Abstract
Врожденные процессы развития Drosophila куколки могут смещаться и искажать глаз эпителий способами, которые делают индивидуальное поведение клеток трудно отследить во время съемки живых клеток. Эти процессы включают в себя: сетчатки вращение, рост клеток и организменном движение. Кроме того, нарушения в топологии эпителия, в том числе тонких ударов и складки часто вводят в куколки получают для работы с изображениями, сделать это сложно приобрести в фокусе изображения более чем на несколько омматидиев в одном фокальной плоскости. Рабочий процесс описанный здесь исправляет эти вопросы, что позволяет легко анализировать клеточных процессов во время Drosophila развития куколки глаз. Соответственно, в постановке куколки расположены в буровой изображений, которые можно легко собрать в большинстве лабораторий убиквитин-ДЕ-кадгерин:. GFP и ГМР-GAL4 управляемом БАС-α-катенин: GFP используются для визуализации границ клеток в эпителии глаз 1 -3. После деконволюцииприменяется для флуоресцентных изображений, снятых при нескольких фокальных плоскостях, максимальный выступ изображения создаются для каждого момента времени и улучшено с использованием редактирования изображений программное обеспечение. Выравнивание алгоритмы используются для быстрого стабилизации лишнего движения, что делает индивидуальное поведение клеток легче отслеживать.
Introduction
Соединение дрозофилы глаз характеризуется стереотипной расположения его ~ 750 омматидиев разделенных сотовой решетки-вспомогательных пигментных клеток 4,5. Эти пигментные клетки с рисунком с помощью согласованной комбинации событий: местных движений клеток, клеточного роста, изменение формы клеток и апоптоз. Живая визуализация этого эпителия позволяет изучать молекулярные механизмы, лежащие в основе этих событий в физиологически необходимой и невозмущенной трехмерной контексте.
В отличие от предыдущих протоколов 6,7, методика описано здесь, включает в себя эффективный способ стабилизации посторонние движение ткани, которая не может быть отсоединен от процесса формирования изображения. Этот способ повышает исследований поведения клеток в развивающемся Drosophila куколки глаз эпителия - ткани, который растет, вращается, и сдвиги в течение визуализации. Кроме того движение стабилизация техника деописано здесь, будет полезным для изучения клеток и в других контекстах, где происходит постороннее движение.
Для визуализации границ клеток сетчатки в области Drosophila, трансгенные линии мух, которые были получены выражения Ubi-ДЕ-кадгерин: GFP, а также UAS-α-катенин: GFP под контролем водителя глаз конкретного ГМР-GAL4 1-3. Использование двух GFP-меченый мембранных маркеров позволяет для визуализации границ клеток в нижней интенсивности света. Это сводит к минимуму повреждения тканей и фотообесцвечивание на повторном воздействии высоких энергий длин волн, позволяя увеличенную частоту кадров и продолжительности фильма. Для повышения эффективности RNAi трансгенов, UAS-DCR-2 также включены во второй летучей линии 8.
В третьем обновления из предыдущих протоколов, простой визуализации буровой которые легко собран в большинстве лабораторий описано. Этот аппарат устраняет требование, чтобы иметь специализированный изображений RIG генерируется университета "механический цех" или подобный сервис. Это визуализации установка аналогична той, что используется в графических других куколок тканей 9,10.
Представленные здесь простой протокол изображения живых клеток, которые могут быть использованы непосредственно оценить морфогенетические события, которые способствуют глаз паттерна от ~ 17 до 42 ч после образования пупария (HR НПФ). В частности, этот протокол позволяет определить последствия изменения экспрессии генов во время развития куколки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Рисунок 3 показывает обзор экспериментальной процедуры.
