染色する「ワームを、「法は凍結し、比較的硬い固定液（ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド）で解凍するために開発された、凍結融解サイクルは、固定液5の急速な浸透を可能にするためにキューティクルをクラックするのに役立ちます。固定後、キューティクルは、抗体の浸透を可能にするために透過処理した;方法は、薬剤、コラゲナーゼ、またはその両方を低減5-7で処理することを含んでいた。これらのTreatmentsは、形態を保ったが、多くの場合、抗体認識を減少または破壊された。代替方法は、抗体の浸透を可能にするために解剖8が含まれています。
「凍結割れを「抗体染色9月10日を可能にするために半無傷のワームの内部へのアクセスを得るための一つの方法です。コラゲナーゼおよび還元処置を避けながら、凍結割れが固定の様々な条件で行うことができる。線虫は、2接着剤スライドの間に配置された凍結した後、スライドを分離し、下部のスライド上の線虫のほとんどは、トップスライド上のキューティクルの多くを残している。下部スライドは固定剤に配置することができ、付着した線虫を有するスライド全体を、抗体染色手順を介して転送される。この方法は、2つの主要な困難を提示しません。まず、真剣にそれらを変形させることなく、線虫を分割するのに必要な圧力の正確な量を適用することは困難である。第二に、ワームの多くはSではないでしょういずれかのスライドにチェックを入れて、固定液やリンスに失われます。しかし、適切なスライドと実践では、この方法は急速に固定剤および抗体は、多種多様で使用することができる合理的な形態を有する線虫を生じる。
この方法は、実験の目的に応じてわずかに変化させることができる。単一線虫の染色（ 例えば 、単一の形質転換体は、抗体染色を変化させたか否かを決定するために）所望される場合、最大の密着性と摺動する（しかし、より高いバックグラウンド染色）は、（下記参照）、このような余分なポリリジンを有する実験室で調製されたスライドを使用することができる。線虫がこれら注視後にポリリジンにもっと悪い付着するので、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒド固定のため、高い密着性スライド（実験室用意ポリリジンスライド）が、使用されるべきである。野生型線虫は、メタノールおよび/またはアセトンで固定されている場合は、下側の接着性と摺動し、低いバックグラウンド染色を用いるべきである（市販またはlaboratoryに準備スライド）。抗体および固定剤の種々の研究室で使用されている場合、必要になるまで、スライドの選択は、前もって調製し、保存することができる。
線虫の組織へのアクセスが獲得された後、抗体染色手順は、（より長いインキュベーション組織の特性よりもむしろ細胞1,11で）標準的な方法に従う。
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Protocol
注：複数のプロトコルステップは、実験の特定の条件に応じて、セットアップおよび準備のためのオプションが表示されます。このような場合、代替的なステップは、代替の工程を用いたプロトコルは、図1に概説されているA、B、C などとして提示される。
1。ポリリジンコートスライドの調製
スライドを3つの異なる種類の製剤、相対的な密着性、及び抗体の非特異的結合の容易さとの間の所望のトレードオフに応じて、使用することができる。スライド調製の代替の詳細は、接着性および複雑さが増加する順に工程1A-1Cに以下に示す。これらの異なる方法によって調製されたスライドは、単一の実験のために一緒に使用することができる。
1A。いいえスライドの準備しない
市販のポリリジンコートスライドは、低接着性と低いバックグラウンドを提供しています。
1B。スライドPRメタノール - アセトン固定用eparation最適
ミディアム接着性と低バックグラウンド。
- スライドを浸漬するためにポリリジン溶液を調製：非常に高分子量の400mgの追加 - 再蒸留水200ミリリットルを（150,00030万D）ポリ-L-リジン。防腐剤として2ミリリットルを10％のアジ化ナトリウムストック（最終濃度0.1％）を添加する。注意：乾燥アジ化ナトリウムは、反応性であり、すべてのフォームは有毒である。二重蒸留水に10％の株式を作るために粉体を計量しながら、マスクと手袋を着用してください。
- 汚れや粒子を除去する、糸くずの出ないワイプとシングルエンド曇りガラススライドを拭きます。これさえ指定して購入したスライド上で行われる必要があり、「予備洗浄。」
