Summary
Arteriell stivhet er en nøkkelfaktor i hjerte-og karsykdommer og puls bølgehastighet (PWV) kan betraktes som et surrogat indeks for arteriell stivhet. Denne protokollen beskriver et bildebehandlings algoritme for beregning PWV hos mus basert på ultralyd bildebehandling som gjelder på ulike arterielle nettsteder.
Abstract
Arteriell stivhet kan evalueres ved å beregne pulsbølgehastighet (PWV), dvs. den hastighet med hvilken puls bølgen i en ledning kar. Denne parameteren blir stadig undersøkt i små gnagermodeller hvor det er brukt for å vurdere endringer i vaskulær funksjon knyttet til bestemte genotyper / behandlinger eller for å karakterkardiovaskulær sykdom progresjon. Denne protokollen beskriver et bildebehandlings algoritme som fører til ikke-invasiv arteriell PWV måling i mus ved hjelp av ultralyd (US) bilder bare. Den foreslåtte teknikk som har blitt brukt for å vurdere abdominal aorta PWV i mus og evaluere dets alder-assosiert endringer.
Bukaorta amerikanske skanninger er hentet fra mus i henhold til gassanestesi ved hjelp av en bestemt amerikanske enheter utstyrt med høyfrekvente amerikanske sonder. B-mode og Pulse Wave-Doppler (PW-doppler) bildene ble analysert for å oppnå diameter og midlere hastighet momentane verdier, henhold. For dette formålet, er kantdeteksjon og kontur sporing teknikker ansatt. Enkelt-beat midlere diameter og hastighetsbølgeformer er innrettet tid og kombinert for å oppnå den diameter-hastighet (LND-V) sløyfe. PWV-verdier oppnås fra helningen av den lineære delen av sløyfen, som tilsvarer den tidlige systoliske fasen.
Med den foreliggende løsning, anatomisk og funksjonell informasjon om musen abdominale aorta kan være en ikke-invasiv oppnådd. Krever behandlingen av amerikanske kun bilder, kan det representere et nyttig verktøy for ikke-invasiv karakterisering av forskjellige arterielle steder i mus i form av elastiske egenskaper. Anvendelsen av den foreliggende teknikk kan lett utvides til andre vaskulære distrikter, slik som arteria carotis, og dermed gi mulighet for å oppnå en multi-site arteriell stivhet vurdering.
Introduction
Musemodeller er i økende grad anvendt for undersøkelse av kardiovaskulær sykdom (CVD) og spesielt anvendt i longitudinelle studier som tillater karakterisering av ulike faser av sykdomsutviklingen 1. Elastiske egenskaper av store arterier er relatert til forskjellige patologiske tilstander; fra et teknisk synspunkt, kan arteriell stivhet bli vurdert ved å måle pulsbølgehastighet (PWV), som representerer den hastighet med hvilken puls bølgen i en rørledning kar 2. På grunn av sin kliniske betydning, er det stadig måles selv i prekliniske små dyremodeller 3.
Forskjellige teknikker er tilgjengelige for å vurdere PWV i mus. Invasive metodene er basert på bruk av kateter-spissen trykktransdusere. PWV bedømmes ved å skaffe trykksignaler på to forskjellige steder arterielle og dividere avstanden mellom to måle serne av tidsforskyvningen mellom signalene 4. Den viktigste ulempen i forbindelse med slike metoder er at de krever dyr offer for evaluering av avstanden mellom de to målesteder og kan således ikke brukes i langsgående studier. For å overvinne denne begrensningen, ikke-invasive metoder, basert på ulike bildeteknikker, har blitt utviklet. Tidligere studier har rapportert PWV vurderinger i mus som oppnås ved bruk av transittiden metoden på velocity-kodet magnetisk resonanstomografi data 5 og Pulsed-Doppler signaler 6. Men PWV verdien oppnådd med disse metodene er en regional vurdering av arteriell stivhet. Faktisk, den representerer en gjennomsnittsverdi, og står for forskjellige arterier når det gjelder størrelse og elastiske egenskaper. I tillegg er slike evalueringer krever vurdering av avstanden mellom de to målinger områder som er en feilkilde som kan influence det endelige resultatet.
