Antikor boyamasında Published: October 14, 2013 doi: 10.3791/50664

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Janet S. Duerr¹

¹Department of Biological Sciences, Ohio University

Summary

"Freeze-kırma," nematod C iç dokuları sergilemek için bir yöntem protein lokalizasyonu için antikorlara elegans, gösterilmiştir.

Abstract

C leke antikorlar ile elegans, nispeten geçirimsiz manikür kimyasal veya mekanik yöntemlerle atlanmalıdır. "Freeze-çatlama" fiziksel, iki yapışık slaytlar arasındaki nematod sıkıştırarak onları dondurma, ve ayrı slaytlar çekerek nematodlardan manikür çekmek için kullanılan bir yöntemdir. Dondurarak çatlama kimyasal muamele olmadan dokulara erişmek için basit ve hızlı bir yol sağlar ve fiksatif çeşitli kullanılabilir. Ancak, bu örneklerin birçok kaybına yol açar ve gerekli sıkıştırma mekanik olarak örnek deforme eder. Pratikte iyi bir morfolojisi olan numunelerin kurtarma en üst düzeye çıkarmak için gereklidir. Dondurarak çatlama özel sabitleme koşulları, numune kazanımı veya düşük spesifik olmayan boyama için optimize edilmiş, ancak tüm parametreler için aynı anda olabilir. Çok sert sabitleme koşulları gerektiren ve kimyasal manikür permeabilize için gerekli kimyasal tedaviler, Arıtma tahammül antikorlarınçözelti içinde sağlam nematodların t tercih edilebilir. Antikor hafif bir düzeltme gerektiren veya optimum sabitleme koşulları bilinmediği takdirde, dondurularak çatlama hızlı bir antikor ve tahlil, ilgi konusu antijen için spesifik hücre içi ve hücre lokalizasyonu bilgi verebilir çok yararlı bir şekilde kalmasını sağlar.

Introduction

Proteinlerin hücre ve hücre içi lokalizasyonu belirlemek için, bilim adamları, belirli geleneksel özellikle ¹ proteinleri tanıyan seçilmiş antikorlar ile dokuların etiketli var. C gibi bazı model organizmalar elegans, antikor boyama, genellikle daha hızlı sonuç moleküler genetik teknikler ile değiştirilmiştir. Bunlar, promotör ve ilgi ve yeşil floresan protein geninin kodlama bölgeleri arasında gen füzyonlarının oluşan yapıları ile transforme organizmaları içerir. Bununla birlikte, moleküler teknikler doğru promotör ve yüksek kopya sayısında (C. elegans alışılmış teknikler) ^2,3 at yapıları ifadesindeki değişiklikler bilerek ile ilgili sorunlar gibi eşyaların, bir dizi tabidir. Bu nedenle, antikorlarla boyama in vivo protein işlevi araştırmalarında pek çok bilim adamı için bir hedef olmaya devam etmektedir.

Antikorları ile dokular boyandığında, zor olabilir çünkü birantikorlarının verilmesinin sadece belirli bir konformasyonda ¹ kendi antijeni tanıyabilir. Örneğin, antikorlar belirli bir şekilde sabit, sadece denatüre ya da sağlam antijeni tanıyabilir ve yerinde antijeni tanımayabilir. Nematod antikor lekelenme problemi nematodun kütikül dokulara antikor erişimi engelleme, nispeten geçirimsiz bir bariyer oluşturur gerçeği ile daha da artmaktadır.

C. antikor lekeleme için kullanılan birkaç farklı yöntem vardır elegans (önceki çalışmaları gözden ^4). Sağlam leke 'solucan' yöntemleri donma ve nispeten sert sabitleştirici (formaldehit ya da glutaraldehit) olarak çözülme geliştirildi; donma-çözülme döngüleri sabitleyici ⁵ hızlı nüfuz etmesini sağlamak için manikür çatlamak yardımcı. Yöntem maddeler, kolajenaz ya da her ikisi ^5-7 azaltılması ile tedavisi dahil, tespit edildikten sonra, kütikül antikorun girmesine izin vermek üzere permeabilize edilmiştir. Bu treatments morfolojisi korunmuş, ancak genellikle antikor tanınmasını azalır ya da yok. Alternatif yöntemler, antikor girmesine izin vermek üzere diseksiyon ⁸ içerir.

"Freeze-kırma" Antikor ^9-10 boyama sağlamak için yarı sağlam solucan iç kısmına erişmek için bir yoldur. Kollajenaz ve azaltma tedavisini kaçınarak Freeze-çatlama tespit çeşitli koşullar ile yapılabilir. Nematodlar, iki yapıştırıcı slaytlar arasında yerleştirilmiş dondurulur ve daha sonra slaytlar ayrılır, alt slayt üzerinde nematod çoğu ve üst kızak üzerindeki kütikül çok ayrılıyor. Alt sürgü sabitleyici yerleştirilebilir ve yapışık nematodlar ile tüm kaydırma antikor lekeleme prosedürü aracılığıyla aktarılır. Yöntem mevcut iki büyük zorluklar yok. İlk olarak, bu ciddi bunları deforme olmadan nematod bölmek için gerekli olan basınç, doğru miktarda uygulamak zordur. İkinci olarak, solucanların çok s olmazya slayt kene ve sabitleştirici veya durular kaybolur. Ancak, uygun slaytlar ve uygulama ile, yöntem, hızlı bir şekilde tespit ediciler ve antikorların çeşitli kullanılabilir makul bir morfolojisi olan nematodlar verecektir.