- 場所は、（後の分離を容易にするために）非常に完全に整列アップではなくつや消しのエッジを維持し、スライドホルダー、コプリンジャーまたは他のスライド染色容器にバックツーバックスライドします。 70％エタノール（試薬グレードのアルコール必要でない）ジ中の1％HClを用いてビーカー中でスライスホルダを配置水を静まるまたはフロスティングのレベルまで染色瓶を埋める。最低5分間溶液中にスライドをロック。注意：このソリューションは、腐食性が、手袋を着用してください。注記：この溶液を（数ヶ月まで）を数回再使用することができる。
- 1分間蒸留水を実行している中でスライドを洗浄します。
- 30〜60分間40〜60℃のオーブンに置くことによって、または室温で一晩保つことによってどちらかほこりのない環境で完全に乾燥したスライド。
- 15分間ロッカー上（unfrosted部分をカバーする）ポリリジン溶液中でスライドをインキュベートします。
- スライドの乾燥を繰り返します。
- ポリリジン水溶液のインキュベーションおよび乾燥工程を繰り返します。
- このような薄い計量ヘラなどのスリムな金属物を使用してスライドを分離する。それらが適切に接着されている場合、それらは分離するのが困難である。適切な安全装置（安全メガネ）を着用し、スライドを分離する際にガラスの小さなビットが緩んで飛ぶことがあるので、（使用後に廃棄されることを）ベンチトップ紙に取り組んでいます。
- クリーンで保管スライド必要になるまで（ダストフリー）が、4℃でボックスをスライドさせます。
1C。ホルムアルデヒド固定のための準備に最適なスライドさせます
最高の接着力が、高いバックグラウンド。
- （空気乾燥用）（オーブンで乾燥用）ダストフリー、オーブンセーフ皿の中や平らな塵自由表面上のメソッド第1bフラットを用いて製造場所スライド。
- 各スライドの真ん中にポリリジン溶液を20〜60μlのドロップを置きます。
- 完全にオーブン中又は室温で乾燥したスライド。それが蒸発するポリリジンは淡い楕円形を残すでしょう。これらの楕円は非常に接着剤である。残念ながら、それらはまた、偶数ブロックした後、一次および二次抗体に結合する。
- 必要になるまでクリーンに保管スライド（ダストフリー）が、4℃でボックスをスライドさせます。
2。冷凍虫スライドの調製
（線虫のプレート用）を完全メソッド2Aを用いて細菌の自由洗浄することにより、染色のための線虫を準備したり、図2（b）（個々の線虫の場合）。
2A。線虫のプレートからのスライドの準備
- prechillドライアイスの上に金属の平らな部分を置きます。
- 1.5ミリリットルの微量遠心管に細菌とNGMプレートからワームをすすぐために、蒸留水やガラスピペット（ワームの損失を減少させる）、またはマイクロピペットを使用してください。プレートは年齢同期化または混合することができます。必要な場合を除き、多くのdauers（クラックするのが難しい）、または餓死ワーム（増加自家蛍光）でプレートを使用しないでください。
- 細菌がなくなるまで蒸留水でワームを3〜4倍を洗浄します。 （ワームの損失を低減するために、同じガラスピペットを使用しています。）のいずれか、ワームをペレット彼らが（チューブの底に、主に成人を収集するために）3〜5分間のベンチに座ってや〜1,000 rpmで30秒間回転させてから（〜500卓上遠心機でG）（）大人、幼虫、および胚を収集します。
- ワームのような水の約2倍の容量を残して、ワームとチューブから水の大部分を除去（しかし少なくとも25μL総量）。
- 利用可能な（きれいに拭いポリリジン扱われていない）、通常の「トップ」のスライドの数と同じ数を持っている。
- 「下」、付着スライド上の水に約25μlのワームプレイスとピペットチップの側面を使用して、スライドの中央部分の上にワームを含む液体を広げた。
- ワームは2分30秒で我慢しましょう。スライドが適切に粘着性のある場合、彼らはスライドを接点として、ワームの端部がついてしまいます。
- 片方の手で下のスライドを保持し、つや消しの部分が、すべてが重なっているように、一番下のスライド上で一番上のスライドを配置。ワームは、まだ少し動くように、液体は、少し離れたスライドを維持する必要があり、スライドが互いの上にスリップさせてはいけない-これは、ワームをねじる 。
- 慎重にSまっすぐ下に押し軽く、トップスライドに、両手の親指と人差し指を使って。圧力の理想的な量と、スライドの端に最大の雌雄同体の数は大人と幼虫のほとんどが各スライドに連絡する一方、破裂されますが、そのまま残ります。