1. Подготовка ткани
- Чтобы определить последствия изменений экспрессии гена, настроить следующие крест в двух экземплярах и сохранить при 25 ° C: UAS-трансгенов (мужчины) X GMR-GAL4; UAS-α-кошка: GFP, Ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b (Виргинские женщины) ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения контрольных сечениях ткани UAS-LacZ мужчин в GMR-GAL4; UAS-α-кошка: GFP, Ubi-DE-Cad: GFP женщины. β-галактозидазы не создает никаких дефектов в поведении клеток в сетчатке.
- Для повышения эффективности RNAi трансгенов, кросс UAS-РНК-интерференции мужчин в GMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-кошка: GFP, Ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b девственные самки.
Примечание: Иногда дефекты в поведении клеток в сетчатке, экспрессирующие наблюдались внематочной DCR-2 (данные не показаны). Бдительность рекомендуется при использовании этого подхода. - SИзбранный белый предварительно куколки соответствующих генотипов и место в 1,5 мл микропробирок. Если куколки выразить DCR-2, выберите мужского или женского пола куколок: выражение UAS-DCR-2, вставка на Х-хромосоме, сильнее мужчин. Куколки должны быть сексуально в 0 ч НПФ перед пигментации куколки случае - гонады самцов видны как крупных полупрозрачных глобусов на боковых сторонах куколки (примерно одна треть от задней).
- Инкубируйте микроцентрифужных пробирки, содержащие куколки, в чистой пластиковой коробке наконечника при 25 ° С. Чтобы предотвратить высыхание куколок месте 10 см 2 кусок ткани, смоченной в дистиллированной воде, в наконечник коробки.
ПРИМЕЧАНИЕ: если влажность в коробка Tip-Box становится слишком высокой куколки случае может стать сырым и трудно анализировать в последующих стадиях. - Инкубировать в течение соответствующего времени. Для захвата клеток поведения, связанные с рисунка глаз, подготовить куколки для работы с изображениями в пределах 17 ч НПФ, 20 ч НПФ или 24 ч APF. См Представитель Результаты для дальнейшего обсуждения о том, когда специфических клеточных поведения лучше всего наблюдается.
- Место кусок свежего двухсторонней ленты на черном Sylgard рассечение блюдо. Установите куколки, спинной стороной вверх, с головой куколки, прикрепленной к двухсторонней ленты (рис 1А) .Try не придерживаться грудной и брюшной области куколки в двухсторонней ленты. С пинцетом осторожно поднимите и снимите крышечку, чтобы разоблачить куколки головой. Tear вдоль стороны куколки случае подвергать области вокруг одного глаза.
- Аккуратно удалите куколки с клейкой лентой. Если куколка остается приверженцем, нанесите небольшой объем дистиллированной водой до перекрестка между куколки случае и ленты, чтобы ослабить адгезию.
2. Монтаж
- Построить небольшой 15 мм 2 кадр из промокательной бумаги и пробить дыру в middlethat 5,5 мм в диаметре (рис 1B). Погрузитесь в дистиллированной воде и поместите вцентр предметное стекло микроскопа. Использование 30 см шприц, выдавите равномерное кольцо вазелина, чтобы окружить промокательной бумаги кадр. Убедитесь, что вазелин кольцо незначительно выше, чем ширина куколки и что диаметр кольца незначительно меньше, чем ширина покровным стеклом.
- Добавить маленькую каплю вазелина непосредственно на слайде, в отверстие, пробитое в промокательной бумаги (рис 1в) .Carefully организовать куколки, со своей стороны, при поддержке вазелином шарик (рис 1D).
- Поместите покровное в верхней части вазелином кольца таким образом, что она контактирует с над глазом нейроэпителии (рис 1D) эпителия. Осторожно сжимать препарат для герметизации покровное против вазелина и генерировать небольшую плоскую контактную поверхность между областью куколки глаз и покровное.
3. флуоресценции изображений
- Изображение куколки подготовку, используяфлуоресцентный микроскоп. Каждый 7 мин захвата серийные срезы через апикальную области глаз нейроэпителии, в области слипчивых соединений.
