Summary
Ansiedad-como comportamiento de ratas probadas por el elevado además de laberinto muy varía según el entorno de prueba. Aquí mostramos cómo ajustes del aparato, especialmente estructura del brazo, afectan el comportamiento en el laberinto, y explicamos un protocolo confiable para detectar efectos de las drogas ansiolíticas. Este informe contribuirá a la investigación de la ansiedad.
Abstract
El elevado además de laberinto es un examen de comportamiento para evaluar ansiedad animal en roedores. Aunque esta prueba se aplica extensamente en el campo de la Ciencias del comportamiento, los resultados contradictorios se proporcionan a menudo de diferentes laboratorios. Para identificar las razones de los diferentes resultados, anteriormente nos centramos en brazo características, que diferencian entre los laboratorios, más en particular la presencia/ausencia de repisas a los lados de los brazos abiertos y la transparencia/opacidad de las paredes del brazo cerrado. En un informe anterior, utiliza un contenedor personalizado diseñado para comparar el comportamiento de ratas en diferentes combinaciones de diseños de brazo abierto y cerrado bajo condiciones experimentales idénticos y demostró que las diferencias en características de brazo interfieran en experimental resultados. En breve, abra brazo bordes perceptiblemente creciente ansiedad-como comportamiento en ratas, mientras brazos transparentes también han disminuido este comportamiento. Además, verificó una mayor sensibilidad de detección del efecto de un fármaco ansiolítico en una combinación de brazo abierto no renegociados + brazo cerrada amurallada opaco en comparación con una combinación de brazo abierto renegociado + brazo cerrado pared transparente. En este informe, presentamos nuestro protocolo para el elevado más prueba del laberinto, junto con discusión de los resultados claves del informe anterior y nuestra experiencia experimental. Creemos que este informe proporcionará información útil para los investigadores que han utilizado o que planean usar el elevado además de laberinto en sus estudios.
Introduction
Está aumentando el número de pacientes que sufren de trastornos del ánimo, incluyendo trastorno de ansiedad y depresión. Aunque el desarrollo de estos trastornos intervienen factores genéticos y ambientales, los mecanismos patogénicos detallados aún no están completamente comprendidos1. Por lo tanto, la investigación debe centrarse en descubrir los mecanismos subyacentes de los trastornos del estado de ánimo, así como el desarrollo de medicamentos eficaces que tienen menos efectos secundarios.
Comportamiento de animales de laboratorio son útiles para investigar la función superior del cerebro, incluyendo la emoción. Comportamiento de los animales es muy variable, los resultados experimentales a menudo difieren entre laboratorios, aunque una cepa consanguínea idéntica fue utilizado2. Así, los investigadores también deben comprender las características básicas de los dispositivos experimentales que adoptan con el fin de proporcionar resultados fiables y precisos en el laboratorio.
El elevado plus prueba de laberinto fue establecido originalmente para examinar la reactividad emocional en roedores3,4. Todo el aparato es generalmente situado 500 mm sobre el piso y consiste en abrir dos y dos brazos cerrados que hacen de una forma más. Medidas de la exploración de brazo (incluyendo la duración y frecuencia de entradas en cada brazo), distancia comportamientos viajadas y especificados como postura de asistir se extendía de animales sometidos se registran durante los periodos de observación. Estas medidas, ansiedad animal se estima como un resultado experimental.
La elevada prueba de laberinto se utiliza en todo el mundo, pero no todos los laboratorios utilizan el mismo aparato diseño5,6, y estas diferencias pueden afectar los resultados experimentales. Por ejemplo, las diferencias son la presencia o ausencia de salientes a lo largo de los brazos abiertos y el uso de paredes transparentes u opacas para brazos cerrado5,6. Los bordes a lo largo de los brazos abiertos y el uso de paredes transparentes para brazos cerrados fueron desarrolladas para evitar caerse el aparato7animales y para facilitar observaciones conductuales dentro de los brazos cerrados, respectivamente8,9. Aunque ha habido algunos estudios que examinan las diferencias de estructura brazo cómo individuales pueden afectar la capacidad para detectar ansiedad animal1,2,5,10,11 , no se han investigado los efectos combinados de abiertas (con/sin repisa corta) y cerrado (transparente/opaco paredes) del brazo características sobre el comportamiento animal.