- すぐに、慎重に（ 滑らず）ドライアイスに金属片にスライドを置く。スライドは1分以内に凍結表示されます。徹底的に凍結されるまで5分間ドライアイス上で保管してください。
- この時点で、スライドを数日間-80°Cで標識されたボックスに格納されてもよい。 （これらは-80℃で数週間維持された場合は、水が離れて昇華し始めるやワームも同様に染色されません）。スライドを-80℃で保存している場合は、それらをクラッキングする前に10分間、ドライアイス上で「ウォームアップ」してみましょう。
- 3（固定）を進みます。
図2（b）。個々の線虫のスライドの作成
- PRECにドライアイスの上に金属の平らな部分を置きます丘。
- バクテリアからそれらを解放するNGMプレート上の水滴に個々の線虫を転送するためにワームのピックを使用してください。線虫（S）が可能な場合は、自家蛍光を減少させるために十分に供給される必要があります。必要に応じてワーム（S）は、細菌の自由になるまでの水の新たなスポットに転送を繰り返します。
- 次のドライアイス、ラベル面を上にしてコンテナにカウンターの上に消えないインクと場所スライドと「ボトム」ポリリジンスライドのつや消し側にラベルを付けます。あまり付着し、「トップ」、同数の利用可能な（未処理）のスライドを持っている。
- ポリリジンで二重処理された底のスライドの領域の上の水の5〜10μlのドロップを置きます。より多くのワームを転送する場合は、完了前に水が蒸発するのを防止するために、より大きなボリュームを使用してください。
- ワームは粘着性の摺動面に触れダウンシンクとして見て顕微鏡を用いて、ワームのピックと水滴にワーム（複数可）を転送します。ドロップあたりのような多くの+ 20としてワームにわずか1つのワームを転送します。
- ボトムSを保持する片手にLIDEとつや消しの部分が、すべてが重なっているように、下のスライドの上のトップのスライドを配置。
- すぐに、慎重に（ 滑りまたは圧縮せずに ）、ドライアイス上で金属片にスライドを置く。 5〜30分間ドライアイス上に保つ。 （スライドを簡単に乾くように、これらのスライドを長期的に保管しないでください。）
- 3（固定）を進みます。
3。固定
固定剤は、いずれの沈殿させることによって「修正」セルの代わりに、抗原、（「光固定」）または架橋（「ハード固定」）抗原のに必要である。固定は抗原性を崩壊させることが、最も知られている抗体は、特定の固定条件で最適に動作する。新しい抗体について、固定条件の範囲をテストする必要があります。
任意の固定のために、最初のステップは、リン酸緩衝生理食塩水を作ることである。方法A（光を用いた抗体染色のための線虫で、次の修正のスライドメタノール、アセトン）またはB（ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドを使用して困難フィックス）を使用して固定します。
- 80グラムのNaCl、2.0グラムのKCl、27.2グラムのH 2 0、2.4グラムのKH 2 PO 4、20ミリリットルの10％アジ化ナトリウム原液•HPO 4 2ナトリウムを添加することにより、無菌の10X PBS（リン酸緩衝生理食塩水）のストック溶液を準備します。このストック溶液を作るために、再蒸留水中に10％溶液を作るためにアジ化ナトリウム粉末を秤量。溶解するまで穏やかな熱で生理食塩水をかき混ぜる。注意：乾燥アジ化ナトリウムは、反応性であり、すべてのフォームは有毒である。乾燥アジ化ナトリウムやソリューションを扱う際のマスクと手袋を着用してください。
- 1月10日のNaOHで7.2にpHをして、（トリスpHは温度に敏感である）、生理食塩水、クールにしましょう。蒸留水や滅菌するオートクレーブで1Lにトップ。室温で保存し、滅菌蒸留水を用いて、必要に応じて1Xする希釈する。注意：NaOHを苛性ソーダである - 使用中に手袋を着用してください。
図3（a）。メタノール - アセトンを用いた光フィックス
- 少なくとも10分間氷上にprechill染色ジャーに100％メタノール、100％アセトン、および1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を入れた。注意：メタノール、アセトンは、毒性がある手袋を着用してください。
- それらを離れてねじる迅速に、ドライアイスから下部と上部スライドのペアを取り、すぐに2分間氷冷メタノール中で「底」のスライドを浸す。 「上部」スライドが破棄されてもよい。