Yöntem, deneyci amacına bağlı olarak, biraz değiştirilebilir. Tek bir nematod boyama (örneğin, tek bir transformant antikoru boyamasını değişmiş olup olmadığını belirlemek için) isteniyorsa, o zaman maksimum yapışma ile slaytlar (ancak yüksek bir arka plan boyaması) (aşağıya bakınız) bu tür ilave polilisin ile laboratuarda hazırlanmış slaytlar olarak kullanılabilir. Nematodlar, bu tespitler sonra polilisin daha zayıf bağlı Başlangıcı formaldehid veya glutaraldehid tespit için, daha yüksek bir yapışma slaytlar (laboratuar hazırlanan slaytlar polilisin) kullanılmalıdır. Vahşi tip nematodları, metanol ve / veya aseton ile tespit edilmektedir, daha sonra daha düşük bir yapışma özelliğine sahip slaytlar ve alt arka plan boyaması kullanılmalıdır (ticari veya l) slaytlar aboratory hazırlanmış. Antikorlar ve fiksatif çeşitli laboratuarda kullanılıyorsa, slaytlar bir seçim vaktinden önce hazırlanabilir ve gerekli olana kadar saklanır.

Nematod dokuya erişim elde edilmiştir sonra, antikor, boyama işlemleri (daha uzun dokuların karakteristik inkubasyon yerine hücreleri ^1,11) ile standart yöntemler takip edin.

Protocol

NOT: Birden fazla protokol adımları set-up ve deney özel koşullarına bağlı olarak hazırlanması için seçenekleri ile sunulmaktadır. Bu gibi durumlar için, alternatif adımlar alternatif adımlar Protokol, Şekil 1 'de ana hatları ile A, B, C, vb olarak sunulmuştur.

1.. Polilisin Kaplı Slaytlar hazırlanması

Slaytlar üç farklı hazırlama, göreceli yapışma ve antikorun spesifik olmayan bağlanma kolaylığı arasında arzu edilen ticaret-off bağlı olarak kullanılabilmektedir. Slayt hazırlama alternatifleri Detaylar yapışma ve karmaşıklığı artan sırayla adımları 1A-1C aşağıda verilmiştir. Bu farklı yöntemlerle hazırlanan slaytlar bir deneme için birlikte kullanılabilir.

1A. Hayır slayt hazırlama

Ticari olarak temin edilebilen polilizin kaplı slaytlar düşük yapışma ve düşük arka plan sağlamak.

1B. Slayt prmetanol-aseton fiksasyonu Ayırma optimum

Orta yapışma ve düşük arka plan.

1. Slaytlar daldırma için bir polilisin çözelti hazırlayın: Çok yüksek moleküler ağırlığa sahip 400 mg ekleme - iki kez damıtılmış su, 200 ml (150,000 300,000 D), poli-L-lizin. Koruyucu madde olarak 2 ml% 10 sodyum azid stokları (nihai konsantrasyon% 0.1) eklenir. DİKKAT: kuru sodyum azid reaktiftir ve her türlü zehirlidir. Ağırlığında toz çift distile su içinde% 10 stok yapmak için ise maske ve eldiven giyin.
2. Tüy bırakmayan mendil, kaldırma leke ve partikülleri ile tek uç buzlu cam slaytlar silin. Bu atama ile satın slaytlar bile yapılmalıdır "önceden temizlenir."
3. Yeri back-to-back slayt tutucu, coplin kavanoz veya diğer slayt boyama kap, (daha sonra ayırma kolaylaştırmak için) kadar ve oldukça mükemmel hizalanır buzlu kenarlarını tutmak kayar. % 70 etanol ile (reaktif derecesi alkol gerekli değildir) di% 1 HCI ile ile çanak içinde dilim tutucu yerleştirinsu dindirdi veya buzlanma seviyesine boyama kavanoza doldurun. 5 dk arasında, en az bir çözüm slaytlar sallayın. DİKKAT: Bu çözüm yıpratıcıdır, eldiven giyin. Not: Bu çözelti, (birkaç ay kadar) birkaç kez tekrar edilebilir.
4. 1 dakika için damıtılmış su içinde çalışan slaytlar durulayın.
5. 30-60 dakika boyunca 40-60 ° C fırın içine koyarak ya da oda sıcaklığında gece boyunca tutarak ya da bir toz ortamda tamamen kuru kayar.
6. 15 dakika rocker (unfrosted bölümlerini kapsayan) polilizin çözüm slaytlar inkübe.
7. Slaytlar kurumasını tekrarlayın.
8. Polilizin çözüm inkübasyon ve kurutma adımları tekrarlayın.
9. Böyle ince bir tartı spatula gibi bir ince metal bir nesne kullanarak slaytlar ayırın. Bu şekilde yapıştırılmış, bunlar ayırmak zordur. Uygun güvenlik ekipmanları (gözlük) giyin ve slaytlar ayrılmış küçük cam bit gevşek uçabilirsiniz beri, (kullanım sonrası atılmalıdır) tezgah üst kağıt üzerinde çalışır.
10. Temiz mağaza slaytlar4 ° C (tozsuz) slayt kutusu kadar gerekli.

