Abstract
العمليات الكامنة للتنمية العذراء ذبابة الفاكهة يمكن أن تحول وتشويه ظهارة العين في السبل التي تجعل سلوك الخلية الفردية الصعب تتبع أثناء التصوير الخلية الحية. وتشمل هذه العمليات: دوران في شبكية العين، نمو الخلايا وحركة عضوي. بالإضافة إلى ذلك، غالبا ما طيات قدم مخالفات في طوبولوجيا من ظهارة، بما في ذلك المطبات خفية وكما يتم إعداد خادرة للتصوير، وجعلها صعبة للحصول على التركيز في الصور أكثر من عدد قليل من ommatidia في طائرة الوصل واحدة. سير العمل أوجز هنا العلاجات هذه القضايا، مما يسمح للتحليل سهل من العمليات الخلوية خلال ذبابة الفاكهة تطوير العذراء العين. يتم ترتيب الشرانق نظموا بشكل مناسب، في تلاعب التصوير التي يمكن تجميعها بسهولة في معظم المختبرات اليوبيكويتين-DE-كادهيرين: GFP وGMR-GAL4 -driven UAS-α-كاتينين: GFP تستخدم لتصور حدود الخلية في العين ظهارة 1 -3. بعد إزالة التفاف هوتطبق على صور الفلورسنت القبض على طائرات التنسيق متعددة، يتم إنشاء القصوى الصور الإسقاط لكل نقطة زمنية وتعزيز استخدام برامج تحرير الصور. وتستخدم خوارزميات المواءمة لتحقيق الاستقرار بسرعة الحركة زائدة، مما يجعل سلوك الخلية الفردية أسهل لتتبع.
Introduction
يتميز المجمع ذبابة الفاكهة العين عن طريق ترتيب نمطي لها ~ 750 ommatidia مفصولة العسل شعرية من الخلايا الصبغية التبعي 4،5. ونمط هذه الخلايا الصبغية من قبل مجموعة منسقة من الأحداث: حركات خلية محلية، نمو الخلايا، والتغيرات في شكل الخلية، وموت الخلايا المبرمج. التصور المباشر لهذا ظهارة يسمح احد لدراسة الآليات الجزيئية التي تقوم عليها هذه الأحداث في سياق ثلاثية الأبعاد ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ورابط الجأش.
وعلى النقيض من البروتوكولات السابقة 6،7، والتقنية المذكورة هنا تتضمن وسيلة فعالة لتحقيق الاستقرار في حركة الأنسجة الغريبة التي لا يمكن أن تكون. فصل من عملية التصوير. هذه الطريقة يعزز دراسات سلوك الخلية في تطوير ذبابة الفاكهة العذراء العين ظهارة - الأنسجة التي تنمو، بالتناوب، والتحولات على مدار التصوير. وبالإضافة إلى ذلك الحركة استقرار تقنية ديمكتوب هنا سوف تكون مفيدة لدراسة الخلايا في سياقات أخرى حيث تحدث حركة دخيلة.
لتصور حدود الخلية في مجال الشبكية ذبابة الفاكهة، تم إنشاء خطوط الطيران المعدلة وراثيا التي تعبر عن يو بي آي-DE-كادهيرين: GFP وكذلك UAS-α-كاتينين: GFP تحت سيطرة السائق العين محددة GMR-GAL4 1-3. استخدام اثنين من الموسومة GFP علامات غشاء يسمح لتصور حدود الخلية في انخفاض كثافة الضوء. هذا يقلل من تلف الأنسجة وphotobleaching من على التعرض المتكرر للموجات عالية الطاقة، مما يتيح زيادة معدل الإطار، ومدة الفيلم. لتعزيز فعالية الجينات المحورة رني، تأسست UAS-DCR-2 أيضا في خط الطيران الثانية 8.
في التحديث الثالث من البروتوكولات السابقة، وصفت تلاعب التصوير أسهل أن يتم تجميعها بسهولة في معظم المختبرات. هذا الجهاز يغني عن اشتراط أن يكون لها ص التصوير المتخصصةIG الناتجة عن "آلة متجر" جامعة أو خدمة مماثلة. هذا تلاعب التصوير مماثلة لتلك التي تستخدم لصورة العذراء الأنسجة الأخرى 9،10.
المقدمة هنا هي الخلية الحية بروتوكول التصوير البسيطة التي يمكن استخدامها لتقييم مباشرة أحداث التخلق التي تسهم في الزخرفة العين من ~ 17-42 ساعة بعد تشكيل puparium (ساعة APF). على وجه التحديد، هذا البروتوكول يتيح احدة لتحديد الآثار المترتبة على تعديل التعبير الجيني خلال تطوير العذراء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ويبين الشكل 3 ملخصا لإجراء التجارب.