- 4分間の冷アセトンを氷メタノールからスライドを転送します。スライドは、多くのワームを持っていた場合、（90％）で最もさえ最高の準備スライドが、フィックスに落下します。シングルワームスライドを適切に準備された場合、ワームは、付着したままにする必要があります。
- 場所やPBSでジャーの中にスライドをDIP（固定液を洗い流すこと）と4（染色）に進みます。
図3（b）。ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドを使用してハード修正
- 0.5から4までパーセントの最終濃度になるように1×PBS中の試薬グレードのホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒド溶液を希釈する。一部（1.5ミリリットル）MAYは、しっかりと-20〜-30℃で蓋を保存することが、単に使用する前に、氷の上でアリコートを解凍。注：ホルムアルデヒドのソリューションは、時間の経過とともに、空気への暴露に劣化する。注意：ホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドは、手袋を着用し、フードで働く、有毒である。
- それらを離れてねじる迅速に、ドライアイスから下部と上部スライドのペアを取り、すぐにふた付きのフラット皿の中のワームと「下」のスライドを配置。 （一番上のスライドは、廃棄することができる）。
- すぐにワームとスライドのエリアの中心に200μlの有毒な固定液をピペット。固定剤は、部分的に、スライドの広い領域をカバーするために、溶融次いで、適所に凍結する。
- ワームが完全に固定液に覆われていない場合は、すぐに、慎重にマイクロピペットを用いてより多くの固定液を追加します。固定液は、スライドの端に流れることがないようにしてください。
- 蓋付きのお皿を覆い、室温で一晩に10分間のままにしておきます。長いインキュベーションがArであれば、皿が加湿されることを確認してください使用される電子 - これは皿に折り畳まれた湿った糸くずの出ないワイプを追加することで行うことができます。ワイプは、スライドを接触させてはいけません。
- 固定が完了したら、慎重に1.5ミリリットルチューブに緩いワームで固定液をピペットPBSで染色ジャーでスライドを浸す。
- ペレット化するために30秒間高速で緩い来たワームで、チューブを回転。スライド上のワームと並行して、プロセス（マイクロチューブ内ではなく、スライド上の手順を実行して）、PBSで2回ワームを洗浄します。
- 4（染色）に進みます。
4。抗体染色
抗体染色プロトコルは、スライド上の任意の組織のための標準的なプロトコルと同様である。このプロトコルに関係なく、ステップ1-3の準備のすべてのスライドに同じである。
- 700ミリリットルの蒸留水を混合することにより、抗体緩衝液を調製100mlの10×PBSを5mlのTriton X-100（0.5％最終）を2mlの0.5M EDTA pH8中（最終1mM）、1gのBSA（最終0.1％）、 5ミリリットルの10％ナトリウムのzアミド溶液（最終0.05％）。 HClで7.2にpHを、そして1Lに蒸留水を加え、4℃で保存
- 45ミリリットル抗体バッファー（最終10％血清）に5ミリリットル血清を追加して、再蒸留水でロバ血清を再構成することにより、ブロックを準備します。
- 抗体緩衝液+ 1％BSA中で抗体を希釈することにより、一次および二次抗体溶液を調製する。推奨される希釈液を二次抗体（一次抗体を高めるために使用される種に対するCy3or OG488結合ロバ抗体）のための一次抗体のため1:50-1:2,000と1:1,000-1:5,000です。
- 二重蒸留水に2.5 mg / mlのを混合することにより、DAPIの株式を準備し、-30℃で凍結した8μlの分量を保存する注意：DAPIを計量し、一定分量に分配する際には手袋を着用し、有毒なDNA結合色素である。
- 0.3ミリリットル1、200 mgのN-プロピルガレートを混合して10ミリリットル封入剤を準備し、Mトリス、9、2.7ミリリットル15ミリリットルコニカルチューブ内の蒸留水。溶解するまで約10分間65℃で加熱する。7ミリリットルグリセロール、よくDAPIや渦の8μlの分量を追加します。分量培地1.5ミリリットルチューブに、ホイルで包んで4℃、暗所に保管して（空気と光の両方がメディアを劣化させる - それはより黄色になると、バイオハザード廃棄物に捨てる）。注意：N-プロピルガレートは、計量しながら、手袋を着用し、反応性抗酸化剤である。