PWV kan vurderes ved hjelp av diameter-hastighet (LND-V) løkke 7. Denne metoden er basert på den samtidige evaluering av diameter og strømningshastighetsverdier i en valgt kar. Ifølge denne løsning blir LND-V løkke som oppnås ved plotting av diameterverdiene naturlige logaritme vs bety hastighetsverdier og PWV anslås ved å beregne helningen av den lineære del av den oppnådde sløyfe som tilsvarer den tidlige systoliske fasen. Med hensyn til den praktiske gjennomføringen av denne metoden, har tidligere arbeider allerede rapportert resultater om sin søknad i en in vitro set-up system 7 og bruken for vurdering av både carotis og femoral PWV hos mennesker 8.
Hovedmålet med denne studien er å gi en detaljert beskrivelse av et bildebehandlings algoritme som gir en ikke-invasiv arteriell PWV måling i mus ved hjelp av US bilder. Den foreslåtte løsning tillater evaluering av lokale arteriell stivhet ved hjelp av behandling av både B-mode og Pulsed-Wave Doppler (PW-doppler) bilder, og kan påføres på arterier av avgjørende betydning, slik som den abdominale aorta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøk ble utført i henhold til EU-direktiv (2010/63 / UE) og den italienske lov (D.Lvo 26/2014), og det fulgte prinsippene i forsøksdyr omsorg. The Local Etisk godkjenning Panel godkjent studiet.
1. Imaging Prosedyre
- Plassere musen i en anestesiinduksjons kammer fylt med 2,5% isofluran i 1 l / min rent oksygen. Bekreft anestesidybden ved manglende respons på tå klype.
- Plasser dyret på en temperaturstyrt bord i liggende stilling. Fukt dyrets øyne med øyensalve, for å unngå dem kjører tørr. Levere bedøvelse gasstrømmen (1,5% isofluran) ved å plassere musen nese i den dedikerte nesen membran. Hvis det er nødvendig, kan du justere andelen av isofluran fra sak til sak, avhengig av dyret under studien. Fest styret temperatur på 40 ° C.
- Smør fire lemmer av dyret med ledende lim og tape dem på EKG-elektrodene innebygd iborde. Mål kroppstemperatur med en rektal probe smøres med vaselin. Kontroller at alle fysiologiske målinger (EKG og respirasjon signal samt temperatur) er korrekt kjøpt og vist.
- Fjern hår kjemisk fra magen med Hårfjerningskrem og strøk den med akustisk kopling gel.
- Plasser (13-24 MHz) US sonde i mekanisk arm.
- Fest US sonden parallelt til dyret og justere sin posisjon for å oppnå langsgående bilder av den abdominale aorta med den regionen av interesse lokalisert i den sentrale sone.
- Samle anatomisk informasjon.
- Klikk på knappen slik at den høye bildefrekvensen EKG-gated oppkjøpet 9 velger en bildefrekvens oppkjøp lik 700 fps og starte kjøp. Merk: På denne måten anatomiske bilder av fartøyet knyttet til en enkelt hjertesyklus kan bli kjøpt opp.
- Samle strømningshastighet informasjon. </ Strong>
- Bruke samme scan projeksjon, klikk på PW-doppler-knappen, plasserer prøvevolumet i midten av skipet og hente bilder som sikrer at cine loop er ikke kortere enn 3 s. Få tak i disse dataene opprettholde den vinkelkorreksjon så liten som mulig, justere det fra sak til sak på grunnlag av den amerikanske projeksjon oppnådd.
- Ta dyret fra temperaturkontrollerte brettet og venter på fullstendig gjenoppretting.
