Abstract
Drosophila pupa gelişme doğasında süreçleri vardiya ve canlı hücre görüntüleme sırasında izlemek için bireysel hücre davranışı zorlaştıran şekilde göz epitel bozabilir. Bu süreçler şunları içerir: Retina döndürme, hücre büyümesini ve organizma hareketinin. Pupa zorlu bir tek odak düzlemi birkaç ommatidia fazla in-odak görüntüleri elde etmek için yapmak, görüntüleme için hazırlanan Ek olarak, ince darbelere ve dahil epitel topolojisinde, düzensizlikler genellikle tanıtıldı kıvrımlar. iş akışı Drosophila pupa göz gelişimi sırasında hücresel süreçlerin kolay analizini sağlayan, Çareleri burada bu konuları sıraladı. Bu duruma uygun şekilde kademeli pupa kolayca en laboratuvarlarda monte edilebilir bir görüntüleme teçhizat düzenlenmiş Ubikuitin DE-kaderin:., GFP ve GMR-GAL4 -sürümlü UAS-α-katenin GFP göz epitel 1 hücre sınırlarını görselleştirmek için kullanılır -3. Dekonvolüsyon sonraBirden fazla odak düzlemleri yakalanan floresan görüntülere uygulanan maksimum projeksiyon görüntüleri her zaman noktası için oluşturulan ve görüntü düzenleme yazılımı kullanılarak geliştirilmiştir. Hizalama algoritmaları izlemek için tek tek hücre davranışı kolaylaştıran, hızlı bir şekilde gereksiz hareket stabilize etmek için kullanılırlar.
Introduction
Bileşik Drosophila göz aksesuar pigment hücrelerinin 4,5 olan bir petek-kafes ile ayrılmış olan ~ 750 ommatidia kalıplaşmış düzenleme ile karakterizedir. Yerel hücre hareketleri, hücre büyümesinin, hücre şeklinde değişikliklere, ve apoptoz: Bu pigment hücreleri etkinlikleri koordine kombinasyonu ile desenli. Bu epitel Canlı görselleştirme biri bir fizyolojik ilgili ve soğukkanlı üç boyutlu bağlamda bu olayları destekleyen moleküler mekanizmaları çalışma sağlar.
Daha önceki protokollarda 6,7 tersine, burada anlatılan teknik görüntüleme işlemi çıkartılabilir olamaz yabancı doku hareketini stabilize edilmesi için etkili bir yöntem içermektedir. Görüntüleme boyunca, büyür dönen bir doku ve vardiya - Bu yöntem gelişmekte Drosophila pupa göz epitel hücre davranış çalışmaları geliştirir. Ayrıca hareket istikrar tekniği de içindeBurada tarif yabancı hareket meydana başka bağlamlarda hücreleri üzerinde çalışmak için yararlı olacaktır.
Göz özgü sürücü GMR-GAL4 1-3 kontrolü altında GFP: GFP yanı sıra UAS-α-katenin: Drosophila retina alanında hücre sınırlarını görselleştirmek için, transgenik sinek hatları ubi-DE-Kadherin ifade oluşturulur edildi. İki GFP-etiketli membran belirteçlerin kullanımı düşük yoğunlukta ışık hücre sınırlarının görselleştirme sağlar. Bu yüksek enerjili dalga boylarına tekrarlanan maruz kalma, artan sağlayan kare hızı ve film süresine doku hasarı ve photobleaching en aza indirir. UAS DCR-2, aynı zamanda, ikinci bir uçucu hattı 8 dahil edildi RNAi transgenlerinin etkinliğini geliştirmek için.
Önceki protokollerden üçüncü güncellemesinde, kolayca en laboratuarlarda monte basit bir görüntüleme teçhizat açıklanmıştır. Bu cihaz özel bir görüntüleme r olması gerektiğini ortadan kaldırırig bir üniversitenin 'makine dükkanı' veya benzer hizmeti tarafından oluşturulan. Bu görüntüleme kulesi görüntü diğer pupa dokulara 9,10 için kullanılan benzer.
Doğrudan 17-42 saat puparium oluşumu (hr APF) sonra ~ den göz dokusuna katkıda morfogenetik olayları değerlendirmek için kullanılabilecek basit bir canlı hücre görüntüleme protokolü burada sundu. Spesifik olarak, bu protokol, pupa gelişimi esnasında gen ekspresyonunu modifiye sonuçlarını belirlemek için bir olanak sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Şekil 3 deney prosedürünün bir özetini gösterir.