1C. Formaldehit tespiti için hazırlık optimumu Slide

En yüksek yapışma ancak yüksek arka plan.

1. (Hava kurutma için) (fırında kurutma), tozsuz, fırın güvenli tabak veya düz bir tozsuz bir yüzeye yöntem 1B düz ile hazırlanan yer slaytlar.
2. Her slaytın ortasında polilizin çözümün bir 20-60 ul damla yerleştirin.
3. Tamamen bir fırında ya da oda sıcaklığında kuru kayar. Buharlaşır gibi polilizin soluk oval geride bırakacaktır. Bu oval çok yapışkan vardır. Ne yazık ki, bu aynı zamanda da bloke edildikten sonra, birincil ve ikincil antikorlar ile bağlanır.
4. 4 ° C'de temiz (tozsuz) slayt kutusuna mağaza slaytlar kadar gerekli.

2. Dondurulmuş Nematod Slaytlar hazırlanması

Tamamen (nematod plakaları) yöntemi 2A kullanılarak bakteri ya da ile durulanarak boyanması için nematod hazırlanması2B (bireysel nematodlara).

2A. Nematod slaytların plakalarından hazırlanması

1. Prechill kuru buz üzerinde yassı bir metal parça yerleştirin.
2. Bir 1.5 ml mikrofüj tüpe bakterilerle NGM levhadan solucanlar durulamak için damıtılmış su ve bir cam pipet (solucanlar kayıplarını azaltır) veya mikropipet kullanın. Plakalar yaşları senkronize ya da karışık olabilir; gerekli olmadıkça (kırılması zor) birçok dauers ya da açlıktan solucanlar (artmış otofloresansı) ile tabak kullanmayın.
3. Bakteri ücretsiz kadar distile su ile Worms 3-4x durulayın. (Solucan kaybını azaltmak için aynı cam pipet kullanın.), Ya solucanlar pelet onları (tüpün dibinde çoğunlukla yetişkin toplamak için) 3-5 dakika bankta oturmak ya ~ 1,000 rpm'de 30 saniye dönmeye izin vermek için (~ 500 Bir masaüstü santrifüj g) () yetişkin, larva ve embriyoların toplamak.
4. Solucanlar gibi suyun yaklaşık iki katı hacmi bırakarak, solucanlar ile borusundan su en çıkarın (ama en az 25 ul toplam hacmi).
5. Mevcut düzenli (sildi temiz ama polilizin tedavi değil) "top" slaytlar eşit sayıda var.
6. Yer ~ "alt" yapışkan slayt ve pipet ucu yan kullanarak slaydın orta kısmı boyunca solucanları içeren sıvıyı yaymak su içinde 25 ul solucanlar.
7. Solucanlar 30 sn dk 2 için halledelim. Slayt uygun yapışkan ise, onlar slayt temasa olarak, solucanlar uçları sopa olacak.
8. Bir yandan alt slayt tutun ve buzlu parça ama tüm örtüşen böylece alt slayt üzerinde üst slayt yerleştirin. Solucanlar hala biraz hareket, böylece sıvı, biraz ayrı slaytlar tutmalı slaytlar birbiri üzerinde kaymasına izin vermeyin -. Bu solucanlar katlanmış.
9. Dikkatle s düz bastırınhafifçe üst slaytta, her elin başparmak ve işaret parmağı ile. Basınç ideal miktarda, slaytlar kenarında büyük çift cinsiyetli bir kaç yetişkin ve larvaların çoğu her slayt irtibata olurken, kırılacak ama sağlam kalacak.
10. Hemen ve dikkatlice (kaymadan) kuru buz üzerinde metal parçası üzerinde slaytları koydu. Slaytlar bir dakika içinde dondurulur görünmelidir. Iyice donmuş kadar 5 dakika boyunca kuru buz üzerinde tutmak.
11. Bu noktada, slaytlar birkaç gün boyunca -80 ° C'de bir etiketli kutuda saklanabilir. (Onlar -80 ° C'de hafta tutulursa, su uzak yüce başlayacak ve solucanlar gibi leke olmayacak). Slaytlar -80 ° C'de saklanır, bunları çatlama önce 10 dakika boyunca kuru buz 'ısınmak' let.
12. 3 (fiksasyon) adıma geçin.