MERK: I vår erfaring er dette tar ca 10 min. Ikke la og dyr uten tilsyn før det har gjenvunnet nok bevissthet til å opprettholde sternal recumbency.
2. Post-prosessering
- Export B-mode og PW-doppler bilder som DICOM-filer og lagre dem på en personlig datamaskin. Transform PW-doppler DICOM-filer til TIFF-bilder.
- Prosess B-mode bilder.
- Importer tilsvar DICOM-fil ved hjelp av den dedikerte Graphical User Interface (GUI).
- Å initial konturer, tegne en linje nær langt veggen av fartøyet (ett klikk for å starte den, og dobbeltklikk for å få slutt det), og dobbeltklikk nær nær veggen. En linje parallelt med at nær langt veggen vises automatisk. Påfør algoritmen på en enkelt ramme ved å trykke på "ANALYSE" -knappen.
- Sjekk resultatet. Hvis kantene er korrekt identifisert (ie., Har utviklingen av initialisert punktene oppdaget både bakre og fremre vegg), gjelder algoritmen på hele cine-sløyfen ved å klikke på "GO" knappen. Hvis kantene ikke blir korrekt identifisert, fjerne dem ved å klikke på "Clear Contour" og initial dem igjen ved å gjenta punkt 2.2.2.
MERK: Algoritmen er basert på kantdeteksjon og kontur sporingsteknikker og har tidligere blitt beskrevet i detalj 10. - Skaff det endelige resultatet ved å trykke på "Record" -knappen og lagre korresponding .mat fil som inneholder øyeblikke diameter verdier knyttet til en enkelt hjertesyklus.
- Åpne GUI for LND-V sløyfe gjennomføring.
- Klikk på "VELOCITY" -knappen for å starte PW-doppler bildebehandling som fører til en enkelt-beat gjennomsnittshastighet kurve.
- Identifiser PW-doppler spor og finne en linje som tilsvarer en hastighetsverdi lik null ved å trykke på "WHITE LINE" -knappen.
- Utfør hastighet kalibrering og tid kalibrering ved å bruke "VELOCITY" og "Time" knappene (i kalibreringspanelet), henholdsvis. Ved å trykke på disse knappene gjør det mulig å trekke en linje som har lengde tilsvarer kalibreringsfaktoren inn.
- Velg en ROI som inneholder de fysiologiske signaler ved å bruke "ROI PHYSIO" -knappen manuelt.
- Velg en ROI som inneholder PW-doppler spor ved å trykke på "ROI SIGNAL" -knappen manuelt.
- cLIck på "ANALYSE" knappen og se om konvolutten er identifisert. Hvis resultatet ikke er tilfredsstillende, endre terskelen (ved å skrive den nye verdien i "Velocity Threshold" redigerbart tekstfelt) og trykk på "ANALYSE" igjen. Tune terskelen fra sak til sak, avhengig av kvaliteten på bildene. Trykk på "utdypning" -knappen.
- Finn R-toppene i EKG-signalet og dele hastigheten konvolutt signal tilsvarende ved å klikke på «Oppdater» -knappen. Velg beats som ikke er ødelagt av støy eller plassert i inspirasjonsfasen ved å klikke på "VELG BEATS" -knappen. På denne måte oppnå en enkel-slag gjennomsnittshastighet bølgeform.
- Bruk Fast Fourier Transform fremgangsmåte for å interpolere de valgte beats i frekvensdomenet og gjør dem alle består av det samme antall punkter, som beskrevet i referanse 11. Utfør denne operasjonen automatisk ved å trykke på returne tasten på PC-tastaturet når beats er valgt. Hvis "midlere hastighet" er merket av singelen takt gjennomsnittshastighet signal oppnås ved å dele den maksimale hastighet kurve med to, hypoteser en parabolsk hastighetsprofil 12. Trykk på "OK" -knappen.