ПРИМЕЧАНИЕ:) соответствующие серийные срезы, как правило, 4-5 в Z-стек, состоящий из 0,2 мкм Z-шагов. б) Нарушения в топологии эпителия, в том числе мягких ударов и складок, может сделать это сложно приобрести в фокусе изображения крупных регионов ткани. В то время как изображения, можно найти часть области интереса, чтобы быть в фокусе, а соседний регион, чтобы быть вне фокуса. В том числе небольшой капли дистиллированной воды между куколки глаз и покровное может устранить некоторые складки острые ткани, но не слегка неравномерной топологии характеристика ранних стадиях куколки морфогенеза глаз. В этих случаях дополнительной выборки ткани от продления Z-стек до фокусировки ломтики приобретены для всей области. в) Захват серийных срезов каждые 7 мин должно позволить жить-визуализацию для 3 до 4 ч без существенного Редуие интенсивности GFP флуоресценции, которые могут поставить под угрозу качество изображения. Более короткие временные интервалы могут уменьшить общее время визуализации. - Продолжить изображений от 3 до 4 часов. Не использовать автоматическую фокусировку и временную функцию, которая доступна на многих люминесцентных микроскопов с куколки рост и накачка гемолимфы перемещает положение сетчатки и бдительность переориентации требуется каждый 14-21 мин. Обратите внимание, что воображение более 4 часов может замедлить или остановится морфогенез глаз.
- Используйте соответствующее программное обеспечение деконволюции для уменьшения фона и повышения контрастности разделе изображений сериала. Для каждого файла Z-стека, выполните следующие действия в программном обеспечении LAS AF (табл материалов) Перейдите к панели инструментов, выберите 3D Deconvolution и нажмите кнопку Применить.
- Создание максимальный выступ (МП) образ для каждого разрешенный файл стека: Перейдите к панели инструментов, выберите 3D проекции и нажмите кнопку Применить.
ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальная проекционного алгоритма, может не порождать формуLY в фокусе изображение для тканей, которые были выборка. Техника для заточки вне фокуса регионов описано в пункте 5.2.
4. После визуализации куколки аварийно-спасательных и фенотипа Проверка
- Для решения были ли введены артефакты или куколки пострадал во время съемки, аккуратно удалите куколки с изображения установки: с помощью щипцов снимите покровное и передать куколки в чистый сосуд пищи. Хранить при комнатной температуре или 25 ° C до взрослой мухи не возникает.
- Внимательно изучите фенотип взрослого глаза и сравните глазах взрослых мух, выходящих из оригинального креста лету.
Обработка 5. Изображение
- Автоматическое выравнивание изображения:
ПРИМЕЧАНИЕ: живая Drosophila ткань будет смещаться и расти на протяжении всего процесса визуализации. Следовательно, центры изображений собрались в последовательных временных точках может не соответствовать той же точке в Drosophila ткани. В дополнение кВся сетчатки диск вращается около 30 ° между ~ 21 и 23 ч НПФ. Чтобы выделить индивидуальное поведение клеток и снизить отвлекаться, вызванные организменном роста, совместите каждый депутат image.While Это может быть выполнено вручную, программное обеспечение для редактирования изображений используется здесь (смотрите таблицу материалов) имеет встроенные алгоритмы, которые могут ускорить этот процесс.- На вкладке Файл главного меню откройте Сценарии и выберите Загрузить файлы в стек.
- Импорт файлов изображений MP в панели Загрузка слоев и выберите OK. Убедитесь, что попытка автоматического выравнивания изображений для параметра Источник не выбран.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если выбрана эта опция, программное обеспечение может использовать алгоритм выравнивания, которая искажает данные изображения. - После того, как все файлы MP загружен в панели Layers, чтобы убедиться, что все изображения расположены в хронологическом порядке, так что ранняя точка времени в верхней части стека слоев. Если слои не в правильном порядке, перетащите их, пока они не упорядоченыправильно.
- Выберите Auto-Align Layers на закладке Edit главного меню. Выберите репозиция и нажмите кнопку ОК.