2B. Bireysel nematod slaytların hazırlanması

1. Çökeltmek için kuru buz üzerinde yassı bir metal parça yerleştirintepe.
2. Bakterilerden onları özgür bir NGM plaka üzerinde bir damla su bireysel nematod aktarmak için bir solucan cımbızı kullanın. Nematod (ler) eğer mümkünse, otoflüoresanı azaltmak için iyi beslenmiş olması gerekir. Gerektiği gibi solucan (ler) bakteri özgür olana kadar suya yeni noktalar transfer tekrarlayın.
3. Sonraki kuru buz, etiket tarafı yukarı konteyner için tezgahın üzerine silinmez mürekkep ve yer slaytlar ile "alt" polilizin slaytlar buzlu tarafını etiketleyin. Daha az yapışkan "top" eşit sayıda mevcuttur (işlenmemiş) slaytlar var.
4. Polilisin ile iki muamele edilmiş alt sürgünün bölgeye su 5-10 ul damla yerleştirin. Daha solucanlar transfer eğer tamamlanmadan önce buharlaşan su önlemek için, daha büyük bir hacmi kullanın.
5. Solucanlar yapışkan slayt yüzeyine dokunmak doğru batarken izlemek için mikroskop kullanarak, solucan almak ile su damlasına solucan (ler) aktarın. Damla başına birçok + 20 olarak solucanlara kadar az bir solucan aktarın.
6. Alt s tutunbir yandan lide ve buzlu parça ama tüm örtüşen böylece alt slayt üzerinde üst slayt yerleştirin.
7. Hemen ve dikkatlice (kayma veya sıkıştırma olmadan) kuru buz üzerinde metal parçası üzerinde slaytları koydu. 5-30 dakika boyunca kuru buz üzerinde tutun. (Slaytlar kolayca kurumasına gibi, bu slaytların uzun süreli tutmayın.)
8. 3 (fiksasyon) adıma geçin.

3. Tespit

Sabitleyici iki çökeltilmesiyle "düzeltme", hücrede yer antijen ("hafif tespit") ya da çapraz bağlama ("sert tespit") antijen için gereklidir. Fixation antijenitesini bozabilir; en bilinen antikorlar belirli bir sabitleme koşulu ile iyi çalışır. Yeni antikorlar için, sabitleme koşulları, bir dizi test edilmelidir.

Herhangi bir tespit için ilk aşama, fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisi yapmaktır. Yöntemi A (ışık kullanarak antikor boyama nematod ile sonraki düzeltme slaytlarmetanol ve aseton) veya B (formaldehit ya da glutaraldehit kullanılarak sert düzeltme) sabitleyin.

1. 80 g NaCl, 2.0 g KCI, 27.2 g ₂ HPO ₄ • H Na ekleyerek steril 10x PBS (fosfat tamponlu tuzlu su) bir stok çözelti hazırlayın ₂ 0, 2.4 g KH ₂ PO _4, 20 ml% 10 sodyum azid hazır. Bu stok solüsyonu yapmak için, iki kere damıtılmış su içinde% 10 çözelti yapmak için sodyum azid toz tartmak. Çözülene kadar yumuşak ısı ile tuzlu su karıştırın. DİKKAT: kuru sodyum azid reaktiftir ve her türlü zehirlidir. Kuru sodyumazid veya çözümleri ile çalışırken maske ve eldiven giyin.
2. 1-10 M NaOH ile 7.2 'ye tuzlu serin (Tris pH duyarlı sıcaklığı) alalım, sonra pH. Çift distile su ve sterilize etmek için otoklav ile 1 L Top. Oda sıcaklığında saklayın ve steril çift distile su ile gerektiği gibi 1x sulandırmak. DİKKAT: NaOH kostik - Kullanım sırasında eldiven giyin.

3A. Metanol-aseton kullanılarak ışık düzeltme

1. En az 10 dakika boyunca buz üzerinde prechill boyama kavanoz içinde% 100 metanol,% 100 aseton ve 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) koyun. DİKKAT: Metanol ve aseton, toksik eldiven giyin.
2. , Kuru buz alt ve üst slaytlar bir çift almak hızla onları ayrı büküm ve hemen 2 dakika süreyle buz soğuk metanol "alt" slayt batırmak. "Top" slayt atılabilir.
3. 4 dakika boyunca soğuk aseton buz metanolden slaytlar aktarın. Slaytlar çok solucanlar olsaydı, (% 90) en çok bile iyi hazırlanmış slaytlar ile, düzeltme kapalı düşecek. Tek solucan slaytlar düzgün hazırlanmış olsaydı, solucanlar yapışık kalmalıdır.
4. Yerleştirin veya PBS (fiksatif durulayın) ile kavanoza slaytlar daldırma ve 4 (lekelenme) adıma geçin.

3B. Formaldehit ya da glutaraldehit kullanılarak sert düzeltme

1. % 0.5-4 nihai konsantrasyona kadar 1x PBS içinde reaktif dereceli formaldehit veya glutaraldehit çözeltisi ile seyreltilir. Bu süspansiyonun tam bölenleri (1.5 mi) may sıkıca -20 ila -30 ° C'de şapkalı saklanabilir, sadece kullanmadan önce buz üzerinde hacimde defrost. NOT: formaldehit çözeltiler, zaman içinde ve havaya maruz kalma ile bozulmasına yol açar. DİKKAT: formaldehit ve glutaraldehit eldiven ve kaputu çalışmak, zehirlidir.
2. , Kuru buz alt ve üst slaytlar bir çift almak hızla onları ayrı büküm ve hemen kapaklı düz çanak solucanlar ile "alt" slayt yerleştirin. (Üst slayt atılabilir).
3. Hemen solucanlar ile slayt alanının merkezi üzerinde 200 ul toksik Fiksatif pipetle. Sabitleştirici kısmen slayt daha büyük bir bölgeyi kapsayacak şekilde eritmek, sonra yerde dondurdu.
4. Solucanlar tamamen fiksatif ile kaplı değilse, derhal ve dikkatli bir mikropipet kullanarak daha fazla fiksatif ekleyin. Sabitleştirici slayt kenarına akmasına izin vermeyin.
5. Bir kapak ile çanak Kapak ve 10 dakika için oda sıcaklığında bir gece bekletin. Uzun inkubasyon ar eğer çanak nemlendirilir emin olunkullanılan e - Bu yemeğin katlanmış ıslak tüy bırakmayan bir mendil ekleyerek yapılabilir. Mendiller slaytlar dokunmasına izin vermeyin.
6. Tespit işlemi tamamlandıktan sonra, dikkatli bir şekilde 1.5 ml tüp içine gevşek solucanlarla fiksatif pipet ve PBS ile bir boyama kavanoza slayt daldırma.
7. Pelet 30 saniye boyunca yüksek hızda gevşek geldi solucan ile tüp dönerler. PBS ile iki kez solucanlar durulayın, daha sonra slaytlar üzerinde solucanlar (yerine slaytlar üzerinde daha mikrofuj tüpler, adımları yapıyor) ile paralel olarak işlemek.
8. 4 (lekelenme) adıma geçin.