- Klikk på "DIAMETER" -knappen. Interpolere diameteren bølgeformen enkelt-beat i tidsdomenet for å oppnå et signal enkelt-beat diameter med den samme prøven frekvens som den enkelt-slag hastighetssignalet ved å trykke på "interpolere" -knappen. Klikk på "OK" -knappen.
NB: For å få den enkelt-beat diameter og midlere hastighet kurver med den samme prøven frekvens og det samme antall datapunkter, blir de interpolert i frekvensdomenet. - Velg "Second derivat" tilnærming som justeringsmetode (over grafen som viser de diameter og hastighetsbølgeformer) og klikk på "UPDATE" knapn. De to kurvene blir automatisk tidsjusteres ved hjelp av den andre deriverte metoden 14.
- Bygg den endelige LND-V løkke ved å plotte den naturlige logaritmen av diameterverdiene enkelt slo mot én-beat bety hastighetsverdier. Dette gjøres automatisk når de to bølgeformer er på linje. Merk: punkter som er innbefattet mellom 5% og 90% av den maksimale verdi av den enkelt-slag gjennomsnittshastighet kurve blir automatisk plassert, og en lineær interpolering på disse punktene er brukt for å evaluere helningen av den lineære delen av sløyfen.
- Beregn PWV henhold til den følgende ligning 7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den foreslåtte tilnærmingen har blitt brukt til mus i hovedpulsåren i en tidligere studie 11. Følgende figurer viser resultatene av anvendelsen av den beskrevne metode på virkelige mus bilder. Disse data er fra et enkelt dyr (villtype mus, 13 uker gamle, stamme: C57BL6, vekt: 33 g) Særlig figur 1 representerer resultatet av analysen av de amerikanske bildene. Edge deteksjon og kontur sporing teknikker som brukes på B-mode bilder anskaffet med høy bildefrekvens EKG-gated modalitet gir bølgeformen diameter; på den annen side, identifisering av den PW-doppler-signalet konvolutt fører til enkelt-beat gjennomsnittshastighet kurve vurdering. Evalueringen av enkelt-slag bety hastighetsbølgeformer som omfatter et gjennomsnitt av data fra forskjellige hjertesykluser. For dataene vist, standardavviket av hastighetskurvene (beregnet som gjennomsnittet av standardavviket erholdt vedhvert tidspunkt) er 0,0137 m / sek.
Single-beat-diameter og midlere hastighet kurver interpoleres i både frekvens og tidsplanet og deretter tid justert (figur 2A). Den LND-V løkke blir oppnådd ved å plotte de diameterverdiene naturlige logaritme lignet med de midlere hastighetsmålinger, som vist i figur 2B. PWV blir vurdert ved å beregne helningen av den lineære delen av sløyfen, som er kjent for å tilsvare den tidlige systoliske fasen. Denne delen blir automatisk identifiseres som den som svarer til den upslope av den midlere hastighet kurve. Disse tallene viser at bildebehandlingsoperasjoner som kreves for anvendelse av den foreslåtte teknikk fører til en endelig LND-V sløyfe som er lik den som oppnås hos mennesker ved bruk av en lignende tilnærming 7. Dette tyder på at denne teknikken kunne representere et gyldig alternativ for ikke-invasiv PWV vurdering i mus.