1. Doku Hazırlanması
- C iki kez aşağıdaki çapraz kurmak ilgi konusu bir genin değiştirilmiş ekspresyon sonuçlarını, tespit etmek ve 25 ° C'de korumak için: UAS transgen (erkek) X, GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b (bakire kadın) NOT: Kontrol doku çapraz UAS-lacZ edinmek için GMR-GAL4'e erkekler; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP kadın. β-galaktosidaz retina hücre davranışında kusurları yaratır.
- RNAi transgenlerin etkinliğini artırmak için, çapraz UAS RNAi GMR-GAL4, UAS-DCR-2 erkek; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b bakire kadın.
Not: ektopik DCR-2 gözlenmiştir ifade retinae hücre davranışında sıra kusurları (veriler gösterilmemiştir). Teyakkuz Bu yaklaşım kullanarak, eğer tavsiye edilir. - S1.5 ml mikrosantrifüj tüpler seçilen beyaz uygun genotiplerin ön-pupa ve yer. Pupa DCR-2 ifade ederse, erkek veya kadın pupa seçin: UAS-DCR-2, X kromozomu üzerinde bir ekleme, ifadesi erkeklerde güçlüdür. Pupa pupa halinde pigmentasyonu önce 0 saat APF de cinsiyetli olmalıdır - erkek gonadlar pupa (posterior yaklaşık üçte biri) yan tarafta büyük saydam küreler gibi görünür.
- 25 ° C'de temiz bir plastik ucu-kutusunda, pupa içeren mikrosantrifüj tüpleri inkübe. Pupa yer ucu kutu içine damıtılmış su içinde ıslatılmış bir doku, 10 cm 2 parça, kurumayı önlemek için.
NOT: ucu-kutusunda nem çok yüksek olursa pupa durum daha sonraki adımlarda incelemek için hantal ve zor olabilir. - Uygun bir süre için inkübe edilir. Yaklaşık 17 saat APF, 20 saat APF veya 24 saat AP de görüntüleme için pupa hazırlamak, göz desenlendirme ile ilişkili hücre davranışlarını yakalamak içinF. spesifik hücre davranışları en iyi şekilde gözlenen ne zaman daha fazla tartışma için Temsilcisi Sonuçları gör.
- Siyah sylgard diseksiyon çanak üzerine taze çift taraflı bant bir parça yerleştirin. Çift taraflı bant (Şekil 1A) yapıştırılmış pupa başkanı ile, kadar pupa, dorsal yüzü yerleştirin .try çift taraflı bant pupa toraks ve batın bölgeleri bağlı değil. Forseps ile dikkatlice kaldırın ve pupa kafa maruz kapakçık çıkarın. Bir göz çevresini maruz pupa halinde kenarı boyunca gözyaşı.
- Yavaşça yapışkan bant pupa çıkarın. Pupa yapışık kalırsa, yapışma zayıflatmak için pupa halinde ve bant arasındaki kavşak distile su küçük bir hacim uygulayın.
2. Montaj
- Kurutma kağıdından küçük 15 mm2 çerçeve inşa ve middlethat bir delik çapı 5,5 mm (Şekil 1B) 'dir. Damıtılmış su ve yer daldırınBir mikroskop lamı merkezi. Vazelin düzgün bir halka sıkmak, 30 cc şırınga kullanarak kurutma kağıdı çerçevesini çevreleyen. Vazelin halka pupa genişliğinden daha ve halka çapı bir kapak kayma genişliğinden daha marjinal az olduğunu marjinal yüksek olduğundan emin olun.
- Vazelin boncuk (Şekil 1D) tarafından desteklenen yüzü üzerinde, .Carefully pupa düzenlemek kurutma kağıdı (Şekil 1C) içine sokulur deliğe doğrudan slayt üzerine vazelin küçük bir boncuk ekleyin.
- Vazelin halkasının üstüne bir lamel yerleştirin temas göz neuroepithelium (Şekil 1D) Yukarıdaki epitel böylece. Yavaşça vazelin karşı lamel mühür ve pupa göz bölgesi ve kapak arasında bir küçük düz temas yüzeyi oluşturmak için hazırlık sıkıştırmak.
3. Floresans Görüntüleme
- Image kullanarak pupa hazırlıkfloresan mikroskop. Her 7 dk yakalama adherens kavşak bölgesinde göz neuroepithelium apikal etki yoluyla seri bölümleri.