- 4℃（ハードフィックスのための一夜が望ましい）で、室温で1時間、または一晩ブロックによる染色ジャーにスライドを転送します。ワームを失わないように揺れないようにしてください。
- 転送は、100〜500μlの一次抗体で加湿皿に、トップの各フラットスライドし、一次抗体や場所にJARを染色するためにスライドさせる。振とうせずに4℃で一晩スライドをインキュベートします。
- 一次抗体のインキュベーション後、転写は、PBSのジャーにスライドを染色する。
- 4℃で、濾紙や店舗が並んで漏斗を通してブロックをフィルタリングし、滅菌濾過した1〜2週間毎場合、ブロックは1カ月以上のために再利用することができます。同様に、フィルタおよび保存（染色の最大10回以上の場合）再利用のために4℃で一次抗体。
- すすぎは、抗体緩衝液中で3回（〜20分毎）にスライドする。
- 光を通さない染色容器に、二次抗体にスライドを置き、4℃で、室温または一晩で4時間インキュベートする
- 転送は、PBSの瓶を染色するためにスライドさせる。フィルタと（染色の最大10回以上の場合）、再利用のため4℃で二次抗体を保存します。
- すすぎは、抗体緩衝液中で3回（〜20分毎）にスライドする。
- 転送は、PBSにスライドしてマウントする準備ができるまで（数分から一晩4℃）PBS中にしておきます。
- スライドの前面にワームが濡れて滞在するように、個々のスライド上で急速に働く。ワイプ、ペーパータオルの上に置いて、糸くずの出ないとスライドのPBS、乾燥後ろから1のスライドを削除します。
- ワーム以上の封入剤の代わり〜20μlの培地およびPBSをほぼ等しい部分が2溶液を混合する優しくスライドとチルトスライドにありますように。 CAUTION：封入剤毒性が強い。
- チルトスライドので、つや消しエッジが低くなり、溶液がフロスティングの近くで収集し、その溶液に24×60ミリメートルのカバーガラスの一端を配置します。
- 優しく（漂白を向上させ、視聴を中断させる）の気泡を最小限に抑えるためにカバースリップを下げる。気泡が形成した場合、ワーム間でカバーグラスをスライドさせずに relower、ゆっくりとカバースリップの端を持ち上げます。
- 慎重に糸くずの出ない拭いてエッジを圧縮することにより、カバースリップを移動せずにスライドの端をオフに乾燥させます。スライドの比較的乾燥したエッジはすべてカバースリップの縁の周り表示されている必要があり
- マニキュアの2〜3層でカバーグラスをシール。スライドを、光から保護するために、調製および貯蔵中に平坦なスライドホルダー中に配置することができる。スライドがよく密閉し、乾燥した後、スライドのカバーガラスとバックを清掃してください。
- よく密封されたスライドは、-20℃で4℃、または週で日間暗所に保存することができます長い期間、DAPI STAオーバーDNAの最も緑の色素（ 例えば 488nm励起）フェードのining。いずれの油浸レンズを使用した後、必要に応じてより多くのマニキュアなどでカバーガラスを再シール。
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Representative Results
ワームが適切に圧縮ひび割れ、軽く固定した場合、事実上、全体のワームは、抗体染色がアクセスすることができます（ 図2を参照）。 DAPI染色によって示されるように、核の位置は、ワームの部分がワームをホルムアルデヒドなどの硬い固定液に供された場合の不自然波状の出現によって示されるように、ワームの形態は（歪む無傷であるかを示す図3A〜Dの筋肉）。別の一般的な問題は、特定の組織の不均一な固定又は浸透である。この例は、筋肉がDNA染色を含む他の染色の存在は、（本体の少なくとも一部が存在したことを示しているという事実にもかかわらず、唯一のウォームの一部に染色され、図3E-Hに示されているすなわち 、凍結割れ）の間に除去されない。全体の配電のように、部分的な染色の結果として生じるパターンは、容易に、実際に同定することができる染色上の任意の単一のワームが不均一な染色を示している場合であっても決定することができる。