Figur 1: Behandling av B-mode og bilder PW-doppler. B-modus bilder (a) er behandlet ved hjelp av kantdeteksjon og kontur sporing teknikker. PW-dopplerbilder (b) er behandlet for identifikasjon av konvolutten signal hvorfra enkelt-slag gjennomsnittshastighet bølgeform blir oppnådd. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Gjennomføring av LND-V Løkke for PWV beregning. Diameter og gjennomsnittshastighet bølgeformer hentet fra B-mode og PW-doppler bildebehandling. (A). Den LND-V løkke blir oppnådd ved å plotte den naturlige logarithm av diameterverdiene mot de midlere hastighetsverdier (b). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien har et bildebehandlings algoritme basert på LND-V sløyfe for PWV vurdering i mus er beskrevet i detalj. Den foreslåtte metode er basert på behandling av amerikanske bare bilder, og dermed kunne representere et verdifullt alternativ til eksisterende teknikker 6, 13 for evaluering av arteriell stivhet i musemodeller. Faktisk omvendt til invasive metoder 6 som er basert på kjøp av intra-arterielle trykksignaler og som krever et dyr som skal avlives, er denne teknikken fullstendig ikke-invasiv og kan således være spesielt egnet i tilfelle av langsgående studier. I tillegg gir det en evaluering av arteriell stivhet som er lokale og ikke regionalt. Selv om den foreslåtte fremgangsmåte er kjent for å bli påvirket av den reflekterte bølge 15, kan det tilveiebringe en mer nøyaktig vurdering PWV med hensyn til andre US-baserte metoder for lokal PWV vurdering, slik som basert på strømnings-området teknikk 13 som krever tilegnelse av farge-strømningsdata i tverrsnittsprojeksjon. Den PWV verdi vist i "Representative resultater» -delen er lik 1,69 m / sek, er i tråd med hva som er rapportert i referanse 11: faktisk, i denne studien, abdominal aorta PWV var lik 1,91 ± 0,44 m / sek i voksen mus og 2,71 ± 0,63 m / sek i gamle dyr.
For å minimere feil i PWV vurderinger, har stor oppmerksomhet må betales når anskaffe oss bilder. Særlig bør B-mode bilder bli kjøpt med veldig klare fremre og bakre veggene for å oppnå en diameter kurve som ikke er ødelagt av støy. Med hensyn til PW-dopplerbilder, bør vinkelen korreksjon bli minimalisert. Verdien på 60 grader kan representere, i de fleste tilfeller et godt kompromiss mellom en god lang akse visning og en god tilnærming til hastighetskomponenter. Furthermore, i tilfelle av langsgående studier med gjentatte målinger, bør man være forsiktig i avbilding av fartøyet på samme måte, dvs. med den samme scan projeksjon.
Den største begrensningen av den presenterte tilnærming gjelder det faktum at bildene som kreves for diameter og midlere hastighet bølgeform vurderinger ikke anskaffes samtidig. Denne mangelen på samtidighet kan representere en feilkilde for PWV vurdering og gjøre målingen mindre presis. I tillegg vil en reell samtidig oppkjøp garantere en bedre tidsutjevning mellom de to kurvene og unngå problemer knyttet til hjertefrekvensvariasjon. Fra et praktisk synspunkt, kan en annen begrensning være mangel på tilgjengelighet av den høye bildefrekvensen EKG-gated modalitet. Dette problem kan delvis overvinnes ved å skaffe bilder i B-modus modalitet og justering av innhentingsparametrene for å oppnå den høyeste tidsmessig oppløsning. I dette tilfellet, bør diameteren signalvære delt på EKG base og behandlet på samme måte som den hastighetssignalet, for å oppnå et enkelt slag diameter bølgeform. Men i noen tilstander, den oppnådde tidsoppløsningen vil ikke være hensiktsmessig for å oppnå en gyldig diameter signal. Fremtidige endringer i bildeprosesseringskjeden forsøkte å overvinne disse begrensningene ville forbedre teknikk og fører til en mer nøyaktig vurdering av lokal arteriell stivhet.