NOT: a) Uygun bir seri kesitler genellikle 4-5 0.2 mikron z-adımlardan oluşur z-yığını başına bulunmaktadır. b) hafif darbelere ve kıvrımlar dahil epitel topolojisinde, düzensizlikler, doku büyük bölgelerin içinde odak görüntüleri elde etmek için bu zorlu hale getirebilir. Görüntüleme yaparken, bir odakta olması için ilgi alanı bölümünü bulabilirsiniz, ve bir komşu bölge dışı odak olmak. Pupa göz ve lamel arasında distile su küçük bir damlacık da dahil olmak üzere pupa göz morfolojilerinden erken aşamalarında hafif düzensiz topoloji karakteristiği bazı akut doku kat değil ortadan kaldırabilir. Bu durumlarda odakta dilimleri tüm alan için edinilen kadar z-yığını uzatarak doku oversample. c) Her 7 dk önemli Redu olmadan 3 saat 4 için canlı görüntüleme etkinleştirmeniz gerekir seri bölümleri yakalamagörüntü kalitesini bozabilir GFP floresan yoğunluğu ction. Daha kısa zaman aralıkları-görüntüleme toplam süresini azaltabilir. - 3-4 saat için görüntüleme devam edin. Pupa büyüme ve hemolimf pompalama retina ve konumunu taşır yana birçok floresan mikroskoplar geçerli bir otomatik odaklama ve zaman işlevini kullanmak etmeyin uyanık yeniden odaklama her 14-21 dakikada gereklidir. Yavaş veya göz morfojenezini durak olabilir 4 saat ötesinde görüntüleme NOT.
- Arka plan azaltmak ve seri bölüm resimlerin kontrastını artırmak için uygun Dekonvolüsyonun yazılımını kullanın. Her z-yığın dosyası için, (Malzeme Tablo) LAS AF yazılımında aşağıdakileri gerçekleştirin: Araçlar paneline gidin, 3D Dekonvolüsyon seçin ve Uygula'yı tıklatın.
- Her deconvoluted yığın dosyası için maksimum projeksiyon (MP) görüntü oluşturun: Araçlar paneline gidin, 3D Projeksiyon seçin ve Uygula'yı tıklatın.
NOT: Maksimum Projeksiyon algoritması üniforma oluşturmak için başarısız olabiliroversampled olan doku ly odakta görüntü. Out-of-odak bölgelerini bileme için bir tekniktir adım 5.2'de özetlenmiştir.
4. Pupa Rescue and Fenotip Doğrulaması sonrası görüntüleme
- Forseps lamel kaldırmak ve gıda temiz bir şişeye aktarın pupa kullanarak: eserler tanıtıldı veya görüntüleme sırasında zarar pupa, dikkatli görüntüleme teçhizat gelen pupa kaldırmak olup olmadığını ele almak. Oda sıcaklığında saklayın veya 25 ° C yetişkin sinek çıkıncaya kadar.
- Dikkatle yetişkin göz fenotip incelemek ve özgün sinek çapraz çıkan erişkin sinek gözlerine karşılaştırın.
5. Görüntü İşleme
- Otomatik Görüntü Ayarı:
NOT: Canlı Drosophila doku vardiya ve görüntüleme süreci boyunca büyüyecek. Sonuç olarak, görüntülerin merkezleri Drosophila dokusunda aynı noktaya uygun olmayabilir ardışık zaman noktalarında toplandı. Ek olarakTüm retina disk ~ 21 ve 23 saat APF arasında yaklaşık 30 ° döner. Bireysel hücre davranışlarını vurgulamak ve organizma büyüme nedeniyle dağıtıcı unsurları azaltmak, bu elle yapılabilir, her milletvekili image.While, burada kullanılan resim düzenleme yazılımı hizalamak için süreci hızlandırmak yerleşik algoritmaları vardır (Malzeme Tablo).- Stack içine ana menüde, açık Scripts basıp Yük Dosyaları Dosya sekmesinde.
- Yük Katmanlar paneline MP görüntü dosyalarını içe ve Tamam seçeneğini seçin. Otomatik Kaynak Görüntüler seçeneğini hizalayın girişimi seçili olmadığından emin olun.
NOT: Bu seçenek seçilirse, yazılım görüntü verilerini bozan bir hizalama algoritması kullanabilirsiniz. - Tüm MP dosyaları Katmanlar bölmesine yüklenen sonra, tüm görüntüler erken zaman noktası katman yığınının üstünde olacak şekilde kronolojik sırayla olduğundan emin olun. Katmanlar, doğru düzen, sürükle değildir ve onlar sipariş kadar onları bırakın Eğerdoğru.