凍結割れ任意定着条件を用いて遭遇する共通の問題は、最終的な図（ 図4）に示されている。最も一般的な問題は、圧縮時2スライドの相対的な動きへの試料のねじれている。ワームの本体は咽頭のちょうど後方にねじれているという事実は、染色された組織の形態によって見ることができる。この画像はまた、ポリリジンコーティングにスライドを貼り抗体に、バックグラウンド染色に問題があることを示しています。これらの画像の全てが細胞生物学研究室コースの大学生の第抗体染色の試行中に行われたスライドを用いて収集したことに留意されたい。でも、実際に、多くの個々のワームは、図4に見られるような問題が表示されます。ただし、いずれのスライドに、 図2と図3に見られるようなワームは、財団ことができますDと検討した。
図1。手順の概要。完全凍結割れの手順を実行する手順を示すフローチャートを。ワームの様々な固定条件と番号の選択肢が示されます。
図2。軽く固定、よく染色されたワームメタノール-アセトンで固定し、複数の抗体および色素で標識された2大人の雌雄同体のヘッドであって、a）一次抗体）（コリンアセチルトランスフェラーゼをチャットにし、Cy3結合二次抗体、B）は 、DAPI（青DNA） 、C）鉱石グリーン488-抗GFP（緑色蛍光タンパク質）坤、D）は 、オーバーレイ（2コリン作動性マーカーと、Cy3で抗チャットとCy5で抗VAChT（小胞アセチルコリン輸送体）赤で示されて）を示している。このトランスジェニック株（PS4657）は咽頭頂端接合部で見つかったGFPとAJM-1の間の翻訳融合を表現しています。画像は、共焦点画像の系列の最大投影である。スケールバーは50μmである。
図3。ホルムアルデヒド関連歪みホルムアルデヒド固定のCy3-ファロイジンで染色した成人（繊維状アクチンを結合する）、DAPI（青DNA）、およびオレゴングリーン488-抗GFP。AD）体のフール画像だけで外陰部の後方（左端）同じ線虫で、原因の歪みを不自然に波状の形態を示した固定によってduced。A）は赤-ファロイジンはわずかに不規則筋形態を示す。B）核（青）に均一にウォーム全体に広がっている。C）グリーンの原形質膜におけるCED-1 :: GFP融合タンパク質の分布を示しているLIM-7プロモーター（ひずみMD701）で駆動される性腺鞘細胞。D）は 、これらの3色素のオーバーレイを表示します。EH）の標識は、同一の線虫に異なる色素で変化することができる。E）ファロイジン（赤）の一部だけをラベルワームの片側の筋肉。F）核（青）不均一な強度で染色されたが）（ワームを通じて存在している。G）OG488-抗GFPは、コラーゲン-19を標識する:: GFPの側のキューティクル中筋肉が一面に染色存在するがないことを示す、複数の中央筋肉組織の染色を欠いているワーム。H）は、3つの色素のオーバーレイを表示します。画像は最大である共焦点画像の一連の位側の投影は、スケールバーは50μmである。
図4。 Aで染色された圧縮歪みに関連する。ホルムアルデヒド固定幼虫）Cy3標識ファロイジン（繊維状アクチンに結合する）、B）DAPI（青DNA）、C）、オレゴングリーン488、抗-GFP、D）のオーバーレイ。ちょうど咽頭の後部車体ねじれは、身体の残りの部分の上の緑の排泄細胞および腹側神経索の断面として、明らかである。高いバックグラウンド染色もCy3でphallodinとは明らかである。この株は、排泄細胞で主に位置するVHA-8 :: GFP融合タンパク質を発現する。スケールバーは50μmである。画像がスライド（高バックグラウンド染色につながる）の表面に拡張焦点画像の一連の最大投影である。
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Discussion
凍結割れプロトコルは、Cの抗体染色のためのいくつかの方法の一つである虫。これは、ワームを染色するための比較的簡単な方法を提供していますが、最適な結果を得るための具体的な試薬と実践を必要としません。 （ 図1に概要）の重要なステップは、1）ステップ1と線虫の2）マニュアルの圧縮（ステップ2および3を参照のこと）迅速な固定をする（ステップ3）を参照してください（準備をスライドさせます。まず、スライドに線虫の付着を最大化するためには、高分子量（長いポリマー）ポリリジンのではなく、商業的に準備されたスライドに頼るとスライドを用意することをお勧めします。凍結割れスライド全体の線虫の角皮に付着するように設計されている間コマーシャルスライドを、細胞が付着できるようにするために、ポリリジンでコーティングされている。第二に、凍結前スライド間のワームを正しく圧縮するための手順は非常に重要です。それは、正しい量を使用して一緒にスライドを押すように着実に手と練習が必要個々のワームはその形態を破壊することなく、両方のスライドを接触するように圧力。多すぎても少なすぎても、圧縮のいずれかが定着時のワームの増加損失につながる。さらなる注意が互いに対してスライド移動させることなく、凍結のためにドライアイス冷却された表面上にスライドを移動させるために必要とされる。任意のこのような運動は、ワームが破れたり、ねじったりする原因となります。第三に、任意の固定技術と同様に、凍結されたワームは、解凍前固定液に直接配置する必要があります。そうでなければ、抗原は、細胞内局在についての誤解を招く情報を提供し、拡散することができる。これらの重要なステップは、すべて適切に行われている場合、最良の結果を得るためには、最良の形態を持つワームを見つけるためにいくつかの染色スライドをスキャンすることが依然として必要である。
