Optogenetic de arrastre de las oscilaciones Theta Hippocampal en comportarse ratones

La actividad neuronal en los mamíferos es coordinada por las oscilaciones de la red, que ayudan a la transferencia de información dentro y entre el cerebro regiones^1,2,3,4. Ritmos cerebrales son oscilaciones que van desde muy lento (< 0,8 Hz) hasta ultra rápida (> 200 Hz) frecuencias. Un cuerpo grande de evidencia apoya participación de oscilaciones de la red en las funciones cerebrales diversas, incluyendo la cognición^5,6,7,8,9,10 , comportamientos naturales^11,12 , así como trastornos neuropsiquiátricos como la enfermedad de Parkinson y epilepsia^13,14,15. Selectivos y temporal precisos métodos para la manipulación experimental de las oscilaciones de la red por lo tanto son esenciales para el desarrollo de modelos fisiológicamente plausibles de la sincronización y para establecer relaciones causales con el comportamiento.

Sincronización de red está mediada por procesos, que van desde la identidad molecular de los canales iónicos y su cinética de neuromodulación de la excitabilidad y conectividad de red y diversos substratos biológicos. El diseño biológico de ritmo generadores¹⁶ ha sido revelado por muchos aspectos distintos (p. ej., frecuencia, amplitud), ritmos cerebrales son a menudo provocada por la dinámica de redes y tipos de células distintas. Por ejemplo, interneuronas inhibitorias dirigidas a los Somas de las células principales son los jugadores más importantes a través de las bandas de frecuencia y cerebro regiones^17,18, incluyendo theta^19,20, gamma^{20 , 21}y²² oscilaciones de ondulación (140-200 Hz). A su vez, sincronización de la fase de células distantes es asegurada por robusto feed-forward de señalización de las células piramidales, que restablece la leña de interneuronas. Un parámetro fundamental de oscilaciones, el tamaño de la población neuronal sincronizada, está estrechamente relacionada con la amplitud de la oscilación medida de LFP y, al menos para las oscilaciones rápidas, depende de la unidad excitadora sobre interneuronas². Por el contrario, las oscilaciones más lentas, como ritmos de la theta y delta son generadas por largo alcance bucles reentrantes, formados por cortico-talámico^23,24 y proyecciones septal medial hipocampo^{25, 26,27}, respectivamente. Oscilaciones en dichos circuitos son generadas por interacciones de retardos de propagación de señal, excitables respuestas y sus preferencias de frecuencia en células participantes de^{28,29,30, 31 , 32}. proyecciones inhibitorias de GABAérgico parvalbúmina (PV)-células del septo medial (MS) a interneuronas en el hipocampo^25,33, regiones de parahippocampal y entorhinal cortex²⁶ son positivas esencial para la generación de oscilaciones de la theta en el lóbulo temporal medial. Así, los mecanismos fisiológicos de las oscilaciones de la red y sincronización neuronal pueden ser manipulados usando optogenetics con una precisión en tiempo real.

Manipulaciones de células optogenetic tipo-específicas se han aplicado para estudios de oscilaciones corticales y hippocampal en vitro^{34,35,36,37,38} y en vivo^{30,39,40,41,42,43,44,45}, incluyendo funcional las investigaciones de gamma^{5,12,36,46,47,48,49,50, 51,52} y ondulación oscilaciones^40,53,54 y sueño husos^55,56. Recientemente, expresamos un virus dependiente de la Cre ChR2 en la MS, una región clave para la generación del ritmo hippocampal de la theta, de ratones PV-Cre. Con esta preparación, características de las oscilaciones theta hippocampal (frecuencia y estabilidad temporal) fueron controlados por el estímulo optogenetic de proyecciones inhibitorias de la MS en el hipocampo¹¹. Además, estimulación de frecuencia theta optogenetic de proyecciones FCSP-hippocampal inhibitorias evoca ritmo theta durante inmovilidad despierto. La optogenetically arrastrado ritmo theta muestran propiedades de oscilaciones theta espontánea en el ratón en la LFP y los niveles de actividad neuronal.

Características principales de este protocolo son: (1) utilización de una vía inhibitoria que es fisiológicamente importante para oscilaciones theta espontánea evitando efectos inespecíficos en la excitabilidad del hipocampo; (2) axonal, es decir, estímulo específico de proyección para minimizar una influencia directa sobre no hippocampal MS eferentes; (3) local theta rítmica estimulación de luz, asegurando una mínima interferencia directa con theta rítmica dinámica FCSP-hipocampo y un arrastre global bilateral de las oscilaciones theta; (4) paramétrico control de frecuencia de las oscilaciones theta y regularidad; y (5) cuantificación de fidelidad de arrastre con alta resolución temporal con la LFP para permitir análisis de causalidad cuantitativa en comportamiento de animales. Ya que esta preparación esencialmente capitaliza un papel bien conocido de la FCSP-hippocampal desinhibición en theta generación^25,30, permite control robusto sobre varios parámetros de las oscilaciones de la theta en comportarse ratones. Estudios donde menos investigados caminos y tipos de la célula de la circuitería de FCSP-hipocampo fueron manipulan^{38,39,47,49,50,51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58} además revelar mecanismos del ritmo theta.