Fremtidige anvendelser av presenterte tilnærming ville gjelde andre arterielle distrikter. Effektivt, takket være det faktum at det krever kjøp av B-mode og PW-dopplerbilder bare, denne metoden kan lett brukes til andre arterielle områder, for eksempel halspulsåren, og dermed gi et multi-site arteriell stivhet vurdering. En høyere frekvens sonde bør velges for mer overfladiske blodårer som felles carotis; i alle tilfeller bør valget av sonden sikre korrekt visualisering av arterien for than dyr i studien. Som konklusjon kan det beskrevne system gir en enkel måte å vurdere funksjonelle egenskaper til forskjellige arterier i musemodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VEVO2100 | FUJIFILM VisualSonics Inc, Toronto, Canada | micro-ultrasound equipment | |
| MS250 Ultrasound Probe | FUJIFILM VisualSonics Inc, Toronto, Canada | micro-ultrasound probe | |
| EKV Software | FUJIFILM VisualSonics Inc, Toronto, Canada | Software | |
| Matlab R2015a | MathWorks Inc, Natick, MA, USA | Software | |
| Conductive Paste | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Petroleum Jelly | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Depilatory Cream | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Acoustic Coupling Gel | Chosen by the operator | Laboratory material | |
| Developed Matlab Software | The authors are willing to collaborate with those researchers who are interested in the software and to make the software available under their supervision |
References
- Zaragoza, C., et al.
- Laurent, S., et al. Expert consensus document on arterial stiffness: methodological issues and clinical applications. Eur Heart J. 27, 2588-2605 (2006).
- Wang, Y. X., et al. Increased aortic stiffness assessed by pulse wave velocity in apolipoprotein E-deficient mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 278, 428-434 (2000).
- Mitchell, G. F., Pfeffer, M. A., Finn, P. V., Pfeffer, J. M. Comparison of techniques for measuring pulse-wave velocity in the rat. J Appl Physiol. 82 (1), 203-210 (1997).
- Parczyk, M., Herold, V., Klug, G., Bauer, W. R., Rommel, E., Jakob, P. M. Regional in vivo transit time measurements of aortic pulse wave velocity in mice with high-field CMR at 17.6 Tesla. J Cardiovasc Magn Reson. 12, 72 (2010).
- Hartley, C. J., Taffet, G. E., Michael, L. H., Pham, T. T., Entman, M. L. Noninvasive determination of pulse-wave velocity in mice. Am J Physiol. 273 (1), Pt 2 494-500 (1997).
- Feng, J., Khir, A. W. Determination of wave speed and wave separation in the arteries using diameter and velocity. J Biomech. 43 (3), 455-462 (2010).
- Borlotti, A., Khir, A. W., Rietzschel, E. R., De Buyzere, M. L., Vermeersch, S., Segers, P. Noninvasive determination of local pulse wave velocity and wave intensity: changes with age and gender in the carotid and femoral arteries of healthy human. J Appl Physiol. 113 (5), 727-735 (2012).
- Chérin, E., et al. Ultrahigh frame rate retrospective ultrasound microimaging and blood flow visualization in mice in vivo. Ultrasound Med Biol. 32 (5), 683-691 (2006).
- Gemignani, V., Faita, F., Ghiadoni, L., Poggianti, E., Demi, M. A system for real-time measurement of the brachial artery diameter in B-mode ultrasound images. IEEE Trans Med Imaging. 26 (3), 393-404 (2006).
- Di Lascio, N., Stea, F., Kusmic, C., Sicari, R., Faita, F. Non-invasive assessment of pulse wave velocity in mice by means of ultrasound images. Atherosclerosis. 237 (1), 31-37 (2014).
- Nichols, W. W., O'Rourke, M. F. McDonald's Blood Flow in Arteries: Theoretical, Experimental, and Clinical Principles. , Arnold. London. 215-358 (1998).
- Williams, R., et al. Noninvasive ultrasonic measurement of regional and local pulse wave velocity in mice. Ultrasound Med Biol. 33 (9), 1368-1375 (2007).
- Penny, D. J., et al. Aortic wave intensity of ventricular-vascular interaction during incremental dobutamine infusion in adult sheep. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294, 481-489 (2008).
- Segers, P., et al. Wave reflection leads to over- and underestimation of local wave speed by the PU- and QA-loop methods: theoretical basis and solution to the problem. Physiol Meas. 35 (5), 847-861 (2014).