1. إعداد الأنسجة
- لتحديد عواقب التعبير معدلة من الجينات في المصالح، وإنشاء الصليب التالية في مكررة والحفاظ على درجة حرارة 25 درجة C: UAS-التحوير (ذكور) X-GMR GAL4. UAS-α-القط: GFP، يو بي آي-DE-كاد: GFP. + / SM5-TM6b (الإناث البكر) ملاحظة: للحصول على السيطرة الأنسجة عبر UAS-lacZ الذكور GMR-GAL4. UAS-α-القط: GFP، يو بي آي-DE-كاد: إناث GFP. β غالاكتوزيداز يولد عدم وجود عيوب في سلوك الخلية في شبكية العين.
- لتعزيز فعالية الجينات المحورة رني، عبر UAS-رني الذكور إلى GMR-GAL4، UAS-DCR-2. UAS-α-القط: GFP، يو بي آي-DE-كاد: GFP. + / SM5-TM6b الإناث البكر.
ملاحظة: العيوب العرضية في سلوك الخلية في الشبكية التعبير لوحظت خارج الرحم DCR-2 (لا تظهر البيانات). ويوصى اليقظة في حالة استخدام هذا النهج. - Sالمنتخب الأبيض قبل الشرانق من التراكيب الوراثية المناسبة ومكان في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge. إذا الشرانق التعبير عن DCR-2، حدد الشرانق إما ذكرا أو أنثى: التعبير عن UAS-DCR-2، وهو إدراج على كروموسوم X، هو أقوى في الذكور. الشرانق يجب بالغت في 0 ساعة APF قبل تصبغ في حالة العذراء - الغدد التناسلية للذكور واضحة كما الكرات شفافة كبيرة على الجانبين الجانبية للخادرة (حوالي ثلث من الخلفي).
- احتضان أنابيب microcentrifuge تحتوي على الشرانق، في بلاغ البلاستيك مربع نظيفة في 25 ° C. لمنع جفاف مكان الشرانق قطعة 10 سم 2 من الأنسجة، وينقع في الماء المقطر، في مربع تلميح.
ملاحظة: إذا كانت الرطوبة في مربع طرف تصبح مرتفعة جدا قد تصبح حالة العذراء فطير ويصعب تشريح في الخطوات اللاحقة. - احتضان لمدة الوقت المناسب. لالتقاط السلوكيات الخلية المرتبطة الزخرفة العين، وإعداد الشرانق للتصوير في حوالي 17 ساعة APF، 20 ساعة APF أو 24 ساعة APF. انظر ممثل النتائج لمزيد من المناقشة في حين لوحظ السلوكيات خلية معينة أفضل.
- ضع قطعة من الشريط على الوجهين الطازج على طبق تشريح sylgard الأسود. ضع الجانب خادرة، الظهرية يصل، مع رئيس خادرة انضمت إلى الوجهين الشريط (الشكل 1A) وليس محاولة التمسك الصدرية ومناطق البطن من خادرة إلى الشريط على الوجهين. مع ملقط رفع بعناية وإزالة الغطاء الخيشومي لفضح رئيس العذراء. المسيل للدموع على طول الجانب من حالة العذراء لفضح منطقة حول عين واحدة.
- بلطف إزالة خادرة من شريط لاصق. إذا بقيت ملتصقة خادرة، وتطبيق كمية صغيرة من الماء المقطر إلى تقاطع بين حالة العذراء والشريط لإضعاف التصاق.
2. تركيب
- بناء صغير 15 مم 2 الإطار من الورق النشاف وكمة ثقب في middlethat هو 5.5 ملم وقطرها (الشكل 1B). تزج في الماء المقطر ومكان فيوسط شريحة المجهر. باستخدام حقنة 30 سم مكعب، اخراج حلقة موحدة من الفازلين لتطويق إطار ورقة النشاف. تأكد من أن عصابة الفازلين أعلى هامشيا من عرض خادرة وأن قطر الدائري هو أقل هامشيا من عرض زلة غطاء.
- إضافة حبة صغيرة من الفازلين مباشرة على الشريحة، في حفرة لكمات في ورقة النشاف (الشكل 1C) .Carefully ترتيب خادرة، على جانبها، بدعم من حبة الفازلين (1D الشكل).
- وضع ساترة على رأس عصابة الفازلين بحيث إنها تجري اتصالات مع ظهارة فوق الظهارة العصبية العين (الشكل 1D). ضغط بلطف إعداد لختم ساترة ضد الفازلين وتوليد سطح التماس شقة صغيرة بين منطقة العين العذراء وساترة.
3. الإسفار التصوير
- صورة إعداد العذراء باستخدامالمجهر الفلورسنت. كل القبض على 7 دقائق أقسام التسلسلية من خلال المجال قمية من الظهارة العصبية العين، في منطقة تقاطعات الملتصقة.