En un reciente informe, discutimos el efecto de estas combinaciones de diseños de brazo en ansiedad-como comportamiento en ratas12. En breve, abra brazo bordes perceptiblemente creciente ansiedad-como comportamiento en ratas, mientras brazos transparentes también han disminuido este comportamiento. Además, verificamos una mayor sensibilidad de detección del efecto de un fármaco ansiolítico en una combinación de brazo abierto no renegociados + brazo cerrada amurallada opaco en comparación con una combinación de brazo abierto renegociado + brazo cerrado pared transparente. En este informe, será introducir nuestro protocolo para el elevado más laberinto de prueba, junto con la discusión de los resultados claves del informe anterior. Creemos que este informe proporcionará información útil para aquellos que han empleado o que planean usar el elevado además de laberinto en sus estudios.
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Protocol
Todos los procedimientos experimentales descritos aquí han sido aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso de la Universidad de Meiji (IACUC 14-0002(1)). Animales utilizados en los resultados representativos se prepararon como sigue: ratas macho Sprague-Dawley fueron compradas a una empresa de animales de laboratorio y alojadas en grupos de 4 animales por jaula de la rata estándar (W200 × D410 × H250 mm) para al menos una semana antes del inicio de la experimento conductual. La sala de alojamiento de los animales se mantuvo en condiciones ambientales estándar para la luz (12:12 horario de luz/oscuridad con luces en 10:00 h), temperatura (25.0 ± 0.5 º C), humedad (55 ± 10%) y ventilación (10 veces por hora), y los animales tuvieron acceso ad libitum al alimento ( Oriental la levadura Co. Ltd., Tokio, Japón) y agua. Los animales se mantuvieron en una jaula de la rata estándar (W410 x D250 x H200 mm, Toyoriko Co., Ltd., Aichi, Japón) con el papel de ropa de cama (alfa-dri, LSG Corporatin, Tokio, Japón).
1. elevado más la prueba del laberinto
- Configurar el plus elevado laberinto aparato en un envase personalizado (W1, 500 × D1, 500 × H2, 000 mm) (figura 1A) con un marco de metal en forma de plus 500 mm sobre el piso para apoyar el funcionamiento armas de forma (figura 1B), iluminación en el techo del contenedor para iluminar la superficie del laberinto a la intensidad de luz requerida (figura 1) y una cámara de vídeo digital en el techo de centro para monitorado de vídeo en vivo de las pruebas conductuales (figura 1).
- Fijar los brazos (L500 x W100 mm) sobre el marco en forma de plus y luego fijar la plataforma cuadrada central (W100 x D100 mm) en el centro de los cuatro brazos (figura 1 -F).
Nota: En nuestro laboratorio, contamos con dos tipos de brazos abiertos (L500 x W100 mm) y dos tipos de brazos cerrados (L500 x W100 x H450 mm) (figura 1). Los brazos cerrados tienen paredes ya sea transparentes u opacas (figura 1), y los brazos abiertos están diseñados con o sin un borde corto (H5 mm, Figura 1E). La plataforma cuadrada central (W100 × D100 mm) se coloca en el centro de los cuatro brazos (figura 1 -F). Así, se pueden preparar las siguientes cuatro combinaciones de brazos según propósito experimental: abrir los brazos con repisas + brazos cerrados con paredes transparentes (repisas/transparente), brazos abiertos con repisas + brazos cerrados con paredes opacas (bordes/opaco), los brazos abiertos sin salientes + brazos cerrados con paredes transparentes (No-repisas/transparente) y brazos abiertos sin repisas + brazos cerrados con opaco paredes (No-bordes/opaco). La superficie de la pista de brazo es de color negra, para permitir mejor animal trazado por el software de análisis de comportamiento automatizado, tal como se describe en la sección 2, análisis de comportamiento. - Ajustar la intensidad de la iluminación en la superficie de la pieza de extremo distal de cada brazo y plataforma central a aproximadamente 100 Lux.
- Antes de cada prueba, limpiar todo el aparato con solución de etanol 70% y limpiar con agua destilada.
- Haga clic en el botón"registro" en la grabadora de disco duro para iniciar la cámara de vídeo digital que graba el comportamiento de la rata para el vídeo análisis descrito en la sección 2, análisis del comportamiento de la proyección de imagen.