この技術の1つの態様は、不可避ワームが一次元に圧縮されることである。圧縮はz軸でのラウンドボディの見かけの直径だけ一から四かもしれ成人において最も顕著であるx軸とy軸で見られる目。この圧縮は、小さな幼虫が低下する傾向があり、胚において無視することができる。原因住む線虫は、スライドの準備中に移動する方法に、染色されたワームは、多くの場合、彼らの側にある。これは横方向の正中線が汚れワーム（ 図2-4を参照）の中央を下方に拡張する横で、寒天皿上でワームの向きを模倣。したがって、圧縮は横寸法が一般的である。これは実際に（試験片の詳細を同時に焦点になります）、標準の蛍光顕微鏡が容易になりますが、それは3次元再構成が正確ではないことを意味します。
任意の抗体染色と同様に、結合の特異性を確認することが重要である。ほとんどの種では、このような親和性があなたの枯渇抗体またはプライマリを使用していないなどのコントロールによって行われます。 Cで虫、特異性をチェックする、より具体的な手段は、多くの場合、ご利用いただけます。目的の遺伝子やタンパク質のヌル変異体が提供染色の特異性の優れた制御。染色は通常、固定依存しているため、両方の株は、比較の前に同一の条件下で固定してください。ヌル変異体が利用可能でない場合、それはCで比較的容易であるRNAiは（RNA阻害12）とタンパク質レベルを減少させ、RNAiの治療ワームズ減少染色を探すために虫 。
ポリクローナル抗体は、しばしば、抗原との親和性精製場合であっても、非特異的染色を示す。多くの場合、メタノール、アセトンを用いた固定が（それらを沈殿させるのではなく、それらを架橋することによって、タンパク質を固定している）（様々な架橋のために以上の変異エピトープを生成する）、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドよりも低い非特異的な染色1,11を与えます。しかし、Cのエレガンス非特異的染色は、特に腸内で、任意の固定条件下で非常に一般的である。あなたの抗原が腸内で発現される場合、この非特異的な染色は、特定のstainiをマスクすることができるNG。ヌル変異体は目的タンパク質に利用可能である場合、この方法で固定ワームは、血清を枯渇アフィニティーするために使用することができる。抗原性は、固定条件に依存するので、あなたの抗体を枯渇するために使用するワームには、染色された野生型のワームと同じように準備する必要があります。非特異的染色、変異体および野生型線虫の枯渇の一ラウンドの後、優れた制御のために枯渇血清と並行して染色することができる。変異体と枯渇のさらなるラウンドは、必要に応じて行うことができる。
この手法は、様々な条件下で特異的な染色のための新たな抗体をテストするのに非常に便利です。これらは、C.に対して生成抗体であってもよい虫タンパク質または他の種から保存されたタンパク質に対する抗体。このメソッドは軽く固定線虫で最高の形態を提供しますが、もしあれば、具体的な結果を与えるどのような条件を決定するために固定剤の範囲を試すことは比較的簡単ですS。ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドを使用してハード固定するための他の方法とは異なり、酵素的または還元治療は、試料調製のために必要とされない。これらの治療は、抗原性を減少させることができるので、これは特異的抗体およびそれらの最適な定着条件を同定する能力を増加させる。ハードな固定条件が最適に機能する場合は、実験者は、その後（私たちの以前の研究4にまとめた）より良い形態を得るために、完全なワームで実行する方法に変えることができます。光固定が抗原性を保持している場合、この手法は、光学顕微鏡のためのすべてのさらなる染色に使用してもよい。
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Disclosures