PV-Cre knock-en ratones machos⁵⁹, 10-25 semanas de edad, fueron utilizados. Ratones fueron alojados bajo condiciones estándar en las instalaciones de animales y mantenidos en un ciclo de 12 h luz/oscuridad. Todos los procedimientos fueron realizados con arreglo a directrices nacionales e internacionales y fueron aprobados por las autoridades sanitarias locales (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen).

1. viral inyección

1. Durante todo el procedimiento, siga las directrices de seguridad biológica⁶⁰. Usar una bata de laboratorio, una mascarilla quirúrgica, una redecilla y dos pares de guantes.
2. Corte el tubo con tijeras o bisturí estéril de aproximadamente 1 m de longitud, introducir en el bloque de soporte de la jeringa de la bomba y arreglarlo.
   1. Llenar el tubo con aceite de silicona mediante el uso de la jeringa.
   2. Compruebe si aparecen burbujas de aire en la tubería. Si se observan burbujas de aire, llenar el tubo otra vez con aceite.
   3. Fijar el émbolo para el bloque de empuje.
   4. Haga avanzar lentamente el empujador hacia el bloque de soporte de la jeringa hasta que la punta del émbolo toca la tubería.
   5. Inserte la punta del émbolo en el tubo y mover automáticamente el bloque de empuje hacia adelante a una velocidad lenta seleccionando "Infundir" en la ventana de comandos y una tasa de infusión bajas (p. ej., 500 nL/min) hasta que alcanza el bloque de soporte de jeringa.
3. Preparar la aguja de inyección (34G).
   1. Retire el eje de la aguja con un claro corte mediante un taladro/grinder precisión conectado a un disco de corte. Si es necesario, utilice una aguja para eliminar residuos de metal de la superficie recién cortada.
   2. Tubo capilar (3-4 cm de longitud) del hilo de rosca a través de la aguja.
   3. Pegue el tubo de la aguja con pegamento.
   4. Conecte la aguja de inyección hasta el final del tubo, que conecta a la bomba de la microjeringa.
4. Conecte la aguja en el soporte estereotáxicas.
5. Retire el aire hasta que una burbuja de aire en el tubo transparente por encima de la aguja es visible.
6. Anestesiar el ratón con 1.5-3% de isoflurano en oxígeno. Esperar aproximadamente 2-3 min, luego confirmar que el ratón es totalmente anestesiado por evaluar su respuesta a un pellizco del dedo del pie. A lo largo de la cirugía supervisar la respiración del animal y ajustar la concentración de isoflurano si es necesario.
7. Coloque el ratón en el marco estereotáctico usando titulares no traumática de la oreja.
8. Proteger los ojos del ratón con un gel de lípidos.
9. Inyectar la lidocaína 0,1 mL por vía intradérmica en la piel principal usando un 0.01-1 mL jeringa y una cánula de inyección 26G.
10. Afeitarse y desinfectar con solución de etanol la cabeza del ratón. Luego alternar la clorhexidina 2% tres veces con etanol para la desinfección del sitio quirúrgico.
11. Realizar una incisión de línea media con unas tijeras finas y afiladas va entre la parte posterior de las orejas hasta el nivel de los ojos para que el bregma y lambda son visibles.
12. Limpiar el cráneo aplicando aproximadamente 50 μl de NaCl mediante una jeringa y secar con un pañuelo de papel y un soplo de aire.
13. Posición de la cabeza de ratón ajustando el nivel dorso-ventral de la pinza de la nariz para que el bregma y lambda son en el mismo nivel dorso-ventral (± 0,3 mm).
14. Perfore un agujero encima de la MS (AP 0.98 y L 0,5 mm en el vértice).
15. En este punto, descongele una alícuota del virus (debe contener por lo menos 2 μl de AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato.WPRESV40) durante aproximadamente 5 minutos a temperatura ambiente (RT).
16. Centrifugue la alícuota a aproximadamente 4.000 x g a temperatura ambiente durante 1 minuto.
17. Pipeta 2 μl del virus sobre un trozo de Parafilm; Utilice el lado previamente protegido.
18. Sumerja la punta de la aguja de inyección en el líquido y retirar con cuidado a cerca de 500 nL/min mientras observa el nivel del líquido. Para evitar la aspiración de aire, deje de retirada antes de que el virus es totalmente tomado. Ajustar la tasa de retiros según la viscosidad de la solución; un ritmo más rápido puede facilitar la retirada de un virus con una viscosidad más alta.
19. Limpie la aguja con un pañuelo de papel.
20. Comprobar que el virus está contenido en el tubo y el virus y el aceite están separados por una burbuja de aire. Marque el nivel del virus en el tubo para controlar si el virus está impregnado con éxito durante la inyección.
21. Coloque la aguja sobre la craneotomía e introduzca lentamente en el cerebro en el primer punto de la inyección (AP 0.98, L 0.5, V-5.2, lateral de 5,5 °).
22. Inyecte 450 nL del virus a razón de 100-150 nL/min esperar 10 minutos cuidadosamente mueva la aguja hasta 0.1 mm y espere otros 5 minutos.
    1. Mover la aguja hasta el segundo punto de la inyección (AP 0.98, L 0.5, V-4.6) e inyectar otro 450 nL en 100-150 nL/min.
    2. Espere 10 minutos antes de mover la aguja hasta 0,1 mm. Espere otros 5 minutos antes de retirar la aguja otra vez
23. Sutura la incisión con sutura seda negra trenzada con nudos cuadrados. Caliente al animal con una luz roja para acelerar la recuperación. Administrar antibióticos (0,3 mL Erycinum (1:4 en NaCl estéril)) y carprofeno i.p. diario 2-3 días después de la cirugía.
24. Corte el tubo por encima de la marca que indica el nivel del virus. El tubo puede utilizarse para más inyecciones. Preparar una aguja de inyección fresca antes de cada inyección.
    Nota: Esta cirugía toma aproximadamente 1-1.5 horas. El animal se despierta normalmente dentro de 5 minutos después de la cirugía. Espere un mínimo de 6 semanas para la expresión axonal suficiente pero no más de 5 meses antes de realizar implantes stereotactic, como niveles de expresión comienzan a disminuir aproximadamente 6 meses después de la inyección del virus.