- Ana menüde Düzenle sekmesinden Otomatik Hizala Katmanlar seçin. Konumlandırmak seçin ve Tamam 'ı tıklatın.
- Otomatik Hizala algoritması ilgili bir odak noktasına çerçeveleri yönlendirmek için başarısız olursa, Taşı aracını kullanarak küçük ayarlamalar yapmak.
- Kompozit Bileme:
NOT: Bir başlangıç milletvekili görüntünün Out-of-odak bölgeleri 'kırpma' LAS AF yazılım gelen deconvoluted yığını ile bilenmiş edilebilir. Bir yığın dosyası Kırpma bir el Maksimum Projeksiyon algoritması tabi z-yığını aralığını sınırlamak için olanak sağlar.- (Süreç sekmesi altında) Araçlar panelinde Kırpma işlevi bulun. Elle onlar başlangıçta out-of-odak bölgesi içinde sadece yapışma kemer kapsayan şekilde ilk ve son dilim kısıtlamak. Bu bölge için optimize edilmiş yeni bir yığın dosyası oluşturmak için Uygula'yı tıklatın.
- TIFF dosyası olarak yerel optimize yığını ve ihracat için yeni bir Maksimum Projeksiyon oluşturun.
- The resim düzenleme yazılımı (Malzeme Tablo), Stack içine (ana menüde Dosya sekmesinde bulunur) açık Script seçin ve Dosyaları Yükle.
- Yük Katmanlar paneline belirli bir zaman noktası için başlangıç MP görüntü dosyası ve yerel optimize MP dosyasını alma ve Tamam seçeneğini seçin. Otomatik Kaynak Görüntüler seçeneğini hizalayın girişimi seçili olmadığından emin olun.
- Katmanlar bölmesinde iki katmanı seçin ve ardından bir muntazam retina alanı içinde odak veren, otomatik iki görüntü uygun bölgeleri maskelemek için (ana menüde Düzenle sekmesinde bulunur) Otomatik Karıştır Katmanlar seçin. TIFF dosyası olarak bu kompozit görüntü kaydetme.
- Tekrar tüm bırakıyorsa MP görüntüler için 5.2.5 ile 5.2.1 adımları.
- Ek Ayarlar: Döndürme, kırpma ve ayarlama Film Katmanlar Düzeyleri:
- Tüm katmanları seçili retinanın dorsal-ventral eksen hizalanmış böylece, görüntüleri döndürmek için Transform aracı (Edit> Free Transform) kullanınFilm çerçevesinin y-eksenine.
- Gerekirse, istenen boyut ve şekline görüş alanını azaltmak için Kırpma aracını kullanın.
- Hücre zarı ve hücre gövdesi arasındaki kontrastı artırmaya yardımcı olmak için (bireysel kare) seviyesi ayarını kullanın.
- Üslup amaçlar için ve her çerçevenin ilgi noktaları vurgulamak için yanlış renk tanıtmak, belirli bir hücre davranışlarını vurgulamak için.
- Animasyon: Bir Film içine Görüntüler dönüştürün:
- Ana menüde Windows sekmesinden Animasyon bölmesini açın. Animasyon bölmesinin sağ üst köşesinde bulunan menüden Katmanlar Kareleri yapın seçin.
- Tabakalar yığının altından başlayarak sırayla animasyon bölmesine eklenir unutmayın. İlk kare, tüm seçin ve ardından Animasyon bölmesi menüsünden Kareleri Ters seçin, kare sırasını tersine çevirmek için.
- Çerçeve başparmak altındaki açılır menüyü kullanarak her kare için bir çerçeve gecikme süresini seçinTırnak.