- Если алгоритм Автоматическое выравнивание не удается ориентировать кадров в соответствующей фокальной точки, внести незначительные коррективы с помощью инструмента Move.
- Композитный Заточка:
ПРИМЕЧАНИЕ: Out-Of-фокус регионы начальной MP изображение может быть заточена под «обрезки», соответствующий деконволюции стека в программе LAS AF. Обрезка файл стека позволяет вручную ограничить интервал Z-стека, который подвергается к максимальному проекционного алгоритма.- Найдите функцию Crop на панели инструментов (на вкладке Process). Вручную ограничить начальные и конечные дольки, так что они охватывают только адгезию ленты в регионе изначально из фокуса. Нажмите кнопку Применить, чтобы создать новый файл стека, который оптимизирован для этого региона.
- Создайте новый максимальный выступ для локально оптимизированный стек и экспорта в виде файла TIFF.
- В гое программы редактирования изображений (табл материалов), открытые Сценарии (находится в вкладке Файл главного меню) и выберите Загрузить файлы в стек.
- Импорт исходного файла MP изображения и локально оптимизированный файл MP для конкретного момента времени в панели Загрузка слоев и выберите OK. Убедитесь, что попытка автоматического выравнивания изображений для параметра Источник не выбран.
- Выберите оба слоя в слоях панели, а затем выберите Auto-Blend Layers (находится на вкладке Правка основного меню), чтобы автоматически маскировать соответствующие области двух изображений, уступая равномерно в фокусе поля сетчатки. Сохранить составное изображение в виде файла TIFF.
- Повторите шаги 5.2.1 через 5.2.5 для всех неоптимальных изображений депутат.
- Дальнейшие корректировки: Поворот, кадрирование, и отрегулируйте уровни слоев фильм:
- Со всеми слоями выбран, используйте Transform Tool (Edit> Free Transform), чтобы повернуть изображения так, чтобы спинной-вентральной оси сетчатки выравниваетсяк оси у кадра кинофильма.
- Если необходимо, используйте инструмент Crop, чтобы уменьшить поле зрения до нужного размера и формы.
- Используйте регулировку уровня (отдельных кадров), чтобы помочь повысить контраст между клеточной мембраной и телом клетки.
- Для стилистических целей и подчеркнуть определенные клеточные поведения, ввести в ложном, чтобы выделить пункты, представляющие интерес в каждом кадре.
- Анимация: Преобразование изображений в кино:
- Откройте Анимация панель на вкладке окна главного меню. Выберите Сделать кадры из слоев из меню, расположенном в верхнем правом углу анимации панели.
- Следует отметить, что слои будут добавлены в анимации панели в последовательном порядке, начиная с нижней части стопки. Чтобы изменить порядок кадров, сначала выберите все кадры, а затем выберите Frames Обратный из меню Animation панели.
- Выберите время задержки кадра для каждого кадра с помощью под рамой пальца выпадающее менюногтей.
ПРИМЕЧАНИЕ: задержка кадров Фильмы от 1 до 4, представленной в этой статье составляет 0,8 сек. - На вкладке Файл главного меню откройте Экспорт и выберите Просмотреть видео. Выберите Экспорт QuickTime в разделе Параметры файла и выберите нужный формат видео. Под Рендер Параметры, заданные частоту кадров обычаю, введите частоту кадров 15, и нажмите Render.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Live-визуализация куколки глаза успешная стратегия для наблюдения клеток поведения, которые способствуют нанесению нейроэпителия. Роль специфических белков может быть легко оценена путем экспрессии трансгенов, которые изменяют уровни белка в процессе разработки глаз. Для этого GMR-GAL4 используется для управления экспрессией трансгена за морфогенетического борозды. Это дает преимущество не пошевелив ранних событий, которые устанавливают поле глаз в течение первых двух личиночных возрастов. Кроме того, многие трансгены РНК-интерференции требует значительного времени для эффективного снижения уровня белка (данные не показаны). Поэтому вождения RNAi трансгенов с линии водитель GMR-GAL4 часто позволяет развитию третьего личиночного возраста глаз и вывернуть наизнанку глаз дисков во время метаморфоза, чтобы продолжить невредимым и значительно снижает уровень белка только позже, во время куколки морфогенеза глаз. Если развитие личинок, однако, возмущенный высокоэффективной РНК-интерференции трансгена, летать крестыподдерживаться при 18 ° С, чтобы снизить экспрессию трансгена и куколок передается до 25 ° С при 0 ч АПФ. Для решения эффективность РНК-интерференции экспрессии трансгенов, стенограмма или белковых уровнях должны быть оценены в стадии соответствием куколок с использованием стандартных методов (например, количественную ПЦР, иммунофлюоресценции, иммуноблоттинга).