2. preparación de fibras ópticas (figura 1A)

1. Uso de fibra óptica multimodo (105 μm núcleo, vidrio con base de silicona, NA 0.22). Revestimiento de la base de la fibra utilizando una micro-stripper mientras que la fibra es colocada en el carrete de fibra en tira 125 μm.
2. Cortar la fibra a una longitud de aproximadamente 2-3 cm con un cuchillo de diamante.
3. Inserte la fibra en una virola de palillo de cerámica de zirconia (ID: 126 μm). Aproximadamente 0.5-1 mm de la fibra óptica debe sobresalir de la parte convexa de la virola.
4. Utilizando una aguja, aplique una gota de pegamento epóxico en ambos extremos de la férula pero no a los lados de la abrazadera. Como alternativa, utilizar pegamento.
5. Deje que el pegamento se seque durante al menos 30 minutos.
6. Polaco el lado convexo de la virola mediante diamante lapping fibra pulido (3 μm Arenas) la película.
7. Prueba de la fidelidad de la transferencia de luz usando un medidor de potencia óptica.
   1. Establecer la longitud de onda en el medidor de potencia para la misma longitud de onda como el láser se utiliza.
   2. Posición de la cuerda de remiendo con la punta hacia el centro del sensor. Encienda el láser y leer la salida de luz desde el medidor de energía. Registre el valor.
   3. Conectarse el cordón a través de un manguito de acoplamiento de la fibra óptica y posición con la punta de la fibra hacia el centro del sensor. Encienda el láser y leer la salida de luz desde el medidor de energía. Registre el valor.
   4. Calcular la tasa de transmisión: dividir el segundo valor por el primer valor. Si la tasa de transmisión es inferior a 0.5, deseche la fibra, de lo contrario usarlo para la implantación.
   5. Prueba la velocidad de transmisión para cada fibra antes de la implantación.
   6. Para los experimentos posteriores, ajuste la salida de intensidad de la luz del láser a la velocidad de transmisión de la fibra óptica: fijar la salida de luz de la punta de la cuerda de remiendo a 5-15, dividido por la tasa de transmisión para lograr una potencia final de la punta de la fibra de 5 a 15 mW.
      Nota: Ver también Ref. ⁶¹ para la preparación de fibras ópticas.

3. preparación del alambre de tungsteno de matrices para la LFP grabaciones (figura 1B)