- Poner un animal en la plataforma central frente a un brazo abierto y permite la exploración libre en el aparato durante 5 minutos.
- Haga clic en el botón"stop" en la grabadora de disco duro para terminar la grabación.
- Contar el número de heces y micciones después de regresar el animal probado a la sala de alojamiento de los animales.
- Repita desde el paso 1.4 hasta el final del experimento.
Nota: Un funcionamiento de prueba seco siempre se realiza antes de iniciar cada experimento para comprobar que todos los ajustes experimentales correctamente configurados antes de los animales experimentales se exponen a las condiciones experimentales. De lo contrario, algunos animales, especialmente el primer animal puede experimentar diferentes condiciones ambientales (por ejemplo, ruidos, inducidos posiblemente por el experimentador en señales de manipulación o animal posiblemente dejados por el animal previamente probado).
Nota: Los experimentadores son cerca del contenedor cuando un animal está siendo probado. Así, a pesar de que los experimentadores no son visibles la rata todavía puede ser capaz de sentir a través de olor y sonido.
2. comportamiento análisis
Nota: Análisis del comportamiento se realizan por la observación manual y automatizado de software de análisis.
-
Observación manual
- Después de que el animal se coloca en el borde, observe lo siguiente: número de entradas (una entrada en un brazo se define como cualquier instancia cuando todos 4 patas son en el brazo), tiempo invertido en cada brazo, y número de asistentes se extendía las posturas frente a un brazo abierto , mientras que la copia de seguridad de la plataforma central hacia un brazo cerrado.
- Medir la duración y la frecuencia de los comportamientos definidos anteriormente por cronómetro y cuenta 5 minutos, a partir de Cuándo están cerradas las puertas del contenedor.
-
Análisis automatizado de
- Mediante el programa de software disponibles, anote lo siguiente: distancia recorridas, tiempo gastado en diferentes posiciones de brazos abiertos (segmentos proximal, medios y distales de la plataforma central), y un análisis minuto a minuto del tiempo gastado en abierto y cerrado brazos.
- Haga clic en el botón"Inicio" del software automatizado de análisis al mismo tiempo comienza la observación manual (la grabación se detendrá automáticamente si se establece la duración de la grabación).
Nota: El software de análisis de comportamiento utilizado en este estudio rastrea el animal a través de su contraste con el campo de fondo; el animal, que se asigna un tamaño fijo, se identifica como el objeto más brillante y la locomoción de su punto central se puede utilizar así para el rastreo de animales.
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Representative Results
En el estudio anterior, se compararon los efectos combinados de salientes de brazo abierto y la transparencia de las paredes brazo cerrado en los comportamientos exploratorios en el laberinto12. Las ratas significativamente pasaron menos tiempo en brazos abiertos sin salientes que a brazos abiertos con repisas (F [1, 60] = 13.49, P = 0.0005) (figura 2A). Resultados similares fueron también encontrados por el número de entradas en brazos abiertos (F [1, 60] = 11.17, P < 0,0014)12, lo que sugiere que la presencia de salientes aumenta la conducta exploratoria de ratas en brazos abiertos. Las ratas mostraron significativamente menos postura estirada que asisten a sobre el aparato que había cerrado los brazos con paredes transparentes que en el aparato que había cerrado los brazos con paredes opacas (F [1,60] = 4.03, P = 0.0492) (figura 2B), lo que sugiere que paredes transparentes brazo cerrado disminuyeron ansiedad-como comportamiento en ratas. Las ratas pasaron más tiempo en el segmento distal de los brazos abiertos sobre el aparato que tenía paredes de brazo cerrado transparente que en el aparato con paredes opacas brazo cerrado (F [1,60] = 8.00, P = 0.0983) (figura 2), sugiriendo que transparente las paredes mayo también disminuir la conducta exploratoria de rata brazo abierto. Además, la exploración brazo abierto en el segmento distal fue significativamente menor en el aparato No-bordes/opaco en comparación con el aparato de repisas/transparente (figura 2). Tomados en conjunto, estos resultados indican que la sensibilidad de la detección de ansiedad-como comportamiento podría diferir dependiendo de los tipos de características de diseño del brazo usados y el aparato No-bordes/opaco y repisas/transparente aparato tenga una relativamente grande diferencia en la sensibilidad de detección.