Not: 1 Bu yazıda sunulan 4 Filmler çerçeve gecikmesi 0.8 sn. - Ve ana menüye, açık İhracat Dosya sekmesinde video Render seçin. Dosya Seçenekleri altında QuickTime Dışa seçin ve istenen video biçimini seçin. Seçenekler Özel olarak Frame Rate set Render altında, 15 bir kare hızı girin ve Render tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pupa göz Canlı görüntüleme neuroepithelium desenlendirme katkıda hücre davranışlarını gözlemlemek için başarılı bir strateji. Belirli proteinlerin rolü kolayca göz gelişimi sırasında protein düzeylerini değiştirmek transgenleri ifade ile tespit edilebilir. Bu GMR-GAL4 yapmak için morfogenetik oluktan arkasında transgen ekspresyonunu tahrik etmek için kullanılır. Bu ilk iki larva dönemi boyunca göz alanını kurmak önceki olayları bozucu değil avantajı sunuyor. Ayrıca birçok RNAi transgenleri etkin bir (veri gösterilecektir) protein düzeylerini düşürmek için önemli bir zaman gerektirir. GMR-GAL4 sürücüsü hattı genellikle yarasız devam etmek metamorfoz sırasında göz disklerin üçüncü larva göz gelişimi ve tersine çevrilmesi sağlayan ve önemli ölçüde pupa göz morfolojilerinden sırasında, sadece daha sonra protein düzeyini azaltır ile Dolayısıyla RNAi transgenleri sürüş. Larva gelişme ancak yüksek verimli RNAi transgen tarafından tedirgin edilirse, haçlar can fly0 saat APF 25 ° C'de aktarılan transgen ekspresyonunu ve pupa azaltmak için 18 ° C'da muhafaza edilmesi. RNAi transgen ifadesi, transkript veya protein seviyelerinin etkinliğini ele almak için (örneğin kantitatif PCR, immunofloresan, imünolekeleme), standart teknikler kullanılarak sahne eşleştirilmiş pupa olarak değerlendirilmelidir.
Larva gelişimi sırasında, her ommatidium fotoreseptör çekirdeklerinin göz diskin 11 ön tarafına posteriorundan geçecek bir dalga olarak alınırlar. Bu gelişimsel degrade pupa göz muhafaza edildi. Nitekim, zaman 22.5 saat APF, GMR-GAL4, UAS-DCR-2 desenlendirme görüntülü; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b retinae (Şekil 2) arka bölgede belirgin daha olgun oldu. Bu retinae fenotipi, vahşi tip uçucu suşları ile karşılaştırılabilir olmuştur (veriler gösterilmemiştir). Geleneksel pupa göz morfogenez gelişim zamana göre tarif edilmektedir (örneğin,saat APF). Ancak, belirgin gelişimsel degrade aşağıdaki olaylara göre göz desenlendirme açıklayan öneriyoruz çünkü:
1 ° sarma (Şekil 2 ve Film 1): Başlangıçta çok sekiz hücre doğrudan fotoreseptör demetleri temasa geçti. İki hücre - genellikle anterior ve posterior hücreleri - Primer (1 ° s) olarak alındı. Bu 1s hızla sabit bağlantı yerleri meydana getirmek üzere birbirlerine bağlayarak, fotoreseptör demetleri çevrili. Farklılaşmamış hücreler interommatidial (IC) her ommatidial gruplandırma arasında dağınık bir şekilde yatıyordu. 1 ° hücre alımı ile eşzamanlı, apoptoz 12 (değil Film 1 açıklamalı) daha önce açıklandığı gibi IC havuz yaklaşık% 5 budanır.
IC ardalanması (Şekil 2 ve Film 2): 1 ° s sarılmış ve her fotoreseptör paket hakkında mühürlü olarak, yerel cell hareketleri her ommatidium dorsal ve ventral kenarlarında gruplandırılmış IC yeniden. Birden gelen ardalanmalı IC tek bir satır halinde (genellikle iki) satır. Hareketli IC hedef pozisyonu güvenle büyük 'hücresel uzantıları' yön projeksiyon gözlemleyerek yabani tip dokusunda tahmin edilebilir. 1 ° hücrelerinin büyüme eşlik etti ve büyük olasılıkla IC ardalanmasından 13 katkıda bulunmuştur. Birçok IC ikincil hücreler (2 ° s) olarak ayırt etmek üzerine gidecek (gösterilmemiştir).
3 ° yarışma (Şekil 2 ve 3 Film): interkalasyonu ardından, üç IC üçüncül (3 °) niş işgal yarıştı. Bu dinamik savaşta, hücreler sık sık yerinden edilmeden önce az 5-10 dakika gibi 3 ° niş işgal etti. Sonunda tek bir hücre istikrarlı 3 ° niş kurdu.
Nihai budama (Şekil 2 ve Film 4): Apoptoz 3,15-18 bir dalgalanma verimli bileşik göz 5,14 karşısında düzgün altıgen IC kafes oluşturmak için gerekli olan minimum IC sayısını azalttı: üç 3 ° s ve her ommatidium yaklaşık altı 2 ° s. Daha önce belirtildiği gibi, çoğunlukla kılların yakın yatan bu aşırı IC apoptoz 7 suretiyle bertaraf edilmiştir. Biz IC interkalasyonu ve 3 ° niş kurulması ile hücre ölümü eşzamanlı gözlenen ve bu olayların verimliliğine katkıda aşırı hücrelerin bu budama öneriyoruz. IC budanır Buna ek olarak, fırça kılı organules ince yeniden konumlandırma genellikle gözlenmiştir.