1. Pegue varios (por ejemplo 6) 100 μm guías de tubo de silicona en paralelo con el lado pegajoso de una pieza de cinta. Corte una pieza, aproximadamente 4-6 mm, para montaje de un cable serie.
2. Hilo formvar 45 μm tungsteno alambres a través de los tubos de guía usando fórceps.
3. Tira seis aislado fina Unión cobre alambres (aproximadamente 5 mm de largo) y un cable de tierra (aproximadamente 2-3 cm de largo) usando un bisturí raspe el aislamiento en ambos extremos. Soldarlos a las patillas de nanoconnector.
4. Conecte cada cable pegado al alambre de uno tungsteno usando una gota de barniz conductor de plata, respectivamente. Dejar secar durante al menos 30 minutos.
5. Aplique una cantidad mínima de cemento para cubrir los cables. No aplicar cemento en los alambres de tungsteno, que se inserta en el tejido cerebral o en la parte superior de la nanoconnector. Deje que el cemento seco durante al menos 30 minutos.
6. Realizar un corte angular (5-20°) de los cables de tungsteno utilizando tijeras de acero inoxidable embotados para permitir la implantación fiable de cables por debajo o por encima de la zona ventral adyacente al pyramidale del estrato, donde la amplitud de la theta es demasiado baja para la estimación de la fidelidad de arrastre.
7. Deinsulate la punta (aproximadamente 2 mm) del cable de conexión utilizando un bisturí raspe el aislamiento. Tratar con flujo y presolder.
8. Comprobar posibles Cruz-conversaciones entre electrodos utilizando un digital multímetro. Para ello, conectar las patillas del conector con el multímetro, que se debe establecer en el modo de medición de resistencia. Comprobar combinaciones de pares de canales; una lectura en el multimetro debajo de MΩ 5 indica conversaciones significativas.
9. Verifique la impedancia de cada electrodo de alambre en solución salina con un medidor de impedancia. Valores de impedancia típica están por debajo de 100 kΩ.
10. Para facilitar la implantación, pegue una fibra óptica a la matriz de alambre para que la punta de la fibra está a la altura del cable más corto y la punta de la fibra está en proximidad cercana, pero no tocar los cables de tungsteno. Mantener el ángulo de la fibra más pequeña posible para evitar daño de tejido durante la implantación.
    Nota: Ver también Ref. ⁶² para la fabricación de matrices de alambre de tungsteno.

4. estereotáxicas implantes

1. Realizar preparaciones como se describe en pasos 1.6-1.13.
2. Retire el tejido conectivo de la parte superior del cráneo y empuje hacia abajo de los músculos del cuello bien por aproximadamente de 2 mm para evitar artefactos musculares durante la grabación.
3. Limpiar el cráneo usando un aplicador de punta de algodón y una solución salina y taladre 4 agujeros (2 en la parte frontal) y 2 por encima del cerebelo, diámetro de 0,8 mm para tornillos de acero inoxidable de hueso (00-96 x 1/16) para el suelo y la estabilización del implante (figura 1). Coloque el tornillo a tierra, conectado a un alambre de cobre (aproximadamente 2-3 cm de longitud) sobre el cerebelo.
4. Cubre el tornillo de tierra completamente con cemento para evitar artefactos de músculo durante las grabaciones electrofisiológicas. Construir un anillo de cemento conectando todos los tornillos (Figura 1E).
5. Realizar una craneotomía sobre la parte de implantación (hipocampo, AP-1.94, 1.4 L, V 1.4 en referencia el bregma). Aplicar aproximadamente 5 μl de NaCl estéril sobre la superficie del tejido de cerebro.
6. Baje lentamente la matriz de alambre mediante stereotaxis en la craneotomía. Para las grabaciones unitarias, implante una sonda de silicona en lugar de una matriz de alambre⁶³; con el fin de evitar artefactos luz optoeléctricos, implantar la fibra óptica por separado en el hipocampo con la punta de la fibra no directamente frente a la sonda (figura 1 -I). Para la investigación de la coordinación del arrastre entre hemisferios, implante un adicional de fibra óptica en la zona de CA1 de hipocampo contralateral.
7. Aplicar aproximadamente 5 μl de aceite de cera/parafina líquida caliente, precalentado a 70 ° C, con una jeringa sobre el sitio de implantación para proteger los tejidos del cerebro.
8. Aplicar el cemento alrededor de la matriz de alambre y cubrir el cráneo con cemento.
9. Aplique una gota de flujo el cable de tierra de referencia presoldered y el presoldered alambre conectado a tierra al tornillo por ejemplo utilizando una aguja y fundir los cables utilizando una máquina de soldadura.
10. Cubrir el alambre de tierra todo con cemento.
11. Administrar 0.3 mL Erycinum (NaCl estéril de 1:4) y i.p. carprofen (5mg/mL) después de la cirugía y para al menos los dos días siguientes. El ratón normalmente se despierta dentro de 15 min después de la cirugía. Caliente al animal con una lámpara roja para acelerar la recuperación.
12. Vigilar diariamente el peso del ratón durante la primera semana después de la cirugía o hasta que el peso es estable. Pérdida de peso no debe exceder el 10% del peso del ratón antes de la cirugía. Para acelerar la estabilización del peso, la fuente del ratón con comida húmeda y leche condensada durante los primeros días después de la cirugía.
13. Para grabar la actividad celular hipocampal durante el arrastre, implante una sonda de silicona en el hipocampo (AP-1.94, 1.4 L, V 1, con posterior descenso) como se describe en Ref. ⁶² (figura 1 -I). Implantar la fibra óptica en el hipocampo en AP -3, 1.4 L, 1.6 V, 39 ° caudal y rostral. Implante de una fibra óptica adicional en las MS (AP +0.98, L 1, 3.9 V, lateral de 15 °) si se desea la estimulación de Somas celulares.