Para comprobar las diferencias en sensibilidad de detección entre los diferentes tipos de diseño del brazo, un experimento adicional fue realizado usando el diazepam de fármaco ansiolítico (figuras 3A–D). En Resumen, el aparato No-bordes/opaco había detectado el efecto del tratamiento con altas dosis de diazepam en el tiempo pasado en los brazos abiertos, mientras que no hizo el aparato de repisas/transparente (Figura 3A–B). Resultados similares fueron también encontrados por el número de entradas en brazos abiertos12 (datos no mostrados). La falta de efectos significativos sobre el aparato de repisas/transparente puede haber sido debido a que la actividad basal (tratamiento de vehículo) en este aparato fue mayor que en el aparato No-bordes/opaco, pero esa exploración brazo abierto nunca superó el 33% de el tiempo en cualquier momento en cualquiera de los dos aparatos. Por lo tanto, este rango más estrecho de tiempo de exploración de brazo abierto hizo más difícil distinguir el efecto ansiolítico de diazepam en el aparato de Ledged/transparente (figura 3–D).
Figura 1 : Equipo diseñado para elevado plus test de laberinto Panel (A): elevado más reactivas de laberinto. El aparato se coloca en el contenedor negro, y un monitor al lado de las imágenes de película vivo envase proyectos registrados durante el experimento. Panel (B): más marco de laberinto en el contenedor que apoya brazos equipados. Todo aparato es situado 500 mm sobre el piso. Panel (C): iluminación regulable de intensidad. Una cámara de vídeo digital (ver flecha) rodeado de movimientos animales registros de iluminación. Panel (D): elevado más brazos del laberinto y la plataforma central que cuentan con marco; de izquierda a derecha, muro opaco cerrado brazo brazo abierto no saliente, renegociado brazo abierto, plataforma central, brazo de pared transparente cerrado. Panel (E): vista de primer plano de brazos abiertos; de brazo de izquierda a derecha, abierto sin salientes, abrir brazo con repisas (H5 mm). Panel (F): un ejemplo de un laberinto construido (aparato de repisas/transparente). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Repisas de brazo abierto reducen la ansiedad-como comportamiento, y paredes transparentes parcialmente disminuyen ansiedad-como comportamiento. Ratas macho experimentaron el elevado más el laberinto de prueba con diferentes combinaciones de estructuras de brazo (repisas/transparente, bordes/opaco, No-repisas/transparente y No-bordes/opaco). Orden prueba fue normalizada a través de los grupos experimentales (cada combinación de tipo de aparato). Este procedimiento normaliza efectos inesperados que podrían haber ocurrido debido a la hora del día de cada prueba. Panel (A): tiempo en brazos abiertos; Panel (B): número de posturas de asistir se extendía; Panel (C): tiempo pasado en el segmento distal de los brazos abiertos. Líneas sólidas y punteadas indican efectos principales significativos de estructuras brazo abiertos y cerrados, respectivamente (ANOVA de dos vías, #P < 0.1 * P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0,001). Letras diferentes al lado de las barras en el Panel (C) indican una diferencia significativa (prueba de comparación múltiple de Bonferroni, una < b, P < 0.0125). Los datos se expresaron como media con SEM (n = 16 por grupo experimental). Estas cifras se han modificado desde nuestro anterior informe12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Aparato de bordes/opaco No muestra una mayor sensibilidad de detección del efecto ansiolítico de diazepam de. Ratas macho experimentaron el elevado además de laberinto de prueba, con el aparato No-bordes/opaco o repisas/transparente, 30 minutos después de ser tratado con vehículo (0 mg/kg), baja (0,25 mg/kg) o dosis alta (0.5 mg/kg) de la diazepam de fármaco ansiolítico (intraperitoneal inyección). Solución de diazepam fue disuelto en solución salina normal 0.9% con un agente activador de superficie. En este experimento, la orden de ensayo de los grupos de tratamiento de tres drogas y dos tipos de diseño de aparatos fueron asignados al azar para tener en