Summary
ラットの不安様行動テスト高架プラス迷路が高いテストの環境によって異なります。ここで、迷路の動作に影響を与える機器設定、特に腕構造を示すし、抗不安薬の効果を検出するための信頼性の高いプロトコルについて述べる。このレポートは、不安の研究に貢献します。
Abstract
高架プラス迷路テストは齧歯動物の動物の不安を評価するための行動テスト。ただし、このテストは行動科学の分野で広く適用される競合する成果は頻繁に異なった実験室から与えられます。異なる結果の理由を識別するために我々 は以前特に有無開いた腕の側面とクローズド アーム壁の透明性/不透明で棚の所、ほとんどの間で異なる腕の機能に焦点を当てた。以前の報告では、我々 はオープンとクローズド アーム デザイン以外同一の実験条件下でのさまざまな組み合わせでのラットの行動を比較するカスタム設計されたコンテナーを使用してと腕機能の違いが実験を妨げることを示した成果。簡単に言えば、オープン アーム棚は、透明な腕は可能性がありますもこの現象を減少している間に、ラットの不安様行動を増大させます。さらに、いいえ ledged オープン アーム + ledged オープン アーム + 透明な壁に囲まれたクローズド アームの組み合わせと比較して不透明な壁に囲まれたクローズド アームの組み合わせで抗不安薬の効果の高い検出感度を検証しました。本報告では、私たち高架のためのプロトコルに加えて、前回のレポートと実験的経験から主要な結果の議論と一緒に、迷路テストを紹介します。このレポートは、人を採用している、または高架式を使用して、さらに勉学の迷路人計画の研究者にとって有用な情報を提供すると考えています。
Introduction
気分障害、不安障害、うつ病などを患っている患者の数は増加しています。これらの無秩序の開発は遺伝と環境の要因がありますが、詳細な発症メカニズムは、まだ完全に理解1。したがって、研究では、副作用が少ない効果的な薬の開発と同様に、気分障害のメカニズムの覆いを取るに焦点を当てる必要があります。
実験動物の行動テスト、脳の高次機能、感情などを調査するため便利です。動物の行動は非常に変数、実験結果しばしば間で異なる所場合でも同一交は使用される2。したがって、研究者はまた彼らを研究室では、信頼性の高い、正確な結果を提供するために採用する実験装置の基本的な機能を理解する必要があります。
高架プラス迷路テストに開業いたしました齧歯動物3,4に感情的な反応を調べる。全体の器具は床の上にある通常の 500 mm し、から成っている 2 つのオープンとプラスの形を作る 2 つの閉じた腕。腕探査 (それぞれの腕にエントリの期間と頻度を含む)、測定距離旅と指定した動作を受ける動物のストレッチ参加姿勢は観測期間中に記録されたよう。これらの措置により動物の不安は、実験結果として推定されます。
高架プラス迷路テストは、世界中で使用されているが、すべてではない所を使用して、同じ装置デザイン5,6とこれらの違いが実験結果に影響を与えます。相違点には、存在や開いた腕に沿って棚の不在および/または閉じた腕5,6透明または不透明な壁の使用が含まれます。腕に沿って棚を開き閉じた腕の透明な壁の使用が動物装置7、落下を防止し、閉じた腕、それぞれ8,9内行動の観察を容易にするために開発されました。動物の不安1,2,5,10,11 を検出する能力に影響を与えるかもしれないどのように個々 の腕の構造の違いを検討するいくつかの研究をされているがあります、動物の行動 (短い出っ張りの有無にかかわらず) オープンとクローズド (透明/不透明な壁) 腕機能の複合的影響がまだ調査されていません。
最近の報告では、これらのラット12の不安様行動の腕デザインの組み合わせの効果を説明しました。簡単に言えば、オープン アーム棚は、透明な腕は可能性がありますもこの現象を減少している間に、ラットの不安様行動を増大させます。さらに、いいえ ledged オープン アーム + ledged オープン アーム + 透明な壁に囲まれたクローズド アームの組み合わせと比較して不透明な壁に囲まれたクローズド アームの組み合わせで抗不安薬の効果の高い検出感度を検証しました。本報告で我々 は、高架式のため私たちのプロトコルをご紹介プラス前のレポートから主要な結果の議論とテストを一緒に迷路が。このレポートは、これらの人を採用しているまたは高架を使用プラス迷路の学習の方に有用な情報を提供すると考えています。
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Protocol