5. Optogenetic estimulación y adquisición de datos electrofisiológicos

1. Habituar el ratón a la configuración de grabación (por ejemplo, sesiones de 15 min, 1-2 sesiones al día durante 3 días). Examinar el comportamiento del animal antes de comenzar con los primeros experimentos. Si el ratón se mueve en la cámara, explorar el entorno, oliendo, realización de crias, etc., iniciar la primera sesión experimental.
2. Coloque el ratón en una cámara familiar en ausencia de otros animales en la misma habitación.
3. Conecte un LED a la cabeza-etapa utilizando cinta adhesiva para seguir la posición del animal. Asegúrese de que la luz es capturada por la cámara durante todo el período que el animal está explorando la cámara de grabación antes de comenzar los experimentos. Grabar en la oscuridad para seguir la luz. Coloque una cámara encima de la cámara de grabación.
4. Compruebe la salida de luz de la cuerda de remiendo. Estimar la intensidad de luz desde la punta de la fibra después de la conexión según tarifa de la transmisión de la fibra implantada. Asegúrese de que la salida de luz de la punta de la fibra es entre 5-15 mW, para habilitar el arrastre confiable.
5. Conectar el preamplificador headstage al conector crónicamente implantado. Conecte la cuerda de remiendo de fibra óptica a la fibra hippocampal crónicamente implantada para los experimentos de estimulación optogenetic. En experimentos de control de estímulo luz, conectar la fibra óptica a un maniquí virola conectado al auricular.
6. Coloque el ratón en la cámara de grabación.
7. Abra el software para controlar el generador de estímulos para generar el protocolo de estimulación.
8. Seleccione el canal que controla el láser DPSS 473. En la primera fila entre 3.000 mV (1ª columna), tiempo ms 30 (2ª columna), valor de 0 mV (columna 3), tiempo 112 ms (4ª columna), la fila repita 840 y grupo 1 repetición, para generar un protocolo de 2 min de estimulación de 7 Hz con pulsos largos de ms de 30. Ajustar la duración del tiempo en la 4 º columna y número de repeticiones de la fila si es necesario el estímulo en otra frecuencia o una duración diferente. En la segunda fila seleccionar 0 mW (1ª columna), tiempo 500 h (2ª columna), fila de repetición 1 y el grupo 1, para asegurarse de que el láser es apagado después de terminado el protocolo de estimulación.
9. Haga clic en "archivo > Guardar como" y guarde el archivo con un nombre deseado.
10. Asegurar que el estimulador TTL salida disparo del láser está conectado a la tarjeta de entrada analógica Digital lince para sincronizar la adquisición de electrofisiológicos y datos optogenetic.
11. Por otra parte, para regular la forma paramétrica la variabilidad de la frecuencia de oscilación de la theta, aplicar trenes de pulsos de luz en diferentes intervalos entre pulsos, con períodos siguiendo una distribución gaussiana. Modificar la dispersión del pulsos entre intervalos para diferentes protocolos, por ejemplo, en el paso 3.2 a 15.1 ms². Aplicar estos protocolos para generar épocas theta con la diferente variabilidad de la frecuencia de la theta (figura 6).
12. Abra el software del sistema de grabación. Haga clic en "ACQ" adquirir y "REC" para grabar. Esperar antes de la iniciación del estímulo luz para registrar el comportamiento de la línea de base (por ejemplo, 2 minutos para recuperar la velocidad de línea de base o 30 min para extraer los campos de lugar de referencia).
13. Abra el software para controlar el generador de estímulos. Haga clic en "Archivo > abrir" y seleccione el archivo de protocolo de elección. Haga clic en "Descargar y empezar" para iniciar la estimulación de luz.
    Nota: El experimento puede ser examinado, y la estimulación comenzó a través de control remoto; Esto excluye la influencia de la presencia del experimentador sobre el comportamiento del animal. Dependiendo el objetivo del estudio, estimulación puede ser iniciada y terminada en comportamientos específicos.

6. un enfoque combinado para el arrastre de Optogenetic y la inhibición específica de la proyección de la salida del hipocampo

1. Expresar ChR2 en células GABAérgicas MS de ratones PV-Cre, como se describe en la sección 1.
2. Además, inyectar un total de 2.4 μL de CamKIIα halorodopsina dependiente (eNpHR3.0, AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH) en ambos hemisferios hipocampales dorsales (AP-1.7; L ± 1.05; V-2.05 y - 1.4 mm; AP-1.7; L ± 1.7; V-2.05 y - 1,55 m; AP -2,3; L ± 1.5; V-2.2 y - 1.3 mm; AP -2,3; L ± 2.2; V-1.65 y - 2.45 mm).
3. Permite 6 semanas de tiempo de expresión.
4. Implante de una matriz de alambre de tungsteno con fibra óptica en la región CA1 hipocampal, como se describe en la sección 4. Además, implantar fibras ópticas bilateralmente en el tabique lateral (LS, AP 0.1, L 0.25 V-2,250 mm y AP 0.5, L -0,3, V-2,70 mm).
5. Realizar experimentos de arrastre optogenetic theta como se describe en los pasos 5.4-5.5.
   1. Para la inhibición simultánea de la salida del hipocampo a la LS, generar una generación de estímulo de protocolo: p. ej., disparador del inicio del canal de salida conectado al 593 nm DPSS láser 15 s con un pulso continuo que dura en total 45 s, antes de accionar la salida de pulsos para el láser DPSS 473.
   2. Conectar ambas fibras en el LS por latiguillos utilizando un acoplador óptico de fibra multimodo a un láser DPSS 593.
   3. Iniciar la grabación y descargar y activar el protocolo para el control de la generación del estímulo.