cuenta los efectos que pueden ocurrir debido a la hora del día de cada prueba. Paneles (A y B): totales porcentaje tiempo (5 min) de brazos abiertos del aparato repisas/transparente y No-bordes/opaco, respectivamente. Paneles (C y D): minuto a minuto por ciento el tiempo en brazos abiertos del aparato repisas/transparente y No-bordes/opaco, respectivamente. Letras diferentes al lado de bares en el Panel (B) indican una diferencia significativa entre tratamientos (prueba de comparación múltiple de Bonferroni, una < b, P < 0.0167). Las líneas sólidas y punteadas en paneles (C & D) indican efectos principales significativos de los tratamientos de Time-lapse y diazepam, respectivamente (ANOVA, de medidas repetidas *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001). los datos se expresaron como media SEM. números en las columnas indican animales que completó el experimento (los números entre paréntesis indican animales caerse el aparato). Estas cifras se han modificado desde nuestro anterior informe12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Como el número de pacientes que sufren de trastornos psiquiátricos, como trastorno de ansiedad, aumenta, es importante desarrollar estudios de vanguardia para mejorar el entendimiento del mecanismo básico de la ansiedad. Para lograr esto, también es importante optimizar los procedimientos experimentales. Por lo tanto, a mejorar la aplicación de la elevación además de prueba de laberinto, hemos demostrado el efecto del brazo características en los resultados experimentales con ratas.
El elevado además de laberinto fue establecido originalmente para probar animal ansiedad en roedores4, pero aunque las estructuras básicas son generalmente constantes (p. ej., elevado 500 mm sobre el piso con una forma más), a menudo se utilizan varios diseños de brazo. Originalmente, el aparato consistió en brazos abiertos sin salientes y cierra los brazos con paredes de madera opacas. Sin embargo, brazos abiertos más recientemente se han desarrollado con bordes para evitar que animales cae el aparato y brazos cerrados también se han desarrollado con paredes transparentes para facilitar la observación del comportamiento en los brazos cerrados. Sin embargo, ha habido informes que los efectos combinados de estos en los resultados experimentales en la elevación del brazo características más prueba del laberinto. Como demuestran nuestros resultados, la presencia de salientes de brazo abierto y la transparencia de la evitación disminuida de brazo cerrado paredes de exploración brazo abierto en ratas (figura 2), que puede disminuir la sensibilidad de detección del efecto ansiolítico de diazepam ( Figura 3). El aparato de repisas/transparente apareció alentar a una mayor exploración de los brazos abiertos por vehículo tratado ratas (figura 3). Esto reducir discriminación conductual en la exploración de brazo abierto actividad entre vehículo y diazepam trata ratas, así haciéndolo más difícil de detectar diferencias en los niveles de ansiedad. Por lo tanto, la menor sensibilidad del aparato de repisas/transparente puede significar que más animales tendrían que ser probados para demostrar tratamiento significativos efectos en comparación con el uso de aparatos No-bordes/opaco.
En nuestro protocolo, la duración y el número de entradas en cada brazo se midió manualmente por experimentadores bien entrenados. Este procedimiento permite una medición precisa de las entradas de brazo, definido como todos 4 patas a un brazo. Si bien es cierto que los sistemas de seguimiento automatizado de animales están disponibles para algunos parámetros de comportamiento, tales como viajar lejos, en nuestra experiencia siempre exactamente que no pueden distinguir entre las entradas y no las entradas en los brazos, especialmente cuando los animales realizar posturas de asistir se extendía cerca de la frontera entre la plataforma central y un brazo. Por lo tanto, se recomienda utilizar una combinación de ambos sistemas de observación manual y automatizado, basado en sus respectivas fortalezas para cada parámetro de comportamiento.