4. Antikor Boyama

Antikor boyama protokolü slaytlar üzerinde herhangi bir doku için, standart protokollere benzer. Bu protokol, bağımsız olarak 1-3 adımlar olarak hazırlanması tüm slaytlar için aynıdır.

1. 700 ml iki defa damıtılmış su karıştırılarak antikor tamponu hazırlayın, 100 ml 10x PBS, 5 ml Triton X-100 (% 0.5 nihai), 2 ml 0.5 M EDTA, pH 8 (1 mM nihai), 1 g BSA (% 0.1 nihai), 5 ml% 10 sodyum azide çözeltisi (son% 0.05). HCI ile pH 7.2 'ye, daha sonra 1 L iki kez damıtılmış su ekleyin; 4 ° C de saklamak
2. 45 ml antikor tamponu (son% 10 serum) 5 ml serum eklenmesi, daha sonra iki kez damıtılmış su ile yeniden oluşturulması ile hazırlanmıştır eşek serumu ile Block hazırlayın.
3. Antikor tamponu artı% 1 BSA içinde antikor seyreltilmesi ile primer ve sekonder antikor Çözümleri hazırlayın. Tavsiye edilen seyreltme sekonder antikor (birinci antikor yükseltmek için kullanılan türlere karşı Cy3or OG488 konjüge edilmiş eşek antikorlar) için primer antikorlar için 1:50-1:2,000 ve 1:1,000-1:5,000 bulunmaktadır.
4. Iki kere damıtılmış su içinde 2.5 mg / ml DAPI stokları karıştırılarak hazırlanması; -30 ° C de donduruldu 8 ul alikolar içinde depolamak DİKKAT: DAPI, zehirli bir DNA bağlayıcı boya olup tartım ve alikotlara Dağıtım sırasında eldiven giyin.
5. 200 mg n-propil gallat, karıştırılarak 10 ml montaj orta hazırlanması 0.3 ml 1 M Tris pH 9, 15 ml konik bir tüp içinde 2.7 ml iki kez damıtılmış su. Yaklaşık 10 dakika boyunca 65 ° C'de ısı çözülene kadar.De 7 ml gliserol ve DAPI 8 ul alikot ve girdap ekleyin. Tümbölen orta 1.5 ml tüpler içine folyo ile sarın ve 4 ° C'de karanlıkta saklayın (hava ve ışık hem de orta aşağılamak - o daha sarı olursa, Biohazard atık atmak). DİKKAT: n-propil galat ağırlığında iken eldiven aşınma, reaktif bir anti-oksidan olan.
6. 4 ° C (sert düzeltme için bir gecede tercih) oda sıcaklığında 1 saat veya gece boyunca Blok ile bir boyama kavanoz slaytlar aktarın. Kaybetme solucanları önlemek için sallayarak kaçının.
7. Transfer nemlendirilmiş çanağı ve üst 100-500 ul primer antikor ile her düz birincil antikor veya yer slaytlar ile kavanoz boyama slaytlar. Çalkalamadan 4 ° C'de gece boyunca kuluçkaya bırakın.
8. Primer antikor inkübasyon sonunda, transfer PBS kavanoz boyama slaytlar.
9. 4 ° C'de bir filtre kağıdı ile kaplı ve mağaza huniden filtre Block, steril filtre edilir, her 1-2 haftada ise, blok 1 ya da daha fazla ay için yeniden kullanılabilir. Benzer şekilde, filtre ve tasarruf(boyanma kadar 10 veya daha fazla tur için) yeniden kullanım için 4 ° C 'de primer antikor.
10. Durulama antikor tamponu içinde üç kez (~ 20 dk) kayar.
11. Bir ışık geçirmez bir kap içinde boyama ikincil antikor slaytlar koyun ve 4 ° C'de ya da gece boyunca oda sıcaklığında, 4 saat inkübe
12. Transferi PBS kavanoz boyama slaytlar. Filtre ve (boyanma kadar 10 veya daha fazla tur için) yeniden kullanım için 4 ° C'de ikincil antikor kaydedin.
13. Durulama antikor tamponu içinde üç kez (~ 20 dk) kayar.
14. Transferi PBS slaytlar ve montaj için hazır kadar (dakika gecede 4 ° C) PBS içinde bırakın.
15. Slayt önündeki solucanlar ıslak kalmak böylece, tek tek slaytlar hızla çalışın. Bir tüy bırakmayan silin geri slayt kuru, PBS itibaren bir slayt çıkarın ve kağıt havlu üzerinde bir yer.
16. Yeri ~ slayt ve yavaşça iki çözüm karıştırmak için tilt slayt üzerinde orta ve PBS yaklaşık olarak eşit parçalar vardır ki solucanlar üzerinde montaj orta 20 ul. CautION: Montaj orta toksiktir.
17. Tilt slayt yani buzlu kenarı alt ve çözüm buzlanma yakın toplar, sonra çözüm üzerinde 24 x 60 mm lamel bir kenarını yerleştirin.
18. Yavaşça (ağartma artırmak ve görüntüleme bozabilir) hava kabarcıklarını minimize etmek lamel indirin. Kabarcıklar oluşturur, daha sonra solucanlar üzerinde lamel kayma olmadan relower, yavaşça lamel kenarını kaldırın.
19. Dikkatli bir tüy bırakmayan silin ile kenarları sıkıştırarak, lamel hareket ettirmeden slayt kenarından kurulayın. Sürgünün nispeten kuru kenar tüm lamel kenarında görülebilmelidir
20. Oje 2-3 katmanları ile lamel mühür. Slaytlar hazırlanması ve ışıktan korumak için depolama esnasında düz bir slayt tutucu yerleştirilebilir. Slayt iyi mühürlü ve kuru sonra, slayt lamel ve geri temizleyin.
21. Iyi-kapatılmış slaytlar -20 ° C 'de 4 ° C veya haftada gün boyunca karanlıkta tutulabilir Uzun süreler üzerinde, DAPI staDNA ve en yeşil boyalarla (örneğin 488 nm uyarma) fade adencilik. Herhangi bir yağ daldırma lens kullandıktan sonra gerekirse daha fazla oje, örneğin ile lamel kapatın.