Во время развития личинок, фоторецепторные ядра каждого омматидия вербуются в качестве волну, бегущую от задней к передней стороне диска глаз 11. Этот градиент развития была сохранена в куколки глаз. Действительно, когда изображается на 22,5 ч НПФ, паттерна GMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-кошка: GFP, Ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b сетчатки был заметно более зрелой в задней области (Рисунок 2). Фенотип этих сетчатки была сравнима с таковой штаммов мух дикого типа (данные не показаны). Традиционно куколки морфогенеза глаз описывается в зависимости от времени развития (например,ч НПФ). Тем не менее, из-за сильного градиента развития мы предлагаем описания глаз паттерна в соответствии со следующими событиями:
1 ° обертывание (рис 2 и фильм 1): Изначально целых восемь-клетки непосредственно связаться фоторецепторов расслоения. Две клетки - обычно передние и задние клетки - были набраны в праймериз (1 ° S). Эти 1с быстро окружили фоторецепторов пучки, соединяясь друг с другом с образованием стабильных переходов. Неопределенная interommatidial клетки (ИС) заключается в хаотического между каждой ommatidial группировки. Одновременно с 1 ° рекрутинга клеток, апоптоз сокращены примерно 5% из бассейна СК, как описано ранее (не аннотированной в кино 1) 12.
IC интеркаляции (рис 2 и фильм 2): Как 1 ° с упаковываются и запечатываются о каждом фоторецепторов пучка, местные CEдвижения LL реорганизовал ИС, сгруппированные на спинной и брюшной сторонах каждого омматидия. Микросхемы интеркалированные из нескольких (обычно двух) строк в одну строку. Конечное положение движущихся ИС может быть уверенно предсказал в дикого типа ткани, наблюдая направленного проекцию крупных "сотовых расширений. Рост клеток 1 ° сопровождается и, вероятно, способствовало IC 13 интеркаляции. Многие ИС будет идти на различие в качестве вторичных клеток (2 ° S) (не показано).
3 ° конкурс (рис 2 и фильм 3): После интеркаляции три ИС соревновались, чтобы занять высшее (3 °) нишу. В этом динамичном бою, клетки часто занимал 3 ° нишу всего за 5 до 10 мин, а затем перемещенных лиц. В конце концов одна ячейка создана стабильная 3 ° нишу.
Заключительный обрезка (рис 2 и фильм 4): Всплеск апоптоза 3,15-18 сократили количество микросхем до минимума, необходимого для эффективного создания аккуратный гексагональную IC решетку по сложного глаза 5,14: три 3 ° с и шесть 2 · с вокруг каждой омматидия. Как отмечалось ранее, обычно эти избыточные ИС, лежащие ближе всего к щетинок были устранены путем апоптоза 7. Мы наблюдали гибель клеток, одновременно с IC интеркаляции и 3 ° ниши создания и предложить что обрезку лишних клеток вклад в эффективность этих мероприятий. Кроме того, тонкий повторно позиционирование щетины organules часто наблюдается как ИС были сокращены.