著者は、彼女が競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
資金は、NSF CCLI番号0633618とオハイオ大学によって提供されました。いくつかの株は、線虫の遺伝学センターから提供された。大学院生Reetobrata Basuさんは、ビデオに表示されます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| poly-L-lysine slide (ESCO brand) | Fisher | 12-545-78 | Sigma brand slides also suitable |
| poly-L-lysine hydrobromide | Sigma | P1524 | IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical |
| single frosted edge slides | Fisher | 48312-002 | Other brands are suitable |
| sodium azide | Sigma | S2002-25G | TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution |
| coplin staining jar | VWR | 47751-792 | Other brands are suitable |
| 5-slide mailer | Electron Microscopy Science | 71549-01 | One of many different brands of small slide holder, suitable for staining |
| Paraformaldehyde | VWR | MK262159 | IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water. |
| Glutaraldehyde solution, 25% in water | Sigma | G 5882 | IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water. |
| Triton X-100 | VWR | EM-9410 | Other brands are suitable |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | ICN820451 | Other brands are suitable |
| Donkey Serum, lyophilized | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | Other brands are suitable |
| Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling | Jackson Immunoresearch | 715-165-150 | This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody). |
| n-propyl gallate | Fisher | ICN10274750 | Other brands are suitable |
| DAPI, 4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma | D 9542 | TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure |
| Whatman #1 15 cm diameter filters | Fisher | 09805G | |
| Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm | VWR | 48393-252 | #1 1/2 thickness is optically best |
| Microscope slide folder | VWR | 48429-092 | Other brands are suitable |
References
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