Representative Results

Solucanlar düzgün, sıkıştırılmış kırık ve hafif sabit tutulduğunda, hemen hemen tüm solucan (bkz. Şekil 2) antikor boyama için erişilebilir olabilir. DAPI lekelemesi ile gösterildiği gibi çekirdek konumu solucanın parçaları solucanlar formaldehit gibi daha sert bir sabitleyici, tâbi tutulduğu zaman en doğal olmayan dalgalı görünümü ile görüldüğü gibi, solucan morfolojisi (bozulabilir sağlam olduğu gösterilmektedir Şekil 3A-D kas). Başka bir yaygın sorun düzensiz sabitleme ya da belirli dokuların nüfuz. Bunun bir örneği, kas dahil olmak üzere diğer DNA lekeleme boyaması, varlığı, (gövdenin en azından bir kısmı mevcut olduğunu işaret etmesine rağmen, sadece solucan bir kısmında lekelenmektedir Şekiller 3E-H, gösterilmektedir yani) dondurularak ayrılması sırasında kaldırıldı. Kısmi boyama Elde edilen desen uygulama ile kolayca tespit edilebilir, böylece tüm DAĞILIMBoyanma herhangi bir solucan pürüzlü boyamasını göstermektedir bile tespit edilebilir.

Freeze-çatlama herhangi bir sabitleme durumu kullanarak karşılaşılan ortak sorunlar nihai şekil (Şekil 4) gösterilmiştir. En yaygın sorun, sıkıştırma sırasında iki slaytlar nispi hareketine numunenin büküm edilir. Solucanın gövdesi sadece yutak posterior bükülmüş olduğu gerçeği lekeli dokuların morfolojisi tarafından görülebilir. Bu görüntü nedeniyle de antikor slayt kaplama poli-lisin yapışmasını, arka plan boyama ile sorunu gösterir. Bu görüntülerin hepsi bir hücre biyoloji laboratuarı dersinde, üniversite öğrencilerinin ilk antikor boyama girişimi sırasında yapılan slaytlar kullanılarak toplanmıştır Ancak, unutmayın. Hatta bir uygulama ile, birçok ayrı solucan Şekil 4'te görülen problemleri gösterir. Ancak, herhangi bir slaytta, Şekiller 2 ve 3'te görüldüğü gibi, bu solucan foun olabilir,d ve incelenir.

Şekil 1. Prosedürlerin Anahat. Tam donma-çatlama yordamı gerçekleştirmek için gereken adımları gösteren akış şeması. Çeşitli sabitleme koşulları ve solucanlar numaralar için alternatifler belirtilmiştir.

Şekil 2. Hafifçe sabit, iyi boyanmış solucan metanol-aseton içinde sabitlendi ve birden fazla antikor ve boyalarla işaretlenmiş iki ergin hermafrodit bireyler Başkanı: a.) Primer antikor) (kolin asetiltransferazı ChAT ve Cy3-konjüge edilmiş ikincil antikor, B) DAPI (mavi DNA) C) CevherYeşil 488-anti-GFP (yeşil floresan protein) gon, D) (iki kolinerjik işaretleri ile, Cy3-anti-sohbet ve Cy5-anti-VAChT (veziküler asetilkolin transporter) bindirmeyi kırmızı olarak gösterilmiştir). Bu transgenik suşu (PS4657) yutak apikal kavşaklarda bulunan GFP ve ajm-1 arasında bir çeviri füzyon, ifade eder. Görüntüler konfokal görüntülerin dizi maksimal projeksiyonları; ölçek çubuğu 50 mm.