Рисунок 1:. Куколки рассечение и обработки изображений () крышечки удаляется из куколки Drosophila (как показано здесь на 23 ч НПФ), чтобы выставить голову аНимал. Пунктирная линия представляет собой кусок двухсторонней ленты. (B) Иллюстрация простой живой изображений установке. (С и D) с головой открытой, куколка расположен примерно в 35 ° лежит на вазелин шарик. (D) Высшее увеличенное изображение куколки, расположенного на вершине вазелином шарик. Положение покровного стекла и цели проиллюстрированы (не в масштабе). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: градиент развития по куколки глаз. () Один образ куколки глаза изображенного на 22,5 ч НПФ. Слипчивые соединения помечены DE-CAD: GFP и αCat: GFP. Коробочная область соответствующую отметку в (C). (B) Иллюстрации середине сцены и полностью по образцу омматидиев, на 24 и 41 ч НПФ соответственно. Два 1 ° с (синие) окружить центральную группировку из четырех колбочек (белый). По 41 часов НПФ нанесения рисунка interommatidial клеток (светло-серый) является полным: три 3 ° с занимать альтернативные вершин и отдельные 2 ° форм каждой стороны шестиугольника. Три щетины organules (темно-серый) окружают каждый омматидия. (C) Аннотация небольшой области глаз (от А). Два 1 ° клеток (примеры псевдо-голубого цвета) расширить, чтобы окружить каждый фоторецепторов сверток. ИС (зеленый, желтый, красный и синий) интеркалят в отдельных строках. В каждой альтернативной вершины три ячейки конкурировать (изложенной в розовый), чтобы занять 3 ° нишу (окрашены в оранжевый цвет). Смотреть фильмы 1-4 соблюдать эти события разворачиваются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуре.
Рисунок 3:. Резюме экспериментальной процедуры Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Фильм 1 :. Первичная упаковка 1 ° клетки выбраны из пула клеток, окружающих каждое неоперившуюся омматидия. Как два 1 ° с окружить каждый омматидия и подключить, слипчивые соединения быстро сформировать (розовые линии). Прямые 1 °: 1 ° соединений элементов расширить и 1 ° начнем расти, изоляционные фоторецепторов пучки от окружающих микросхем. Первоначально фоторецепторы ярко светиться, плотный GFP маркировки сложные слипчивые соединения. Морфологические изменения градвойственно привлечь этих фоторецепторов переходов ниже плоскости изображения и X-образных перекрестках между каждым набором из четырех апикальных колбочек на вершине друг омматидий становятся более ясными. Оригинальные изображения на левой; псевдо-раскраска и аннотации введена в панели справа. Глаз изображение получено с 21 ч НПФ.
Фильм 2 :. Interommatidial intercalaction ячейке interommatidial клетки (ИС) выделены в красный, синий, желтый и зеленый первоначально образуют квадрант, отделяющую спинной (вверху) и вентральной (нижней) омматидия на расстоянии двух ячеек. Красные и желтые ИС растянуть вентрально и дорсально соответственно (от Т = 42 мин), что делает контакт с целевой 1 · с 56 мин. Синие и зеленые ИС аналогично распространяется на целевой противоположный омматидия. "Новые" 1 °: IC узлы быстро расширяться в сторону. В 112 мин оригинал квадрант ИС имеет полностью интеркалированную для Generate один ряд клеток. Оригинальные изображения на левой; псевдо-раскраска и аннотации введена в панели справа. Глаз изображение получено с 23 ч НПФ.
Фильм 3 :. Третичный конкуренции на альтернативных вершин двух или трех клеток (они изложены в розовом) конкурировать, чтобы занять 3 ° нишу. Явление «проталкивания» своих соседей в сторону, клетки вырабатывают большие расширения, которые достигают к противоположной омматидиев. Занимая 3 ° нишу (окрашены в оранжевый цвет) часто мимолетное и клетки либо отказаться, либо выталкивается из положения их соседей. К концу этого 217 мин фильма, многие 3 ° ниши оказываются установлено. Оригинальные изображения на левой; псевдо-раскраска и аннотации введена в панели справа. Глаз изображение получено с 23 ч НПФ.