7. procesamiento de datos

1. Convertir las señales electrofisiológicas y coloque los datos de seguimiento con el Gerente de datos neurofisiológicos (ND) a formato .dat y .pos, respectivamente⁶⁴.
2. Obtener la LFP por filtrado de paso bajo y de abajo-muestreo de la señal de banda ancha a 1.250 Hz usando Gerente ND⁶⁶.
3. En cada grabación, seleccionar el canal con la máxima amplitud de theta oscilaciones (usando Neuroscope)¹⁹.
4. Detectar las marcas de tiempo de los pulsos del láser y de las épocas de la estimulación con un umbral de detección del algoritmo (utilizando MATLAB función findpeaks.m o similar)¹¹.
5. Para importar el archivo .dat en un software de análisis de datos multicanal, haga clic en "Archivo > Importar", selecciona "binarios" como el tipo de datos y seleccione el archivo de .dat. En el cuadro de diálogo de configuración, escriba el número correcto de canales y una velocidad de muestreo de 1.250 Hz, haga clic en "Aceptar" y guardar como archivo de .smr. Trama de espectros de potencia seleccionando "Análisis > nuevo resultado Ver > PowerSpectrum". En la configuración, seleccionar el canal con la mayor amplitud de theta y 16.384 tamaño FFT, haga clic en "Nuevo", definir como "Hora de inicio" el principio de la época de estimulación y como "Tiempo final" el final de la época de estimulación y haga clic en "Proceso".
6. Calcular la fidelidad de arrastre como el cociente de la densidad espectral de potencia acumulativa (PSD) dentro de la gama de frecuencia de estimulación de optogenetic (estimulación frecuencia ± 0,5 Hz), para el PSD acumulado en la banda theta (5-12 Hz) con el método multitaper (NW = 3, tamaño de la ventana 8.192) para 10 épocas de s (p. ej., kit de herramientas < http://chronux.org/>).
7. Excluir la grabación épocas donde el pico dominante de PSD es ≤ 5 Hz de análisis (no-theta épocas, utilizando MATLAB función find.m).
8. Trama de la trama de los espectros de energía de la LFP para todas las épocas registradas según la fidelidad de arrastre computada (usando pcolor.m y sortrows.m de funciones MATLAB). Cargar los espectros de potencia y arrastre fidelidad haciendo clic en "File > Open", almacenan pulg tipo potencia variable = sortrows(In,1); Pcolor(Power(:,2:end)).

Orientación de ChR2 células GABAérgicas en el MS como se describe en la sección 1 se ilustra en la figura 2A. Optogenetic estimulación de los axones de células GABAérgicas MS en el hipocampo dorsal a través de una fibra óptica que se implanta encima de la zona CA1 arrastra las oscilaciones de la theta en la frecuencia del estímulo en el ipsilateral (figura 2B) y contralateral Hemisferio (figura 2). Oscilaciones de la theta pueden ser más o menos eficientemente arrastradas por la estimulación de la optogenetic (Figura 3A), la eficacia de la que se calculó para cada época de la grabación como una theta relativa potencia LFP alrededor de la frecuencia de estimulación, es decir, fidelidad de arrastre (figura 3B). Fidelidad de arrastre por encima de 0.3, es decir, mayor que en las grabaciones apagado espontáneas, se observó en aproximadamente el 80% de las épocas de grabación. Optostimulation en las frecuencias theta no era menos eficaz (figura 3).

Explícita , es decir, paramétrica manipular oscilaciones theta frecuencia se acompaña de cambios emergentes de regularidad de la theta: la regularidad temporal de la amplitud y la frecuencia de las oscilaciones de la theta fue aumentadas durante épocas de alta fidelidad de arrastre. La estabilidad de las oscilaciones se puede regular de forma paramétrica mediante la aplicación de los trenes de pulsos ligeros, períodos de los cuales siguen distribuciones Gaussianas con diferentes dispersiones (figura 4).

Optogenetic control de la frecuencia de las oscilaciones elimina la correlación entre la frecuencia de la theta y velocidad, de acuerdo con el control de frecuencia mediante el MS por ascendentes aferentes durante el movimiento (figura 5A). Optostimulation también induce oscilaciones theta durante la inmovilidad (figura 5B). Las fases de cocción preferencial en el área CA1 en supuestas células piramidales y interneurons se modificaron en relación con la oscilación de theta optogenetically arrastrado comparado con theta espontáneo (figura 6).