Şekil 1:. Pupa diseksiyonu ve görüntüleme (A) operkulum (23 saat APF burada gösterilen) bir Drosophila pupa kaldırılır a başını maruzNimal. Noktalı çizgi çift taraflı bant bir parça temsil eder. Basit canlı görüntüleme teçhizat (B) Çizim. Kafa maruz ile (C ve D), pupa yaklaşık 35 ° vazelin boncuk dayanan konumlandırılmış. (D) vazelin boncuk üstüne yerleştirilmiş bir pupa yüksek büyütme görüntü. lamel ve objektif pozisyonu (ölçekte çizilmiş değildir) gösterilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: pupa, göz içinden gelişme gradyanı kullanılabilir. (A) 22.5 saat APF görüntülü bir pupa gözün tek bir görüntü. GFP ve αCat: adherens kavşak DE-Cad tarafından etiketli GFP. Kutulu bölge içinde açıklamalı (C). (B) sırasıyla 24 ve 41 saat APF de orta evre ve tam desenli ommatidia, illüstrasyonlar. İki 1 ° s (mavi) dört koni hücreleri (beyaz) bir merkezi çevreleyen gruplama. Interommatidial hücreler (açık gri) desenlendirme APF 41 saat tamamlandığını: üç 3 ° s alternatif köşeleri ve tek 2 ° formları altıgen her tarafı işgal. Üç organules (koyu gri) her ommatidium çevreleyen kıl. (A) göz küçük bir bölgeye (C) ek açıklama. İki 1 ° hücreleri (pseudo-renkli ışık mavi örnekleri) her fotoreseptör paket kuşatmak için genişletin. Tek sıra halinde IC (yeşil, sarı, kırmızı ve koyu mavi) birleşip. (Pembe özetlenen) üç hücre rekabet her alternatif köşe 3 ° niş (renkli turuncu) işgal etmek. Açılımı bu olayları gözlemlemek için Filmler 1-4 bakın. Bu figür daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınızör.
Şekil 3:. Deneysel işlemin özeti bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Film 1 :. primer ambalaj 1 ° hücreler her acemi ommatidium çevreleyen hücreler havuz arasından seçilir. İki 1 ° s her ommatidium kuşatmak ve bağlantı gibi, kavşaklar hızla (pembe çizgiler) oluşturmak adherens. düz 1 °: 1 ° hücre kavşaklar genişletmek ve 1 ° s çevreleyen IC gelen fotoreseptör demetleri yalıtım, büyümeye başlar. Başlangıçta fotoreseptör ayrıntılı adherens kavşakları işaretleme, parlak yoğun GFP kızdırma. Morfolojik gra değiştiririkili olarak netleşir ommatidium görüntüleme ve her tepesinde dört apikal koni hücreleri her set arasında X-şekilli kavşak düzleminin altında bu fotoreseptör kavşaklar çizin. Soldaki Orijinal görüntüler; sözde renklendirme ve açıklamalar sağ panellerin içine tanıttı. Göz 21 saat APF gelen görüntülenmiş.
Film 2 :. Interommatidial hücre intercalaction interommatidial hücreler (IC) vurgulanan, kırmızı, mavi, sarı ve iki hücre mesafeye göre bir dorsal (üstte) ve ventral (alt) ommatidium ayıran bir kadranı oluşturur başlangıçta yeşil. Kırmızı ve sarı IC 56 dakika ile hedef 1 ° s temas, ventral ve dorsal (sırasıyla t = 42 dk) germek. mavi ve yeşil IC benzer zıt ommatidium hedef genişletmek. 'Yeni' 1 °: IC eklemleri hızla yanal genişletin. 112 dk IC orijinal kadran ge tamamen interkalate vardırHücrelerin tek bir satır nerate. Soldaki Orijinal görüntüler; sözde renklendirme ve açıklamalar sağ panellerin içine tanıttı. Göz 23 saat APF gelen görüntülenmiş.