Moсоперничают 4:. Финал Обрезка Клетки в непосредственной близости от щетины organules удаляются путем апоптоза. Примеры выделены фиолетовый, красный, желтый и синий. В течение визуализации, удаление клеток осталось только одно 2 ° вдоль каждой горизонтальной стрелы шестиугольника IC. Обрезка, клетки кишечного эпителия на диагональных сторонах шестиугольника СК не был захвачен в этом фильме. В этом генотипа незначительные ошибки в размещении групп щетинок часто наблюдается (сравните с рис 2B). Два из трех групп щетинок маневрировал в угловых нишах во время съемки: повторное позиционирование, казалось, способствовало удаления и перемещения соседних микросхем. Оригинальные изображения на левой; псевдо-раскраска и аннотации введена в панели справа. Глаз изображение получено с 26 ч НПФ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описание разработки дикого типа (выше) образует основу для сравнения паттерна событий в РНК-интерференции или избыточной экспрессии генотипов. Сравнение развития живой ткани имеют неоценимое значение при определении, какие именно клеточные поведения регулируются белка. Кроме того, и здесь не описана, изображений живых клеток позволяет делать качественные и / или количественные описания роли гена интерес к событиям, которые формируют паттерн глаз. По 30-32 ч НПФ большинство пигментные клетки приобрели стабильные позиции и апоптоз обрезают лишние клетки из поля сетчатки. После этого, только тонкие изменения наблюдаются как пигментные клетки принимают свои характерные формы: 3 ° ю.ш. стать гексагональной и, как 1 ° с тонко расширяться, ширина соседних прямоугольных 2 ° клеток уменьшается. После поколение пигмента и материала линзы, скорее всего мешает успешному визуализации слипчивых соединений.
Хотя в Valuable стратегия, несколько подводных камней должны иметь в виду, при визуализации живой куколки глаз. Во-первых, удаление передней куколки дело делает животное особенно уязвимы к обезвоживанию, перегреву и травм во время монтажа и обработки изображений. Оскорбления, таких, как они могут запутать данные, вызывая развитие атипичной ткани, которая не имеет отношения к генотипу под экспертизы. Во-вторых, протокол, описанный здесь требуется, чтобы стекло покровное прямой контакт с куколки головы эпителия. Мы наблюдали, что сетчатки развитие киосков, если избыточное давление применяется при нажатии покровное от глаза. В самом деле экзогенные механические силы, как было показано в других системах, чтобы влиять на процессы развития, включая ткани архитектуры 19,20. По этим причинам важно очень аккуратно разместить покровное от глаза. Кроме того, в образ куколки должны быть спасены от изображения установки и позволил превращаться в взрослых: артефакты введены во время съемки можночасто обнаруживается путем сравнения отображаемого глаз этих взрослых с глазами соответствующего возраста мух от первоначального креста. Кроме того, данные из нескольких сессий визуализации, необходимо сравнить проверить клеток поведения. Наконец, стандарт immunofluoresence следует использовать, чтобы определить, является ли это то же самое расположение, размер и число клеток в стадии соответствием ткани.
Внематочная DCR-2 часто используется для повышения эффективности РНК-интерференции. Тем не менее, в присутствии внематочной DCR-2, СК интеркаляции, стабилизации 3 ° нише и апоптоза от времени нарушается (данные не показаны). Таким образом, DCR-2 выражение следует использовать с осторожностью.