ملاحظة: أ) أقسام مسلسل المناسبة وعادة ما تكون 4-5 في ض المكدس تتألف من 0.2 ميكرون ض الخطوات. ب) المخالفات في طوبولوجيا من ظهارة، بما في ذلك المطبات خفيفة وطيات، قد جعلها صعبة للحصول على التركيز في الصور من مناطق واسعة من الأنسجة. بينما التصوير، ويمكن للمرء أن يجد جزء من مجال اهتمام أن تكون في التركيز، ومنطقة مجاورة ليكون خارج نطاق التركيز. يمكن أن تشمل قطرات صغيرة من الماء المقطر بين العين العذراء وساترة القضاء على بعض طيات النسيج الحادة ولكن ليس سمة طوبولوجيا تفاوت أقل ما يقال من المراحل المبكرة من العذراء التشكل العين. في هذه الحالات oversample الأنسجة من خلال توسيع ض المكدس حتى في التركيز يتم الحصول على شرائح للحقل بأكمله. ج) الحصول أقسام التسلسلية يجب على كل 7 دقائق تمكن الحية التصوير لمدة 3 إلى 4 ساعات من دون redu كبيرةction في شدة GFP مضان يمكن أن تكون ضارة جودة الصورة. -فترات زمنية أقصر قد يقلل من الوقت الإجمالي من التصوير. - يستمر التصوير لمدة 3 إلى 4 ساعات. لا تستخدم التركيز التلقائي وظيفة الوقت الذي يتوفر على العديد من المجاهر الفلورية منذ نمو العذراء وضخ الدملمف يتحرك الموقف من شبكية العين والحذر مطلوب كل 14-21 دقيقة إعادة تركيز. ملاحظة أن التصوير ما بعد 4 ساعات قد تبطئ أو المماطلة التشكل من العين.
- استخدام برامج إزالة التفاف المناسب للحد من خلفية وتعزيز النقيض من الصور قسم التسلسلية. لكل ملف ض المكدس، نفذ ما يلي في برنامج LAS AF (انظر جدول المواد): انتقل إلى لوحة الأدوات، حدد 3D إزالة التفاف وانقر فوق تطبيق.
- توليد أقصى قدر من الإسقاط (MP) صورة لكل ملف كومة deconvoluted: انتقل إلى لوحة الأدوات، حدد 3D الإسقاط وانقر فوق تطبيق.
ملاحظة: قد تفشل الخوارزمية الإسقاط القصوى لتوليد موحدةلاي في التركيز على الصورة لالأنسجة التي تم oversampled. ويرد وهناك تقنية لشحذ مناطق خارج نطاق التركيز في الخطوة 5.2.
4. ما بعد التصوير العذراء الانقاذ والنمط الظاهري التأكيد
- لمعالجة ما إذا تم إدخال القطع الأثرية أو خادرة أذى أثناء التصوير، وإزالة بعناية خادرة من تلاعب التصوير: باستخدام ملقط إزالة ساترة ونقل خادرة إلى قارورة نظيفة من المواد الغذائية. يخزن في درجة حرارة الغرفة أو 25 ° C حتى يظهر الطاير الكبار.
- تدرس بعناية النمط الظاهري من العين الكبار ومقارنة لعيون الذباب الكبار الناشئة عن الصليب ذبابة الأصلي.
تجهيز 5. صورة
- التلقائي محاذاة الصورة:
ملاحظة: سوف الأنسجة الحية ذبابة الفاكهة التحول والنمو في جميع مراحل عملية التصوير. ونتيجة لذلك، تجمع مراكز الصور في نقاط زمنية متتالية قد لا تتوافق مع نفس النقطة في الأنسجة ذبابة الفاكهة. وبالإضافة إلى ذلكالقرص شبكية العين بأكمله يدور حول 30 درجة بين ~ 21 و 23 ساعة APF. لتسليط الضوء على السلوكيات خلية فردية والحد من الانحرافات الناجمة عن النمو العضوي، محاذاة كل MP image.While هذا لا يمكن أن يؤديها يدويا، وبرامج تحرير الصور المستخدمة هنا (انظر جدول المواد) وقد بنيت في الخوارزميات التي يمكن تسريع هذه العملية.- من علامة التبويب ملف من القائمة الرئيسية، مخطوطات المفتوحة والملفات تحميل مختارة في المكدس.
- استيراد ملفات الصور النائب في لوحة الطبقات تحميل واختر موافق. تأكد من أن محاولة خيار الصور المصدر إلى محاذاة تلقائيا لم يتم تحديد.
ملاحظة: إذا تم تحديد هذا الخيار، فإن البرنامج قد يستخدم خوارزمية المحاذاة أن يشوه بيانات الصورة. - بمجرد تحميل جميع ملفات MP إلى جزء الطبقات، تأكد من أن جميع الصور هي حسب الترتيب الزمني بحيث أقرب نقطة زمنية هي في الجزء العلوي من طبقة المكدس. إذا كانت الطبقات ليست في الصحيح النظام، وسحب وإسقاط لهم حتى يتم أمروابشكل صحيح.