Film 3 :. Tersiyer rekabet alternatif köşe, iki ya da üç hücreleri de (pembe özetlenen) 3 ° niş işgal için yarışırlar. 'Itme' görünen komşularının kenara, hücreler karşısında ommatidia doğru ulaşmak büyük uzantıları oluşturur. 3 ° niş (renkli turuncu) işgal genellikle geçicidir ve hücrelerin geri veya komşuları tarafından yerinden çıkarılarak itilir ya. Bu 217 dk filmin sonunda, birçok 3 ° niş kurulan görünür. Soldaki Orijinal görüntüler; sözde renklendirme ve açıklamalar sağ panellerin içine tanıttı. Göz 23 saat APF gelen görüntülenmiş.
Movie 4:. Nihai budama kıl organules yakın hücreler apoptoz ile uzaklaştırılır. Örnekler, mor, kırmızı, sarı ve mavi vurgulanır. Görüntüleme boyunca, hücrelerin çıkarılması IC altıgen her yatay kol boyunca sadece bir 2 ° bıraktı. IC altıgen çapraz tarafta aşırı hücre Budama bu filmde yakalanan değildi. Bu genotip içinde kıl grubu yerleştirilmesinde küçük hatalar genellikle (Şekil 2B ile karşılaştırın) gözlenmiştir. Üç İki görüntüleme sırasında köşe niş içine manevra kıl grupları: konumlandırma yeniden komşu IC kaldırılması ve hareket kolaylaştırılabilir ortaya çıktı. Soldaki Orijinal görüntüler; sözde renklendirme ve açıklamalar sağ panellerin içine tanıttı. Göz 26 saat APF gelen görüntülenmiş.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
yabani tip geliştirme (yukarıda) açıklaması RNAi desenleme olayları veya aşırı ekspresyonu genotip karşılaştırmalar için temel oluşturur. Hücre davranışları ilgi protein tarafından düzenlenir hangi kesin belirlerken canlı doku gelişiminin Karşılaştırmalar paha biçilmezdir. Bundan başka, burada tarif edilmeyen, canlı hücre görüntüleme bir desen göz olaylarda ilgi konusu bir genin rol kalitatif ve / veya kantitatif tanımlama yapmak mümkün kılar. 30-32 saat APF en pigment hücreleri istikrarlı pozisyonları elde etmiş ve apoptoz retina alanında aşırı hücreleri budanır etti. 1 ° nin kurnazca genişletmek gibi komşu dikdörtgen 2 ° hücrelerinin genişliğini azaltır, 3 ° altıgen hale s ve: Bunu takiben, sadece ince değişiklikler pigment hücreleri kendi karakteristik şekiller kabul olarak görülmektedir. Pigment ve lens malzemesinin sonraki nesil muhtemel adherens kavşak başarılı görüntüleme engellemektedir.
Bir val rağmenCanlı pupa göz görüntüleme sırasında uable strateji, çeşitli tuzaklar akılda olmalıdır. İlk olarak, ön pupa davayı kaldırarak montaj ve görüntüleme sırasında dehidrasyon, aşırı ısınma ve yaralanma hayvan özellikle savunmasız hale getirir. Bu gibi hakaretler inceleme altında genotipi ile ilgili değildir atipik doku gelişimini uyararak verileri etkilemesi. İkincisi, burada açıklanan protokol cam lamel pupa kafa epitel ile doğrudan temas gerektirir. Biz göze karşı lamel iterek aşırı basınç uygulanırsa retina gelişimi tezgahları olduğunu gözlemledik. Gerçekten de eksojen mekanik kuvvetlerin doku yapısının 19,20 içeren gelişim süreçleri etkilemeye diğer sistemlerde gösterilmiştir. Bu nedenlerle çok nazikçe göz karşı lamel yerleştirmek önemlidir. Ayrıca, görüntülü pupa görüntüleme teçhizat kurtarıldı ve yetişkinler olarak ortaya izin verilmelidir: eserler görüntüleme sırasında tanıtıldı olabilirgenellikle orijinal çapraz yaştaki sinekler gözleri bu yetişkinlerin görüntülü göz karşılaştırarak tespit. Ayrıca, birden fazla görüntüleme oturumları veri hücre davranışlarını doğrulamak için karşılaştırılması gerekir. Son olarak, standart immunofluoresence evre uyumlu dokuda düzenleme, boyutu ve hücre sayısı aynı olup olmadığını belirlemek için kullanılır.
Ektopik DCR-2 sık RNAi etkinliğini arttırmak için kullanılır. Bununla birlikte, dış DCR-2 IC interkalasyonu, 3 ° niş ve apoptoz stabilizasyonu mevcudiyetinde zaman (veriler gösterilmemiştir) bozuldu. Böylece DCR-2 ifadesi dikkatli bir şekilde kullanılmalıdır.