Hay algunas otras diferencias de protocolo entre laboratorios. Por ejemplo, algunos investigadores colocar animales en la plataforma central frente a un brazo cerrado13,14, mientras que otros lugar las ratas frente a un brazo abierto15,16. Además, algunos investigadores probar comportamiento inmediatamente después de tomar las ratas de su hogar-jaula, mientras que otros permiten las ratas algún tiempo para aclimatarse al comportamiento de la sala de prueba antes de comenzar la prueba. Con respecto al primer caso, en las pruebas preliminares hemos experimentado cómo los resultados difieren dependiendo de que brazo de la rata ante inicialmente; hubo una mayor incidencia de entrar en el brazo que la rata se colocó frente a. También, cuando las ratas se colocaron frente a un brazo cerrado, algunos animales no se movió de ese brazo cerrado después de la primera entrada. En tal caso, es difícil distinguir si las ratas experimentan conflictos entre los brazos abiertos y cerrados o que simplemente prefieren estar en un lugar cerrado sin nunca reconocer la presencia de los brazos abiertos. Aunque en nuestro estudio optamos por colocar las ratas frente a un brazo abierto, para asegurar una alta incidencia de bajo conflicto, le recomendamos que llevar a cabo más estudios para que el efecto de esta diferencia de protocolo en los resultados experimentales están debidamente investigado.
Las medidas de la exploración del segmento distal de los brazos abiertos y minuto a minuto el análisis proporcionan información adicional detallada sobre ansiedad-como comportamiento de rata. Estas medidas ayudaron a mostrar las diferencias en sensibilidad de detección entre los diseños de brazo diferente. A pesar de ello, resultados divulgados de ansiedad investigación usando el elevado además de prueba de laberinto no divulgan a menudo este tipo de medidas detalladas13,17,18. Por lo tanto, recomendamos que los investigadores también informan más información acerca de actividades exploratorias de la rata, incluyendo exploración distal, minuto a minuto el análisis y postura estirada-asistir.
En conclusión, nuestros resultados sugieren que diferentes tipos de aparatos pueden tener sus propias características. De estas pruebas, hemos demostrado que el aparato No-bordes/opaco mejor puede detectar el efecto de fármacos potencialmente tener un efecto ansiolítico. Por el contrario, es concebible que repisas/transparente aparato tenga una ventaja similar al probar posibles fármacos anxiogenic. Hasta la fecha, se han utilizado pruebas de comportamiento para la detección de drogas, sino también para los ensayos de fenotipado en animales mutantes. En efecto, técnicas de edición avanzadas genoma permiten producción rápida de animales mutantes. Por lo tanto, es muy importante para el desarrollo de procedimientos de pruebas con la mejor precisión y sensibilidad para detectar mejor las variaciones en el comportamiento. Este informe demuestra una mejor aplicación de la elevada más prueba para la investigación de ansiedad animal basado en las funciones esperadas de los genes objetivo o drogas. Por lo tanto, creemos que nuestros esfuerzos ayudarán a avanzar la investigación empleando el elevado además de laberinto.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer al Sr. Akihiro Hirano por su ayuda en la producción de aparatos modificados para requisitos particulares. Los autores desean agradecer al Sr. Kosuke Takahashi y Sr. Shingo Nakajima su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por investigación de riesgo de sustancias químicas, salud y becas de investigación de Ciencias de laboratorio, Ministerio de salud, trabajo y bienestar, Japón (H25-KAGAKU-IPPANN-003) y beca de proyecto de investigación A cargo de Instituto de ciencia y tecnología de Meiji Universidad de Japón.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Customized container (W1500 × D1500 × H2000 mm) | NA | NA | Handmade by Mr. Akihiro Hirano |
| Lighting | NA | NA | Handmade by Mr. Akihiro Hirano |
| Elevated plus maze apparatus | NA | NA | Handmade by Mr. Akihiro Hirano |
| Digital video camera | Watec | WAT-250D2 | Any suitable video camera can be attached to a hard disk recorder for recording tracking profiles. |
| Hard disk recorder | TOSHIBA | RD-R200 | Any suitable hard disk recorder can be attached to the digital video camera. |
| Sprague-Dawley rats | Charles River Laboratories Japan, Inc. | NA | Any suitable rats can be used for your study |
| Standard rat cage | Toyoriko | TP-105 | Any suitable rat cage be used for your study |
| Instrument to measure light intensity | AS ONE | 1-5818-02 | Any suitable instrument to measure light intensity |
| EthoVision XT version 8.0 | Noldus | NA | Any suitable software to measure animal behavior |
| Diazepam | Taiyo Pharmaceutical Industry | 1124402A2061 | Any suitable drug can be used for your study |
| Tween 80 | Wako Pure Chemical Industries | 9005-65-6 | Any suitable drug can be used for your study |
References
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