- تحديد الطبقات لصناعة السيارات في محاذاة من علامة التبويب تحرير من القائمة الرئيسية. اختر تعديل وانقر فوق موافق.
- إذا فشلت خوارزمية لصناعة السيارات في محاذاة لتوجيه الإطارات إلى نقطة محورية ذات الصلة، إجراء تعديلات طفيفة باستخدام أداة التحريك.
- شحذ مركب:
ملاحظة: خارج نطاق التركيز مناطق صورة النائب الأولية يمكن شحذ التي كتبها 'الزراعة' كومة المقابلة deconvoluted في مجال البرمجيات LAS AF. الاقتصاص ملف كومة يسمح احد لتقييد فترة من كومة ض أن تخضع لخوارزمية الإسقاط القصوى يدويا.- موقع الدالة المحاصيل في لوحة الأدوات (ضمن علامة التبويب عملية). تقييد يدويا شرائح الأولية والنهائية بحيث أنها تغطي فقط الحزام التصاق داخل المنطقة في البداية خارج نطاق التركيز. انقر فوق تطبيق لإنشاء ملف كومة الجديد الذي هو الأمثل لهذه المنطقة.
- توليد إسقاط الحد الأقصى الجديد لكومة الأمثل محليا وتصدير كملف TIFF.
- في الالبريد تحرير الصور البرمجيات (انظر جدول المواد)، مخطوطات المفتوحة (الموجود في علامة التبويب ملف من القائمة الرئيسية) وحدد تحميل الملفات إلى المكدس.
- استيراد الأولي ملف الصورة MP وملف النائب الأمثل محليا لنقطة زمنية معينة في لوحة الطبقات تحميل واختر موافق. تأكد من أن محاولة خيار الصور المصدر إلى محاذاة تلقائيا لم يتم تحديد.
- تحديد كل الطبقات في الطبقات جزء ثم اختيار الطبقات لصناعة السيارات في مزيج (الموجود في علامة التبويب تحرير من القائمة الرئيسية) لإخفاء المناطق المناسبة من الصورتين تلقائيا، مما أسفر عن موحد في مجال التركيز في شبكية العين. حفظ هذه الصورة المركبة كملف TIFF.
- كرر الخطوات من 5.2.1 خلال 5.2.5 لجميع الصور النائب دون المستوى الأمثل.
- مزيد من التعديلات: تدوير، والمحاصيل، وضبط مستويات من الطبقات الفيلم:
- مع كل من الطبقات المحددة، استخدم أداة التحويل (تحرير> تحويل حر) لتدوير الصور بحيث محور الظهري البطني من شبكية العين هو الانحيازإلى ذ محور الإطار الفيلم.
- إذا لزم الأمر، استخدم أداة الاقتصاص للحد من مجال الرؤية إلى الحجم المطلوب والشكل.
- استخدام تعديل مستوى (الإطارات الفردية) للمساعدة في تعزيز التباين بين غشاء الخلية وخلايا الجسم.
- لأغراض الأسلوبية والتأكيد على السلوكيات خلية معينة، وإدخال اللون كاذبة لتسليط الضوء على النقاط المثيرة للاهتمام في كل إطار.
- الرسوم المتحركة: تحويل الصور إلى الفيلم:
- فتح جزء الرسوم المتحركة من علامة التبويب ويندوز من القائمة الرئيسية. حدد جعل إطارات من طبقات من القائمة الموجودة في الزاوية اليمنى العليا من جزء الرسوم المتحركة.
- لاحظ أن طبقات تضاف إلى جزء الرسوم المتحركة في ترتيب تسلسلي بدءا من أسفل المكدس. لعكس ترتيب إطارات، أولا تحديد كافة الإطارات ثم حدد عكس إطارات من قائمة لوحة الرسوم المتحركة.
- تحديد الإطار الزمني تأخير لكل إطار باستخدام القائمة المنسدلة أدناه إطار الإبهامالأظافر.