Şekil 3,. Vücudun Cy3-falloidinle lekeli formaldehit ilişkili çarpıtma. Formaldehit sabit yetişkinler (ipliksi aktin bağlar), DAPI (mavi DNA) ve Oregon Yeşil 488-anti-GFP. AD) Fours görüntüleri sadece) kadar sol (vulva posterior bozulma nedeniyle bir doğal olmayan dalgalı morfoloji gösteren aynı nematod içindefiksasyon ile ortaya koyduk. A) Kırmızı-phalloidin biraz düzensiz kas morfolojisini gösterir. B) Çekirdekler (mavi) eşit solucan yayılır. C) Yeşil plazma zarında bir CED-1 :: GFP füzyon proteininin dağılımını göstermektedir lim-7 promoteri (suş MD701). D) tarafından tahrik gonadal kılıf hücre. EH) Etiket aynı nematod farklı boyalarla değişebilir bu üç boyaların kaplamayı gösterir. E) Phalloidin (kırmızı) sadece bir kısmını etiketler düzensiz yoğunluğu ile boyanmış, ancak solucanın bir tarafında kas. F) Çekirdek (mavi)) (solucan boyunca mevcut bulunmaktadır. G) OG488-anti-GFP bir tarafındaki kütikül kollagen 19 :: GFP etiketler bu kas belirten, daha merkezi kas dokusunun boyanmasını yoksun solucan mevcut ama bir yüzeyde boyama değil. H) üç boyaların kaplamayı gösterir. Görüntüler max vardırkonfokal görüntülerin dizi simal projeksiyonları; ölçek çubukları 50 mikron.

Şekil 4. A ile boyanmış Sıkıştırma ilişkili çarpıtma. Formaldehit sabit larva) Cy3-phalloidin (ipliksi aktin bağlar), B) DAPI (mavi DNA), C) Oregon Yeşil 488-anti-GFP, D) kaplaması. Sadece yutak posterior vücutta büküm vücudun geri kalanı üzerinde yeşil boşaltım hücre ve ventral sinir kablosu çapraz olarak, açıktır. Yüksek arka plan boyama da Cy3-phallodin ile belirgindir. Bu soy boşaltım hücresi ağırlıklı olarak bulunan bir VHA-8 :: GFP füzyon proteinini ifade eder. Ölçek çubuğu 50 mikron; görüntüleri (yüksek arka plan lekelenmesine yol) slayt yüzeyine genişletilmiş konfokal görüntülerin dizi maksimal projeksiyonları.

Discussion

Dondurularak-kırma protokol C antikor lekelemesi için çeşitli yöntemlerden biridir elegans. Bu solucanlar leke için nispeten basit bir yol sağlar, ancak belirli reaktifler gerektiren ve optimum sonuçlar için pratik yapar. (Şekil 1'de) Kritik adımlar şunlardır: 1) slayt hazırlama () adım 3 (bkz. adım 2 ve 3) hızlı tespiti (bkz. adım 1 ve nematod 2) elle sıkıştırma bkz. İlk olarak, slaytlara nematodların yapışmasını en üst düzeye çıkarmak için, bunun yerine ticari olarak hazırlanan slaytlar güvenmek, yüksek molekül ağırlığı (uzun polimer) polilisin ile slaytlar hazırlamak için en iyisidir. Dondurma-kırma slaytlar tüm nematod kütikül sopa tasarlanmış ise ticari slaytlar, hücre yapışmasına izin vermek için polilisin ile kaplanmıştır. İkinci olarak, dondurma öncesi Slaytlar arasındaki solucanların doğru sıkıştırma işlemi için önemlidir. Bu doğru miktarda kullanarak birlikte slaytlar basın sürekli elleri ve pratik gerektirirbireysel solucanlar kendi morfolojisi bozmadan hem slaytlar irtibata böylece basıncı. Çok fazla veya çok az bir sıkıştırma ya tespiti sırasında solucanlar artan kaybına yol açar. Ayrıca bakım birbirine göre slaytlar taşımadan dondurma için kuru buz soğutulmuş yüzeyi üzerine slaytlar taşımak için gereklidir. Böyle bir hareket solucanlar gözyaşı veya büküm neden olacaktır. Üçüncü olarak, bir tespit tekniğinde olduğu gibi, dondurulmuş solucanlar buz çözme önceki sabitleyici doğrudan yerleştirilmelidir. Aksi takdirde, antijen hücre içi lokalizasyonu hakkında yanıltıcı bilgi veren, yayılabilir. Bu kritik adımlar hepsi düzgün yapılırsa, iyi sonuçlar için en iyi morfolojiye sahip solucanlar bulmak için birkaç lekeli slaytları taramak için hala gereklidir.

Bu tekniğin bir kaçınılmaz yönü solucanlar bir boyutta sıkıştırılırlar olmasıdır. Sıkıştırma z-ekseninde yuvarlak gövdenin gözle görülür çapı sadece bir-dört olabilir, yetişkin, en çok belirgindirx-ve y-eksenleri görülene th. Bu sıkıştırma küçük larva azalma eğilimi ve embriyolarda ihmal olabilir. Nedeniyle yaşayan nematod slayt hazırlama sırasında hareket yolu, lekeli solucanlar genellikle iki tarafında. Bu yanal orta hat (Şekil 2-4 bakın) lekeli solucanın orta aşağı uzanan yalan ile, agar yemekleri solucanlar yönünü taklit eder. Bu nedenle, sıkıştırma yanal boyutta genellikle. Bu aslında standart floresan mikroskobu kolaylaştırır iken (numunenin daha aynı anda odak noktası olacaktır), bu 3-D rekonstrüksiyon doğru olmayacak anlamına gelir.