Etiket kavşakları adherens ve pupa göz pigment hücrelerinin morfojenezini değerlendirmek için burada açıklanan protokol GFP kullanır. Bu strateji, kolayca (örneğin, fotoreseptör morfojenezini değerlendirmek için) başka amaçlar için modifiye edilebilir. Bir çift-etiketleme yaklaşımı için, ek UAOlmayan GFP etiketleri ile diğer hücresel ilgi bileşenlerini (örneğin sekreter veziküller, endoplazmik retikulum, çekirdek) etiketlemek S transgenleri dahil edilebilir. Bu transgenler yoğunluğu ve uzun ömürlü bir değerlendirme gerektirir Bununla birlikte: RFP, DsRed ve mCherry, örneğin, Pigment hücresi modelli yakalamak için gereken uzun süre pupa göz görüntüleme zayıf etiketler olduğu kanıtlanmıştır (veriler gösterilmemiştir). Hızlı hücre davranışlarını (örneğin salgı) soruşturma varsa burada açıklanan protokol kolayca uygun floresan proteinleri konfokal mikroskopi için modifiye edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| Scotch double stick tape | 3M | 665 | |
| Black Sylgard dissection dish | Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 hr to polymerize | ||
| Sylgard | Dow Corning | SYLG184 | |
| Sylgard (Black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Glass petri dish | Corning | 7220-85 | |
| 25 x 75 x 1 mm glass microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| 22 x 40 mm glass coverslip | VWR | 48393-172 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Whatman 3mm Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-713-336 | |
| Vaseline | Fisher Scientific | 19-086-291 | Or purchase at local pharmacy. |
| 30 ml syringe | Fisher Scientific | S7510-30 | |
| Leica TCS SP5 DM microscope | Leica Microsystems | ||
| LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software | Leica Microsystems |
References
- Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. J. Cell. Sci. 114, 493-501 (2001).
- Oda, H., Tsukita, S. Dynamic features of adherens junctions during Drosophila embryonic epithelial morphogenesis revealed by a Dalpha-catenin-GFP fusion protein. Dev. Genes Evol. 209, 218-225 (1999).
- Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell. 87, 651-660 (1996).
- Cagan, R. Cell fate specification in the developing Drosophila. retina. Dev Suppl. , 19 (1993).
- Bate, M., Arias, A. M. Pattern formation in the Drosophila. retina. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 1277-1325 (1993).
- Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing. Drosophila pupal retina. Mech. Dev. 125, 223-234 (2008).
- Monserrate, J. P., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death Differ. 14, 209-217 (2007).
- Lee, Y. S., et al. Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways. Cell. 117, 69-81 (2004).
- Zitserman, D., Roegiers, F. Live-cell imaging of sensory organ precursor cells in intact Drosophila pupae. J. Vis. Exp. (51), 2706 (2011).
- Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).
- Sato, M., Suzuki, T., Nakai, Y. Waves of differentiation in the fly visual system. Dev. Biol. 380, 1-11 (2013).
- Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mech. Dev. 121, 1523-1530 (2004).
- Larson, D. E., Johnson, R. I., Swat, M., Cordero, J. B., Glazier, J. A., Cagan, R. L. Computer simulation of cellular patterning within the Drosophila pupal eye. PLoS Comput. Biol. 6, e1000841 (2010).
- Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Dev. Biol. 136, 346-362 (1989).
- Cagan, R. L., Ready, D. F. Notch is required for successive cell decisions in the developing Drosophila retina. Genes Dev. 1099, 1112 (1989).
- Miller, D. T., Cagan, R. L. Local induction of patterning and programmed cell death in the developing Drosophila retina. Development. 125, 2327-2335 (1998).
- Sawamoto, K., Okano, H., Kobayakawa, Y., Hayashi, S., Mikoshiba, K., Tanimura, T. The function of argos in regulating cell fate decisions during Drosophila eye and wing vein development. Dev. Biol. 164, 267-276 (1994).
- Yu, S. Y., et al. A pathway of signals regulating effector and initiator caspases in the developing Drosophila eye. Development. 129, 3269-3278 (2002).
- Liu, Z., et al. Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions. Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 9944-9949 (2010).
- Miyake, Y., Inoue, N., Nishimura, K., Kinoshita, N., Hosoya, H., Yonemura, S. Actomyosin tension is required for correct recruitment of adherens junction components and zonula occludens formation. Exp. Cell Res. 312, 1637-1650 (2006).