ملاحظة: تأخير الإطار لأفلام 1-4 المقدمة في هذه الورقة هو 0.8 ثانية. - من علامة التبويب ملف من القائمة الرئيسية، وفتح التصدير وتحديد تجسيد الفيديو. اختر تصدير QuickTime تحت خيارات الملف وتحديد تنسيق الفيديو المطلوب. تحت تجعل تحديد خيارات معدل الإطار إلى مخصص، أدخل معدل الإطار 15، ثم انقر تجعل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يعيش التصوير من العين العذراء هو استراتيجية ناجحة لمراقبة سلوكيات الخلية التي تساهم في الزخرفة من الظهارة العصبية. دور بروتينات معينة يمكن تقييمها بسهولة عن طريق التعبير عن الجينات المحورة التي تعدل مستويات البروتين خلال تطوير العين. للقيام بذلك GMR-GAL4 يستخدم لدفع التعبير التحوير وراء ثلم تخلقية. وهذا يوفر ميزة عدم تكدير الأحداث السابقة التي تحدد مجال العين أثناء الأولين الأعمار اليرقية. وبالإضافة إلى ذلك العديد من الجينات المحورة رني تتطلب وقتا كبيرا لخفض مستويات بروتين فعال (بيانات أظهرت الآن). وبالتالي يقود الجينات المحورة رني مع خط السائق GMR-GAL4 غالبا ما تمكن الثالثة اليرقات تطوير الطور العين وانقلاب للخارج من أقراص العين خلال التحول إلى المضي قدما سالما ويقلل بشكل ملحوظ مستويات البروتين في وقت لاحق فقط، خلال العذراء التشكل العين. ولكن إذا تم مضطرب نمو اليرقات قبل التحوير رني كفاءة عالية، ويطير الصلبان يمكنالإبقاء على 18 درجة مئوية للحد من التعبير التحوير والشرانق نقل إلى 25 درجة مئوية في 0 ساعة APF. لمعالجة فعالية التعبير التحوير، نسخة أو البروتين مستويات رني ينبغي تقييم المطابقة في الشرانق المرحلة باستخدام تقنيات القياسية (على سبيل المثال-PCR الكمي، المناعي، immunoblotting).
خلال نمو اليرقات، يتم تجنيد النوى مبصرة لكل مقيلة كموجة التي تنتقل من الخلفي إلى الجانب الأمامي من القرص العين 11. تم الابقاء على هذه التدرج التنموي في عين العذراء. في الواقع، عندما التقط في 22.5 ساعة APF، الزخرفة من GMR-GAL4، UAS-DCR-2. UAS-α-القط: GFP، يو بي آي-DE-كاد: GFP. وكانت + / SM5-TM6b الشبكية بشكل ملحوظ أكثر نضجا في المنطقة الخلفية (الشكل 2). وكان النمط الظاهري من هذه الشبكية مماثلة لتلك التي من النوع البري سلالات ذبابة (لا تظهر البيانات). تقليديا يتم وصف التشكل العين العذراء وفقا لآخر التنموي (على سبيل المثالساعة APF). ومع ذلك، لأن التدرج التنموي وضوحا نقترح اصفا الزخرفة العين وفقا للأحداث التالية:
1 ° التفاف (الشكل 2 والفيلم 1): اتصل في البداية ما يصل الى ثمانية خلايا مستقبلة للضوء مباشرة الحزم. كما تم تجنيد الانتخابات التمهيدية (1 ° ق) - خليتين - عادة الخلايا الأمامية والخلفية. هذه 1S طوقت بسرعة حزم مبصرة، وربط مع بعضها البعض لتشكل تقاطعات مستقرة. خلايا غير متمايزة interommatidial (ICS) تكمن بطريقة غير منظمة بين كل مجموعة ommatidial. يصاحب ذلك مع 1 ° تجنيد خلية، موت الخلايا المبرمج مجردة ما يقرب من 5٪ من تجمع IC كما هو موضح سابقا (لا المشروح في الفيلم 1) 12.
IC إقحام (الشكل 2 وفيلم 2): كما في الصورة 1 ° ملفوفة ومختومة عن كل ربطة مستقبلة للضوء، CE المحليتحركات ليرة لبنانية إعادة تنظيم المرحلية المجمعة في الجانبين ظهري وبطني من كل مقيلة. المرحلية مقحم من متعددة (عادة اثنين) صفوف في صف واحد. موقف الهدف من التحرك المرحلية يمكن توقع بثقة في الأنسجة نوع البرية من خلال مراقبة إسقاط الاتجاه من "ملحقات الخلوية" كبيرة. نمو الخلايا 1 ° رافق ويرجح ساهم في IC إقحام 13. فإن العديد من الشهادات المرحلية على المضي قدما لتمييز كخلايا الثانوية (2 ° ق) (لا يظهر).
3 درجة المنافسة (الشكل 2 وفيلم 3): بعد إقحام، تنافست ثلاثة المرحلية ليحتل الدرجة الثالثة (3 °) المتخصصة. في هذه المعركة دينامية، والخلايا في كثير من الأحيان احتل 3 ° المتخصصة لاقل من 5 إلى 10 دقيقة قبل أن النازحين. في نهاية المطاف أنشأت خلية واحدة مستقرة 3 ° المتخصصة.
التقليم النهائي (الشكل 2 والسينما 4): تصاعد موت الخلايا المبرمج 3،15-18 خفضت عدد المرحلية إلى الحد الأدنى اللازم لتوليد بكفاءة وأنيق سداسية IC شعرية عبر العين مجمع 5،14: ثلاثة 3 ° الصورة وستة 2 ° الصورة حول كل مقيلة. وكما ذكر سابقا، وعادة ما تم القضاء على تلك المرحلية الزائدة الكذب الأقرب إلى شعيرات من موت الخلايا المبرمج 7. لاحظنا خلية يصاحب الموت مع IC إقحام و 3 ° مكانة إنشاء وأقترح أن التقليم الخلايا الزائدة ساهمت في كفاءة هذه الأحداث. وبالإضافة إلى ذلك، غالبا ما كان يلاحظ خفية إعادة تحديد المواقع من organules الشعر الخشن حيث تم مجردة المرحلية.