Para estudiar la contribución del hipocampo a la vía lateral del tabique en la regulación theta-mediada de la locomoción, nos optogenetically inhiben esta vía. Halorodopsina (eNpHR3.0) bilateral fue expresada en las células piramidales hipocampales (Figura 7A), mientras que ChR2 fue expresado en las células GABAérgicas MS como por encima y las oscilaciones de la theta se optogenetically arrastrado (figura 7B). El arrastre de theta reducida variabilidad de funcionamiento velocidad pero no cuando el hipocampo a la vía del LS fue inhibido (figura 7).

Figura 1: ilustración de fibras ópticas, electrodos y cirugía. Ilustración (A) de una fibra óptica. (B) ejemplo de una matriz de alambre pegada a una fibra óptica para la grabación de LFP hipocampo durante el arrastre de las oscilaciones theta hippocampal. (C) para la grabación de la actividad celular hipocampal, una sonda de silicona se monta en un microdrive. (D) tornillos miniatura se encuentran en el cráneo. Los alambres de cobre se presoldered al suelo y referencia de tornillo antes de colocar sobre el cerebelo. Cemento (E) se aplica para cubrir y conectar los tornillos. El circulo azul superior indica que la craneotomía fue realizada para la implantación de la sonda de silicona. Menor círculo azul indica donde la craneotomía fue realizada para la implantación de la fibra óptica en el hipocampo. Fibra óptica (F) uno se implanta en un ángulo caudal rostral a la región CA1 hipocampal. Una segunda fibra puede ser implantado en el tabique medial si se desea el estímulo de Somas celulares (opcional). Punta de prueba (G) la silicona se baja apenas sobre el área CA1 hipocampal. (H) las fronteras del microdrive y el conector se cementan a los implantes y la tierra, y se sueldan los cables de referencia. () Cobre malla está fabricada para rodear el implante y servir como una jaula de Faraday. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: preparación para arrastre de hippocampal de la theta optogenetic. ChR2 (A) se expresó en células septales mediales del PV+ en ratones PV-Cre (esquema superior). Fluorescencia brillante en MS (1, 2) confirma construcción exitosa expresión en Somas. Las fibras MS proyectan vía fórnix (f) y la fimbria (fi) al hipocampo (3-6); aca: comisura anterior; parte anterior. HDB: núcleo de la rama horizontal de la banda diagonal; O: estrato oriens. La fibra óptica para la estimulación de la optogenetic con la luz azul se implanta encima de la capa piramidal del hipocampo área CA1 (esquema inferior). Barras de escala: (imágenes 1, 3, 4) de 500 μm y 50 μm (imágenes 2, 5, 6). (B) LFP Hippocampal durante las oscilaciones de la theta espontánea (izquierdas) y 7 Hz (medio) o Hz 10 arrastre de optogenetic (derecha). Rayas azules indican las ventanas de tiempo de aplicación ligera. Tenga en cuenta la fase de reajuste por el pulso de luz indicado por una flecha. Nota gamma sobres durante theta espontánea y ocluido, un indicador del ritmo theta fisiológica. Fase de reversión entre estrato oriens (Str. o.) y radiatum del estrato (Str. reportes) se mantiene también durante el arrastre. (C) arrastre es confiable durante ipsolaterales (parcelas superiores), así como contralaterales (parcelas inferiores) estimulación de optogenetic. Esquemas ilustran posiciones de fibras respecto a posiciones de electrodos. Se muestran rastros LFP ejemplo en theta y la aplicación de pulsos de luz en el medio. A la derecha, alimentación de espectros de LFP hippocampal durante ipsi - y contralateral estimulación codificadas por colores según la frecuencia de estimulación. Esta figura ha sido modificada de ref. 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: fidelidad del arrastre de hippocampal de la theta optogenetic. (A) ejemplo hippocampal LFP rastros durante la fidelidad de arrastre bajo y alto. (B) las densidades espectrales de 10 épocas de s de energía espontánea theta, con registros ordenados según principales frecuencia theta (izquierda) y durante 7 Hz (medio) y estimulación de 10 Hz optogenetic (derecha), con registros ordenados según fidelidad de arrastre. Espectros de potencia ejemplo respectivo (indicados por una flecha) se trazan por encima. Nota fidelidad confiable arrastre a través de las épocas. A la derecha, se muestra la probabilidad acumulada de la fidelidad de arrastre para las frecuencias de la theta. (C) arrastre requiere estimulación rítmica theta. Actividad de la red hipocampo puede con éxito arrastrada con frecuencias entre 6-12 Hz. A bajas frecuencias (por ejemplo, 2 o 4 Hz) o mayor arrastre de frecuencias (e.g., 20 Hz) no es confiable. Esta figura ha sido modificada de ref. 