ここで説明したすべての実験手順は、機関動物ケアと明治大学の使用委員会 (IACUC 14-0002(1)) によって承認されています。代表の結果に使用される動物は次のように準備された: 雄 Sprague-dawley ラットいた実験動物会社から購入し、少なくとも 1 週間の開始する前の標準的なラットのおり (W200 × D410 × H250 mm) あたり 4 動物のグループで収容、行動実験。光 (12:12 光/暗いスケジュール 10:00 h で点灯)、室温 (25.0 ± 0.5 ° C)、湿度 (55 ± 10%)、および換気のための標準的な環境で維持された動物飼育室 (10 回/h)、動物食品 (アドリブのアクセスがあったとオリエンタル酵母 (株)、東京都) と水。動物は、寝具 (アルファ-dri、LSG 雙東京都) 紙で標準ラット ケージ (W410 x D250 x H200 mm、Toyoriko 株式会社、愛知、日本) で保管されました。
1. 高架式十字迷路試験
- 高架プラスを設定カスタマイズされたコンテナー (W1, 500 × 500 × H2, 000 mm D1) 装置の迷路 (図 1 a) 十字型のメタル フレームワークの実行をサポートするための床の上の 500 の mm とコンテナー天井の照明方法腕 (図 1 b)必要な光の強さ (図 1)、および行動テスト (図 1) のライブ ビデオ監視を有効にするためにセンター天井のデジタル ビデオ カメラに迷路の表面を照らします。
- (L500 x W100 mm) 腕十字フレームワークの 4 つの腕の中心に広場中央のプラットフォーム (W100 x D100 mm) を固定し、(図 1 -F)。
注: 当研究室である両手を広げて (L500 x W100 mm) の 2 種類とクローズド アームの 2 種類 (x W100 x H450 ミリメートル L500) (図 1)。閉じた腕は、透明または不透明な壁 (図 1) を持って、短い棚 (図 1EH5 mm) の有無、開いた腕、設計されています。広場中央のプラットフォーム (W100 × D100 mm)、4 つの腕の中心部に配置されます (図 1 -F)。したがって、腕の次の 4 つの組み合わせを実験目的に応じて用意できます: オープン棚を武器 + 透明な壁 (棚/透明)、棚が開いて腕 + 不透明な壁 (棚/不透明) とクローズド アームを閉じた腕腕を開く棚 + 透明な壁 (なし-棚/透明) と閉じた腕と棚なし両手 + 不透明とクローズド アームなし (なし-棚/不透明) の壁します。腕滑走路の表面は黒より良い動物行動分析セクション 2 に記載されている、自動動作分析ソフトウェアでトレースを有効にします。 - 約 100 ルクスにそれぞれの腕と中央のプラットフォームの遠位端部の表面の輝度を調整します。
- 各テストの前に 70% エタノール溶液による全体の装置をきれいにし水で拭いてください。
- 映像セクション 2、行動分析で説明する分析のためのラットの行動を記録するデジタル ビデオ カメラを起動するハード ディスク レコーダーの「録画ボタン」をクリックしてします。
- 開かれた腕に直面して中央のプラットフォーム上動物を置き、5 分装置の自由探査を許可します。
- 記録が終了するハード ディスク レコーダーの「停止ボタン」をクリックしてします。
- 動物飼育室へテスト動物を帰国後糞便および排尿の数をカウントします。
- 手順 1.4 から実験が終了するまで繰り返します。
注: 乾燥テストの実行は、常に実施実験のすべての設定が正しく設定されている任意の実験動物は実験条件にさらされる前にチェックする各実験を開始する前に。それ以外の場合、いくつかの動物、特に最初の動物はさまざまな環境条件 (例えば、おそらく以前にテストした動物に残されたであろう操作および/または動物のキューの中に実験者によって誘導されるノイズ) を経験があります。
注: 動物をテストするときは、実験者はコンテナーの近くです。したがって、実験者が表示されないにもかかわらずラットのにおいや音を介してそれらを感じることができるまだあります。
2. 行動分析
注: 行動分析マニュアル観察によって実行され、自動解析ソフトウェア。
-
手動観測
- 棚に動物を配置すると、以下に従って: (腕にエントリは、すべて 4 足腕上にあるときに任意のインスタンスとして定義は) のエントリの数、各アームに費やす時間と伸ばして出席数姿勢開かれた腕に直面しています。、閉じた腕に向かって中央のプラットフォームからバックアップ中。
- ストップウォッチとコンテナーのドアが閉じているときから始まって、5 分間カウントした上定義された動作の期間と頻度を測定します。
-
自動解析
- 利用可能なソフトウェア プログラムを使用して以下を記録: 両手を広げて (中央のプラットフォームから、中間、近位および遠位セグメント) の旅、時間で過ごしたの異なる位置の距離と時間の 1 分ごとの分析はオープンに費やし、閉鎖腕。
- 手動観測の開始と同時に自動解析ソフトウェアの「スタート ボタン」をクリックします (設定期間を記録した場合、記録が自動的に停止されます)。