الشكل 1: العذراء تشريح والتصوير (A) يتم إزالة الغطاء الخيشومي من خادرة ذبابة الفاكهة (كما هو موضح هنا في 23 ساعة APF) لفضح رئيس لنيمال. خط منقط يمثل قطعة من الشريط على الوجهين. (B) توضيحات من تلاعب بسيط الحية التصوير. (C و D) مع رئيس المكشوفة، ويتم وضع خادرة في حوالي 35 درجة يستريح على حبة الفازلين. (D) أعلى صورة التكبير من خادرة وضعه على قمة حبة الفازلين. ويوضح موقف ساترة والهدف (وليس الانتباه إلى نطاق). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التدرج التنمية عبر العين العذراء. (A) صورة واحدة من عين العذراء تصويرها في 22.5 ساعة APF. وصفت تقاطعات الملتصقة التي كتبها DE-كاد: GFP وαCat: GFP. والمشروح المنطقة محاصر في (C). (ب) الرسوم التوضيحية من منتصف المرحلة وommatidia نمط بالكامل، في 24 و 41 ساعة APF على التوالي. اثنين 1 ° ق (الأزرق) تطويق تجمع المركزي من أربعة الخلايا المخروطية (أبيض). قبل 41 ساعة APF والزخرفة من الخلايا interommatidial (رمادي فاتح) كاملة: ثلاثة 3 ° الصورة تحتل القمم بديلة واحدة 2 ° أشكال كل جانب من مسدس. ثلاثة الشعر الخشن organules (رمادي غامق) تحيط كل مقيلة. (C) الشرح من منطقة صغيرة من العين (من A). اثنين 1 ° الخلايا (أمثلة الضوء الأزرق الزائفة الملونة) توسيع لتطويق كل حزمة مبصرة. المرحلية (الأخضر والأصفر والأحمر والأزرق الداكن) يقحم في صفوف واحدة. في كل قمة بديلة تتنافس ثلاث خلايا (الموضحة باللون الوردي) لاحتلال مكانة 3 ° (برتقالي اللون). رؤية الأفلام 1-4 لمراقبة هذه الأحداث التي تتكشف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذه شملت رقمه.
الشكل (3): ملخص الإجراء التجريبي الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيلم 1 يتم اختيار التفاف الابتدائي 1 ° الخلايا من مجموعة من الخلايا المحيطة بكل مقيلة الوليدة:. كما اثنين 1 ° الصورة تطويق كل مقيلة والاتصال، الملتصقة تقاطعات تشكل بسرعة (خطوط الوردي). على التوالي 1 °: 1 ° تقاطعات خلية توسيع و1 ° الصورة تبدأ في النمو، وعزل حزم مبصرة من المرحلية المحيطة بها. في البداية المستقبلات الضوئية توهج الزاهية، GFP كثيفة بمناسبة تقاطعات الملتصقة مزيدا من التفاصيل. الصرفية التغيرات جرارسم بشكل ثنائي هذه التقاطعات مبصرة تحت الطائرة من التصوير وتقاطعات X على شكل بين كل مجموعة من أربع خلايا المخروط قمية فوق كل مقيلة تصبح أكثر وضوحا. الصور الأصلية على اليسار. الزائفة التلوين وشروحه قدم إلى لوحات على اليمين. العين تصوير من 21 ساعة APF.
فيلم 2 : intercalaction خلية Interommatidial الخلايا interommatidial (ICS) سلط الضوء باللون الأحمر والأزرق والأصفر والأخضر في البداية تشكيل رباعي يفصل الظهرية (أعلى) وبطني (أسفل) مقيلة لمسافة خليتين. المرحلية الحمراء والصفراء تمتد من الناحية البطنية وظهريا على التوالي (من ر = 42 دقيقة)، مما يجعل الاتصال مع الهدف 1 ° ق 56 دقيقة. المرحلية الزرقاء والخضراء تمتد على نحو مماثل لاستهداف مقيلة المعاكس. "الجديد" 1 °: IC تقاطعات توسيع بسرعة أفقيا. في 112 دقيقة رباعي الأصلي المرحلية له مقحم بالكامل لشركة جنرال الكتريكnerate صف واحد من الخلايا. الصور الأصلية على اليسار. الزائفة التلوين وشروحه قدم إلى لوحات على اليمين. العين تصوير من 23 ساعة APF.