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: manipulación paramétrico de regularidad de las oscilaciones theta. (A) estímulo fue aplicado a diferentes frecuencias dentro de la gama theta con una frecuencia media de 7,8 Hz siguiendo una distribución gaussiana. La desviación estándar de los intervalos entre pulsos se incrementó a través de protocolos de σ = 3.19 a σ = 15.09. En total, 11 protocolos fueron generados y aplicados, cada uno con una duración total de la época de estimulación de 1 minuto. De las personas, la distribución de probabilidad de 5 protocolos aparecen en la izquierda de la figura. Las densidades espectrales de potencia dentro de un rango de 1-14 Hz de la LFP hipocampal durante la aplicación de los protocolos respectivos se trazarán en el centro de la figura. Las probabilidades de los períodos de theta durante la aplicación de los protocolos respectivos se ilustran a la derecha. Intervalos de pulsos entre (B) la varianza de la aplicación determinaron la variación del período concurrente theta (r de Pearson = 0.94, p = 0.0002). (C) la relación entre la variabilidad de amplitud theta y el pulso entre intervalo (r de Pearson = 0,61, p = 0,08). Esta figura ha sido modificada de ref. 70. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: arrastre rítmica de Optogenetic theta determina LFP hippocampal durante comportamiento. (A) Optogenetic estimulación frecuencia determina la frecuencia theta durante la locomoción. Por lo tanto, aferentes relacionadas con la velocidad de impacto frecuencia theta hippocampal, y como consecuencia, velocidad no se correlaciona con la frecuencia theta (azul) ya que es durante el espontáneo theta (negro). Los datos se presentan como media ± SEM (B) durante la vigilia tranquila, theta hippocampal puede ser sacado en ausencia de movimiento. Hippocampal rastros LFP antes y durante el arrastre exitoso se muestran por encima de, y a continuación se muestran las trazas de velocidad ejemplo registrados durante el arrastre (el rastro rojo corresponde a la traza LFP hippocampal representada arriba). Franjas azules marcan las ventanas de tiempo de pulsos de estimulación de luz. Esta figura ha sido modificada de ref. 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: actividad celular hipocampal durante el arrastre theta. Se registró actividad celular (A) usando puntas de prueba de silicona (esquema). Solo interneuronas y células piramidales fueron aisladas e identificadas según su forma de onda respectiva. Se muestra aquí es la forma de onda media (medio) y auto-correlogram de una célula piramidal aislado de ejemplo. (B) fase de descarga preferido de las células piramidales (Pyr) no fue diferente durante el espontáneo (en negro, n = 29 neuronas) y optogenetically arrastrado (en azul, n = 30) theta (p = 0,79). (C) se muestra aquí es la auto-correlogram (izquierda) y fase de disparo preferencial de una interneurona de la rápido-leña durante espontánea y optogenetically arrastrado theta. A continuación el correspondiente ritmo LFP hippocampal espontánea (izquierda) y theta (derecha) ocluido. (D) fase de descarga preferido de interneuronas de la rápido-leña no fue diferente durante la espontánea (en negro) y optogenetically arrastrado (en azul, n = 28 neuronas) theta (p = 0,97). Medio auto-correlogram se muestra a la izquierda. Células de (E) promedio auto-correlogram Str. oriens. (F) fase de descarga preferido de interneuronas oriens de Str. no fue diferente durante el espontáneo (negro) y optogenetically arrastrado (azul, n = 10 neuronas) theta (p = 0,56). Histogramas de descarga recomendado: fases aparecen en la derecha. Las tasas de disparo promedio (G) no fueron afectadas por el arrastre de la theta en las células piramidales (p = 0.98), interneuronas de la rápido-leña (p = 0.96) o interneuronas oriens de Str. (p = 0,85). Esta figura ha sido modificada de ref. 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: combinación de hippocampal de la theta arrastre y optogenetic inhibición de la hippocampal subcortical de salida a través del LS. (A) eNpHR3.0 (halorodopsina) fue expresado en las células piramidales hipocampales (esquema superior). Expresión acertada de la construcción fue confirmada por fluorescencia brillante en Somas en el hipocampo (imágenes superiores) y los axones en el LS (imágenes inferiores). Fibras ópticas se implantaron bilateralmente sobre el LS (esquema inferior). Barras de escala: 500 μm (imágenes de la izquierda), 50 μm (imágenes a la derecha). Theta Hippocampal (B) es arrastrado con éxito durante la inhibición del hipocampo al camino de LS. Aquí se muestran densidades espectrales de potencia para el estímulo de luz azul 9 Hz durante la inhibición de la salida. (C) inhibición de la vía principal salida subcortical hipocampal evita efectos de arrastre de hippocampal de la theta en velocidad. Aquí se muestra es disminución de la variabilidad de la velocidad sobre el arrastre de optogenetic (blanco de la barra con bordes azules), con ausencia en la inhibición simultánea del hipocampo al camino de LS (barra amarilla con bordes azules). Velocidad inicial promedio respectivo aparece en la izquierda. Esta figura ha sido modificada de ref. 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.