注: 本研究に使用した行動解析ソフトウェアは、背景フィールドとそのコントラストによって動物を追跡します。固定のサイズが割り当てられている動物は明るいオブジェクトとして識別され、動物追跡のため、その中心点の移動がこうして使えます。
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Representative Results
以前の研究では、腕が開いて棚の併用効果とクローズド アームの壁12迷路探索行動の透明性を比較しました。ラットは大幅棚が開いて腕により棚なし開いて腕にはるかに少ない時間を費やして (F [1, 60] 13.49、 P = = 0.0005) (図 2 a)。開いて腕の中にエントリ数を同様の結果であった (F [1, 60] 11.17、 P = < 0.0014)12棚の存在が開いて腕にラット探索行動を高めることを示唆しています。ラットは大幅不透明な壁に腕を閉じていた装置により透明な壁に腕を閉じていた装置の少ないストレッチ参加姿勢を示した (F [1,60] 4.03、 P = = 0.0492) (図 2 b)、ことを示唆します。クローズド アームを透明な壁は、ラットの不安様行動を減少しました。ラットは不透明なクローズド アーム壁の装置により透明なクローズド アーム壁を持っていた装置の開いた腕の遠位のセグメントにより多くの時間を過ごした (F [1,60] 8.00、 P = = 0.0983) (図 2)、透明な示唆も 5 月の壁ラット腕が開いて探索行動を減少させます。さらに、遠位のセグメント上の腕が開いて探査だった棚/透明装置 (図 2) と比較してない棚/不透明な装置で有意に低かった。一緒に取られて、これらの結果示す不安様行動の検出感度は、arm デザイン機能を使用していいえ棚/不透明な装置の種類に応じて異なる可能性があり。、棚・透明装置は比較的大きい必要があります。検出感度の違い。
腕デザインの異なる種類の検出感度の違いを確認するには、さらに実験を抗不安薬ジアゼパム (図 3 a-D) を用いて行った。簡単に言えば、いいえ棚/不透明な装置は棚・透明装置はしなかったに対し、オープン腕の中で費やされた時間 (図 3 a-B) に対する高用量ジアゼパム治療の効果を検出しました。同様の結果は、開いた腕12 (データは示されていない) にエントリの数にも見つかりました。棚・透明装置に重大な影響の欠乏であるかもしれないというこの装置の基底活性 (車両処理) はその腕が開いて探査の 33% を超えたことがない棚/不透明な装置よりも高いためいずれかの装置の任意の段階で時間。したがって、この狭い腕が開いて探査時間範囲を Ledged/透明装置 (図 3-D) ジアゼパム抗不安薬の効果を区別するためがより難しくなりました。
図 1: カスタム設計用高架プラス迷路テストパネル (A): 高架式十字迷路テスト コンテナー。装置は黒い容器に配置され、コンテナー プロジェクト ライブ映画の画像の横にあるモニターが実験中に記録されました。パネル (B): 装備の腕をサポートするコンテナーに迷路フレームワーク プラス。全体の装置は、床の上に位置する 500 ミリメートルです。パネル (C): 天井照明強度に調整することができます。デジタル ビデオ カメラ (矢印を参照) レコードの動物の動きを照明に囲まれています。(D) パネル: プラス迷路腕と装備が中央のプラットフォーム フレームワークに昇格左から右、不透明な壁は、腕なし棚オープン アーム、ledged 腕が開いて、中央のプラットフォーム、透明な壁が閉じて腕を閉鎖しました。(E) パネル: 開いている武器のクローズ アップ ビュー棚なし、左から右へ、オープンの腕から棚 (H5 mm) と腕を開きます。パネル (F): 構築された迷路 (棚・透明装置) の例。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:オープン アーム棚は不安様行動を減らすし、透明な壁は部分的に不安様行動を減らす。雄ラットを受けた高架式十字迷路アーム構造のさまざまな組み合わせをテスト (棚・透明、棚/不透明、なし-棚・透明、いいえ-棚/不透明)。検査命令と実験的グループ (機器タイプの各組み合わせ) 間で正常化しました。この手順では、各テストの日の時間のために発生した可能性があります予期しない効果を正規化します。パネル (A):時間を過ごしたオープンの腕;パネル (B):数伸ばして参加姿勢;開いて腕の遠位のセグメントでパネル (C):の時間を過ごした。実線と破線はそれぞれ、オープンとクローズド アーム構造の主な影響を示す (双方向分散分析, #P < 0.1 * P < 0.05、* *P < 0.01、* * *P < 0.001)。パネル (C) のバーの横に別の文字を示す有意差 (ボンフェローニの多重比較はテスト、< b、 P < 0.0125)。SEM を使用した平均として表現されたデータ (n = 16 実験グループごと)。