فيلم 3 : المنافسة التعليم العالي في القمم بديلة اثنين أو ثلاث خلايا (الموضحة باللون الوردي) تتنافس لاحتلال مكانة 3 درجات. تظهر إلى 'دفع' جيرانهم جانبا، وخلايا توليد ملحقات الكبيرة التي تصل إلى نحو ommatidia المعاكس. تحتل مكانة 3 ° (برتقالي اللون) غالبا ما تكون عابرة والخلايا إما التراجع أو يتم دفع للخروج من الموقف من قبل جيرانهم. بحلول نهاية هذا الفيلم 217 دقيقة، العديد من 3 ° محاريب يبدو المعمول بها. الصور الأصلية على اليسار. الزائفة التلوين وشروحه قدم إلى لوحات على اليمين. العين تصوير من 23 ساعة APF.
موتتنافس 4: النهائي التقليم الخلايا في محيط organules الشعر الخشن يتم إزالتها من قبل موت الخلايا المبرمج. وأبرز الأمثلة في الأرجواني والأحمر والأصفر والأزرق. على مدار التصوير، وإزالة الخلايا تركت واحد فقط 2 درجة على طول كل ذراع الأفقي للمسدس IC. لم القبض على تشذيب الخلايا الزائدة على الجانبين قطري من مسدس IC في هذا الفيلم. في هذا النمط الجيني وغالبا ما يلاحظ الأخطاء الطفيفة في موضع مجموعات الشعر الخشن (قارن مع الشكل 2B). اثنين من الثلاثة الشعر الخشن مجموعات بالمناورة في محاريب الزاوية أثناء التصوير: إعادة تحديد المواقع على ما يبدو أن يتيسر عن طريق إزالة وحركة المرحلية المجاورة. الصور الأصلية على اليسار. الزائفة التلوين وشروحه قدم إلى لوحات على اليمين. العين تصوير من 26 ساعة APF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وصف للتنمية البرية من نوع (أعلاه) يشكل الأساس لمقارنات بين الأحداث الزخرفة في رني أو الأنماط الجينية overexpression. مقارنات التنمية الأنسجة الحية لا تقدر بثمن عند تحديد بالضبط التي تنظم سلوك الخلية عن طريق بروتين من الفائدة. وعلاوة على ذلك، وليس وصفها هنا، تصوير الخلايا الحية تمكن واحد لجعل أوصاف النوعية و / أو الكمية لدور الجينات في المصالح في الأحداث التي ونمط العين. قبل 30-32 ساعة APF معظم الخلايا الصبغية اكتسبت مواقف مستقرة وموت الخلايا المبرمج ومجردة الخلايا الزائدة من الميدان في شبكية العين. وفي أعقاب ذلك، ويلاحظ التغييرات الطفيفة فقط كما تعتمد على الخلايا الصبغية أشكالها المميزة: 3 ° ق تصبح سداسية، وكما 1 ° ق توسيع بمهارة، وعرض مستطيلة 2 ° الخلايا المجاورة النقصان. جيل لاحق من الصباغ والمادية عدسة المرجح يعيق التصوير الناجح لالملتصقة تقاطعات.
على الرغم من فالاستراتيجية uable، يجب أن يؤخذ عدة عثرات في الاعتبار عند تصوير العين العذراء الحية. أولا، وإزالة حالة العذراء الأمامية يجعل الحيوان عرضة للجفاف، ارتفاع درجة الحرارة، والإصابات أثناء التركيب و التصوير. يمكن الشتائم مثل هذه تربك البيانات عن طريق حفز تنمية الأنسجة الشاذة التي لا صلة لها النمط الجيني قيد البحث والدراسة. ثانيا، بروتوكول الموصوفة هنا يتطلب أن ساترة الزجاج تجعل اتصال مباشر مع رئيس ظهارة العذراء. وقد لاحظنا أن التنمية الشبكية الأكشاك إذا تم تطبيق الضغط المفرط عند الضغط ساترة ضد العين. في الواقع خارجية المنشأ وقد ثبت القوى الميكانيكية في أنظمة أخرى للتأثير على العمليات التنموية بما في ذلك بنية الأنسجة 19،20. لهذه الأسباب فإنه من المهم وضع بلطف جدا ساترة ضد العين. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي انقاذ الشرانق تصويرها من تلاعب التصوير وسمح لتظهر وكأنها الكبار: التحف قدمت أثناء التصوير يمكنغالبا ما يتم الكشف عن طريق مقارنة بين العين وتصويرها من هؤلاء الكبار مع عيون الذباب العمر المتطابقة عن الصليب الأصلي. وعلاوة على ذلك، لا بد من مقارنة البيانات من جلسات التصوير متعددة للتحقق من السلوكيات الخلية. وأخيرا، ينبغي أن تستخدم immunofluoresence القياسية لتحديد ما إذا كان هذا الترتيب، وحجم وعدد الخلايا في الأنسجة المتطابقة المرحلة هي نفسها.