Протокол, описанный здесь использует GFP, чтобы метка слипчивые соединения и оценить морфогенез пигментных клеток в куколки глаз. Эта стратегия может быть легко модифицирована для других целей (например, для оценки фоторецепторов морфогенез). Для двойной маркировки подхода, дополнительная UAS трансгены, что этикетка другие клеточные компоненты, представляющие интерес (например, секретарю пузырьки, эндоплазматический ретикулум, ядро) с не-GFP тегов могут быть включены. Однако интенсивность и долговечность этих трансгенов потребуют оценки: RFP, DsRed и mCherry, например, оказались бедные этикетки для визуализации куколки глаз для длительных периодов, необходимых, чтобы захватить пигмент клеток паттерна (данные не показаны). Если расследование быстрые мобильные поведения (например, секрецию) протокол, описанный здесь может быть легко модифицирована для конфокальной микроскопии подходящих белков люминесцентных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| Scotch double stick tape | 3M | 665 | |
| Black Sylgard dissection dish | Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 hr to polymerize | ||
| Sylgard | Dow Corning | SYLG184 | |
| Sylgard (Black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Glass petri dish | Corning | 7220-85 | |
| 25 x 75 x 1 mm glass microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| 22 x 40 mm glass coverslip | VWR | 48393-172 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Whatman 3mm Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-713-336 | |
| Vaseline | Fisher Scientific | 19-086-291 | Or purchase at local pharmacy. |
| 30 ml syringe | Fisher Scientific | S7510-30 | |
| Leica TCS SP5 DM microscope | Leica Microsystems | ||
| LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software | Leica Microsystems |
References
- Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. J. Cell. Sci. 114, 493-501 (2001).
- Oda, H., Tsukita, S. Dynamic features of adherens junctions during Drosophila embryonic epithelial morphogenesis revealed by a Dalpha-catenin-GFP fusion protein. Dev. Genes Evol. 209, 218-225 (1999).
- Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell. 87, 651-660 (1996).
- Cagan, R. Cell fate specification in the developing Drosophila. retina. Dev Suppl. , 19 (1993).
- Bate, M., Arias, A. M. Pattern formation in the Drosophila. retina. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 1277-1325 (1993).
- Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing. Drosophila pupal retina. Mech. Dev. 125, 223-234 (2008).
- Monserrate, J. P., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death Differ. 14, 209-217 (2007).
- Lee, Y. S., et al. Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways. Cell. 117, 69-81 (2004).
- Zitserman, D., Roegiers, F. Live-cell imaging of sensory organ precursor cells in intact Drosophila pupae. J. Vis. Exp. (51), 2706 (2011).
- Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).
- Sato, M., Suzuki, T., Nakai, Y. Waves of differentiation in the fly visual system. Dev. Biol. 380, 1-11 (2013).
- Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mech. Dev. 121, 1523-1530 (2004).
- Larson, D. E., Johnson, R. I., Swat, M., Cordero, J. B., Glazier, J. A., Cagan, R. L. Computer simulation of cellular patterning within the Drosophila pupal eye. PLoS Comput. Biol. 6, e1000841 (2010).
- Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Dev. Biol. 136, 346-362 (1989).
- Cagan, R. L., Ready, D. F. Notch is required for successive cell decisions in the developing Drosophila retina. Genes Dev. 1099, 1112 (1989).
- Miller, D. T., Cagan, R. L. Local induction of patterning and programmed cell death in the developing Drosophila retina. Development. 125, 2327-2335 (1998).
- Sawamoto, K., Okano, H., Kobayakawa, Y., Hayashi, S., Mikoshiba, K., Tanimura, T. The function of argos in regulating cell fate decisions during Drosophila eye and wing vein development. Dev. Biol. 164, 267-276 (1994).
- Yu, S. Y., et al. A pathway of signals regulating effector and initiator caspases in the developing Drosophila eye. Development. 129, 3269-3278 (2002).
- Liu, Z., et al. Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions. Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 9944-9949 (2010).
- Miyake, Y., Inoue, N., Nishimura, K., Kinoshita, N., Hosoya, H., Yonemura, S. Actomyosin tension is required for correct recruitment of adherens junction components and zonula occludens formation. Exp. Cell Res. 312, 1637-1650 (2006).