これらの数字は、私たちの前のレポート12から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: なし棚/不透明な装置は抗不安薬のジアゼパムの効果の高い検出感度を示しています。雄ラットを受けた高架プラス迷路テスト、いいえ-棚/不透明または棚/透明装置車両 (0 mg/kg)、低 (0.25 mg/kg)、または抗不安薬ジアゼパム (腹腔内 (0.5 mg/kg の高用量で治療された後 30 分インジェクション)。ジアゼパム ソリューションは、表面活性化剤と生理食塩水 0.9% に溶解しました。この実験では 3 薬物治療群と装置設計の 2 つのタイプのテストの順序は、各テストの日の時間のために発生する可能性があります任意の効果のためのアカウントに無作為に割り付けられました。パネル (A & B): 合計パーセント時間 (5 分) をそれぞれ棚・透明となし棚/不透明な装置の開いた腕に費やされています。パネル (C & D): 分ごとの時間の割合がそれぞれ棚・透明となし棚/不透明な装置の開いた腕に費やされています。(B) パネルのバーの横に別の文字を示す治療法間に有意差 (ボンフェローニの多重比較はテスト、< b、 P < 0.0167)。(C & D) パネルで実線と破線の線はそれぞれ時間経過およびジアゼパムの治療の重要な主効果を示す (反復測定 ANOVA、*P < 0.05、* *P < 0.01、* * *P <0.001). データは、SEM. 番号と列の平均を示す動物実験を完了したと表現された (括弧内の数字は、装置から落ちる動物を示している)。これらの数字は、私たちの前のレポート12から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
、不安障害などの精神疾患を患っている患者の数が増えるにつれて、不安の基本的なメカニズムの理解を改善する最先端研究を推進することが重要です。そのためには、実験の手順を最適化するために重要なまたです。したがって、改善アプリケーションの高架十字迷路試験、ラットを用いた実験的成果に及ぼすアーム機能を示しています。
高架プラス迷路に開業いたしました、齧歯動物第4動物の不安をテストするのには、基本的な構造は通常一貫した (例えば、500 mm プラスの形をした床の上を高架) が、様々 なアーム デザインよく使わ。もともと、装置棚なし両手を広げてから成り、木製の不透明な壁と腕を閉じた。しかしより最近開いた腕は棚が落下装置、動物を防ぐために開発されている、閉じた腕は、閉じた腕上の挙動観察を容易にするために透明な壁で開発されています。しかし、これらの高架式の実験成果にアーム機能十字迷路試験の併用効果を対処報告はいません。ように我々 の結果、腕が開いて棚の存在およびラット (図 2) で開かれた腕探査のクローズド アーム壁減少回避の透明度、ジアゼパム (の抗不安作用の検出感度を低下させることがあります。図 3)。棚・透明装置登場車両によって開いた腕の大きい探査を奨励する処置ラット (図 3)。これは腕が開いて探査行動差別を減らす処置ラット、できるようになりより不安レベルの違いを検出することは困難の車両とジアゼパムの活動。したがって、棚・透明装置の感度をより多くの動物、重要な処理を示すためにテストする必要がある意味がない棚/不透明な装置と比較して効果。
プロトコル、時間および各腕にエントリ数手動でよく訓練された実験者によって測定しました。この手順により、腕に配置すべての 4 足として定義されている arm エントリの正確な測定です。自動動物追跡システムが走行距離のエントリと、腕にないエントリを常に正確に区別できません彼ら経験など、いくつかの行動パラメーターの利用可能な事実だが特に動物中央のプラットフォームと腕の間の国境に近い伸縮参加姿勢を実行します。したがって、各行動パラメーターのそれぞれの強みに基づく両方の手動および自動観測システムの組み合わせを使用してをお勧めします。
研究所のいくつかの他のプロトコルの違いがあります。たとえば、一部の研究者は他場所オープン アーム15,16に直面してラットに対しクローズド アーム13,14に直面して中央のプラットフォーム上動物を配置します。さらに、一部の研究者は彼らの家-ケージからラットを撮影直後後の動作をテストして、に対して他のラットのテストを開始する前に試験室の動作に慣れるまで時間。前者の場合、に関して予備テストで経験したどの結果異なるによって直面した最初のラットの腕をラットが直面している置かれた腕に入るの発生率の増加があった。また、ラットは、クローズド アームに直面して配置された、その閉じた腕から最初のエントリの後、いくつかの動物が移動しなかった。このような場合、ラットは、オープンとクローズの腕の間コンフリクトを経験または彼ら単まで開いた腕の存在を認識せず閉鎖場所にすることを好むかどうかを区別することは困難です。本研究で我々 は、紛争下の高い発生率を確保するための開かれた腕を直面しているラットを置くことを選んだが実験的成果に及ぼすこのプロトコルの違いが正しくことを確認するためにさらなる研究を実施することをお勧め調べた。