كثيرا ما يستخدم خارج الرحم DCR-2 لتعزيز فعالية رني. ولكن في وجود خارج الرحم DCR-2، IC إقحام وتثبيت مكانة 3 ° وموت الخلايا المبرمج تعطلت في بعض الأحيان (لا تظهر البيانات). وهكذا DCR-2 التعبير ينبغي أن تستخدم بحذر.
بروتوكول الموصوفة هنا يستخدم GFP لتسمية الملتصقة تقاطعات وتقييم التشكل من الخلايا الصبغية في العين العذراء. يمكن بسهولة أن يتم تعديل هذه الاستراتيجية لأغراض أخرى (على سبيل المثال لتقييم مبصرة التشكل). لاتباع نهج مزدوج وضع العلامات، وإضافي UAويمكن إدراج S الجينات المحورة أن تسمية المكونات الأخرى الخلوية من الفائدة (على سبيل المثال الحويصلات أمين، الشبكة الإندوبلازمية، النواة) مع بطاقة غير GFP. ومع كثافة وطول العمر من هذه الجينات المحورة سيتطلب تقييم: طلب تقديم العروض، DsRed وmCherry، على سبيل المثال أثبتت، أن تكون تسميات الفقيرة لتصوير العين العذراء لفترات طويلة المطلوبة لالتقاط الزخرفة خلية الصباغ (لا تظهر البيانات). إذا تحقق السلوكيات خلية السريعة (مثل إفراز) بروتوكول الموصوفة هنا يمكن بسهولة تعديل للفحص المجهري متحد البؤر من البروتينات الفلورية مناسبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| Scotch double stick tape | 3M | 665 | |
| Black Sylgard dissection dish | Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 hr to polymerize | ||
| Sylgard | Dow Corning | SYLG184 | |
| Sylgard (Black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Glass petri dish | Corning | 7220-85 | |
| 25 x 75 x 1 mm glass microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| 22 x 40 mm glass coverslip | VWR | 48393-172 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Whatman 3mm Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-713-336 | |
| Vaseline | Fisher Scientific | 19-086-291 | Or purchase at local pharmacy. |
| 30 ml syringe | Fisher Scientific | S7510-30 | |
| Leica TCS SP5 DM microscope | Leica Microsystems | ||
| LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software | Leica Microsystems |
References
- Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. J. Cell. Sci. 114, 493-501 (2001).
- Oda, H., Tsukita, S. Dynamic features of adherens junctions during Drosophila embryonic epithelial morphogenesis revealed by a Dalpha-catenin-GFP fusion protein. Dev. Genes Evol. 209, 218-225 (1999).
- Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell. 87, 651-660 (1996).
- Cagan, R. Cell fate specification in the developing Drosophila. retina. Dev Suppl. , 19 (1993).
- Bate, M., Arias, A. M. Pattern formation in the Drosophila. retina. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 1277-1325 (1993).
- Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing. Drosophila pupal retina. Mech. Dev. 125, 223-234 (2008).
- Monserrate, J. P., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death Differ. 14, 209-217 (2007).
- Lee, Y. S., et al. Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways. Cell. 117, 69-81 (2004).
- Zitserman, D., Roegiers, F. Live-cell imaging of sensory organ precursor cells in intact Drosophila pupae. J. Vis. Exp. (51), 2706 (2011).
- Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).
- Sato, M., Suzuki, T., Nakai, Y. Waves of differentiation in the fly visual system. Dev. Biol. 380, 1-11 (2013).
- Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mech. Dev. 121, 1523-1530 (2004).
- Larson, D. E., Johnson, R. I., Swat, M., Cordero, J. B., Glazier, J. A., Cagan, R. L. Computer simulation of cellular patterning within the Drosophila pupal eye. PLoS Comput. Biol. 6, e1000841 (2010).
- Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Dev. Biol. 136, 346-362 (1989).
- Cagan, R. L., Ready, D. F. Notch is required for successive cell decisions in the developing Drosophila retina. Genes Dev. 1099, 1112 (1989).
- Miller, D. T., Cagan, R. L. Local induction of patterning and programmed cell death in the developing Drosophila retina. Development. 125, 2327-2335 (1998).
- Sawamoto, K., Okano, H., Kobayakawa, Y., Hayashi, S., Mikoshiba, K., Tanimura, T. The function of argos in regulating cell fate decisions during Drosophila eye and wing vein development. Dev. Biol. 164, 267-276 (1994).
- Yu, S. Y., et al. A pathway of signals regulating effector and initiator caspases in the developing Drosophila eye. Development. 129, 3269-3278 (2002).
- Liu, Z., et al. Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions. Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 9944-9949 (2010).
- Miyake, Y., Inoue, N., Nishimura, K., Kinoshita, N., Hosoya, H., Yonemura, S. Actomyosin tension is required for correct recruitment of adherens junction components and zonula occludens formation. Exp. Cell Res. 312, 1637-1650 (2006).