Herhangi bir antikor ile boyama gibi, bağlayıcı özgünlüğünü kontrol etmek önemlidir. Türlerin çoğunda, bu tür yakınlık sizin antikor tüketen veya hiç birincil kullanımı gibi kontroller yapılır. C. In elegans, özgüllük için kontrol daha özel yöntemleri çoğu zaman mevcuttur. Ilgi konusu gen ve protein için boş mutantlar sağlarboyama spesifikliği için mükemmel bir kontrol. Boyama genellikle tespit bağımlı olduğundan iki suş, karşılaştırmadan önce aynı koşullar altında sabit olmalıdır. Herhangi bir boş mutant mevcut ise, o zaman C. nispeten kolay RNAi (RNA inhibisyon ¹²⁾ ile protein seviyelerini azaltmak ve RNAi tedavi solucanlar düşmüştür boyama bakmak için elegans.

Poliklonal antikorlar genellikle antijeni ile afiniteyle saflaştırılmış olsa bile, özel olmayan renklenme gösterir. Genellikle, metanol ve aseton (çökeltilmesiyle yerine onları çapraz bağlama proteinleri saptamak olan) kullanılarak ışık tespit formaldehit veya glutaraldehit (çeşitli çapraz bağlanma nedeniyle daha fazla varyant epitopu oluşturmak ki) ^1,11 daha düşük spesifik olmayan bir boyama sağlar. Bununla birlikte, C. elegans spesifik olmayan boyama, özellikle bağırsakta, herhangi bir sabitleme koşulları altında çok yaygındır. Da antijen bağırsakta ifade edilirse, o zaman bu, spesifik olmayan boyama özel staini maskeleyebilirng. Sıfır mutantlan da protein için mevcut ise, o zaman, bu yöntem ile sabit solucanlar serum tüketmek afinite için kullanılabilir. Antigeniklik sabitleme koşulları bağlıdır için, size antikor tüketmek için kullanılan solucanlara boyama edilir, vahşi tip solucan gibi aynı şekilde hazırlanmalıdır. Spesifik olmayan boyama, mutant ve vahşi tip solucanlar tükenmesi bir tur sonra mükemmel bir kontrol için tükenmiş serumu ile paralel olarak boyanmış olabilir. Gerektiği gibi mutantlar ile tükenmesi ek tur yapılabilir.

Bu teknik, çeşitli koşullar altında özel olarak boyanması için yeni antikorları test etmek için çok yararlıdır. Bu C'ye karşı üretilen antikorlar olabilir elegans diğer türlerden Korunmuş proteinlere karşı üretilen proteinleri veya antikorları içerirler. Varsa bu yöntem hafifçe sabit nematod ile iyi morfoloji verir iken, hangi koşulları belirlemek için fiksatif bir dizi denemek için oldukça basit, belirli bir sonuç verirs. Formaldehit veya glutaraldehit, enzimatik indirgeme veya tedaviler kullanılarak sert tespiti için diğer yöntemlerden farklı olarak numune hazırlanması için gerekli değildir. Bu tedaviler antijenitesini azalabilir yana, bu özel antikorlar ve bunların optimum tespit koşulları tanımlamak için yeteneğini artırır. Sert tespit şartları en iyi çalışıyorsanız, deneyci sonra (önceki çalışmalarında ⁴ özetlenmiştir) iyi morfolojisi elde etmek için sağlam solucanlar üzerinde yapılan yöntemlere açabilirsiniz. Işık sabitleme antijenliğini korur, daha sonra bu teknik ışık mikroskopi için tüm diğer boyanması için de kullanılabilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
poly-L-lysine slide (ESCO brand)	Fisher	12-545-78	Sigma brand slides also suitable
poly-L-lysine hydrobromide	Sigma	P1524	IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical
single frosted edge slides	Fisher	48312-002	Other brands are suitable
sodium azide	Sigma	S2002-25G	TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution
coplin staining jar	VWR	47751-792	Other brands are suitable
5-slide mailer	Electron Microscopy Science	71549-01	One of many different brands of small slide holder, suitable for staining
Paraformaldehyde	VWR	MK262159	IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Glutaraldehyde solution, 25% in water	Sigma	G 5882	IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Triton X-100	VWR	EM-9410	Other brands are suitable
Bovine Serum Albumin	Fisher	ICN820451	Other brands are suitable
Donkey Serum, lyophilized	Jackson Immunoresearch	017-000-121	Other brands are suitable
Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling	Jackson Immunoresearch	715-165-150	This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody).
n-propyl gallate	Fisher	ICN10274750	Other brands are suitable
DAPI, 4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	Sigma	D 9542	TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
Whatman #1 15 cm diameter filters	Fisher	09805G
Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm	VWR	48393-252	#1 1/2 thickness is optically best
Microscope slide folder	VWR	48429-092	Other brands are suitable