開いて腕と分で解析の遠位のセグメントの探査の測定は、ラットの不安様行動についての余分な詳細な情報を提供しました。これらの測定は、異なる腕デザインの検出感度の違いを示すを手伝った。これにもかかわらず、不安の研究成果をリサーチする高架プラス迷路試験は多くの場合これらの種類の詳細な測定13,17,18を報告しません。したがって、研究者がラット探索活動、遠位探査、分ごとの分析、また伸ばして参加姿勢などについての情報をまた報告さらに強くお勧めします。
結論として、自分の特性を機器のさまざまな種類がありますが示唆されました。これらのテストからなし棚/不透明な装置がより良い可能性があります抗不安作用を有する薬物の効果を検出できることを確認しました。対照的に、それは考え棚/透明装置が潜在的な不安惹起薬剤をテストするときに同様利点がある可能性があります。日には、創薬スクリーニングのみならず変異動物の表現型解析アッセイ行動テストが使用されています。確かに、高度なゲノム編集技術は、変異動物の迅速な生産を許可します。したがってより良い精度と動作の変化にうまく検出感度テスト プロシージャを開発する非常に重要です。このレポートは、高架式の改良されたアプリケーションと薬物またはターゲット遺伝子に期待される機能に基づいて動物の不安研究のテストを示します。したがって、我々 の努力は高架式を用いた研究を進めるプラス迷路に役立つと考えます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
カスタマイズされた装置の生産に彼の援助の平野晃宏氏を感謝致します。著者は、その技術支援の高橋宏祐氏と中島信吾氏に感謝したいと思います。この作品は、化学物質のリスク、健康と研究所科学研究費補助金、厚生省、労働、福祉、日本 (H25-科学-IPPANN-003) と技術明治理工学研究所研究プロジェクト助成 A 研究によって支えられました。大学、日本。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Customized container (W1500 × D1500 × H2000 mm) | NA | NA | Handmade by Mr. Akihiro Hirano |
Lighting | NA | NA | Handmade by Mr. Akihiro Hirano |
Elevated plus maze apparatus | NA | NA | Handmade by Mr. Akihiro Hirano |
Digital video camera | Watec | WAT-250D2 | Any suitable video camera can be attached to a hard disk recorder for recording tracking profiles. |
Hard disk recorder | TOSHIBA | RD-R200 | Any suitable hard disk recorder can be attached to the digital video camera. |
Sprague-Dawley rats | Charles River Laboratories Japan, Inc. | NA | Any suitable rats can be used for your study |
Standard rat cage | Toyoriko | TP-105 | Any suitable rat cage be used for your study |
Instrument to measure light intensity | AS ONE | 1-5818-02 | Any suitable instrument to measure light intensity |
EthoVision XT version 8.0 | Noldus | NA | Any suitable software to measure animal behavior |
Diazepam | Taiyo Pharmaceutical Industry | 1124402A2061 | Any suitable drug can be used for your study |
Tween 80 | Wako Pure Chemical Industries | 9005-65-6 | Any suitable drug can be used for your study |
References
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