Summary
בפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה משולבת חוקרים נדידת תאים סרטן ופלישה על פלטפורמה אחת בזמן אמת, מתן אפשרות היעילה הדירים בקלות ללמוד ניידות תא ו מורפולוגיה.
Abstract
סרטן התא ניידות חיונית אתחול של גרורות. לכן, חקירה של תנועת התא, קיבולת פולשנית היא משמעות רבה. העברת מבחני לספק תובנה בסיסית של תנועת התא ברמה 2D, ואילו מבחני הפלישה רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית, מחקה סרטן ויוו dislodgment תא מהאתר המקורי, פולשים באמצעות מטריצות. בפרוטוקול הנוכחי מספק זרימת עבודה יחידה עבור מבחני ההעברה ואת הפלישה. יחד עם משולב אוטומטי מיקרוסקופיים המצלמה עבור ניתוח מובנה מודול ותמונות בזמן אמת HD, זה נותן חוקרים היעילה, האפשרות ניסיוני פשוטה לשחזור. פרוטוקול זה כולל גם החלפות הגיוניות מתכלים ושיטות ניתוח חלופי עבור משתמשים לבחירה.
Introduction
נדידת תאים הפלישה חשוב תהליכים ביולוגיים המאפשרים פונקציות נורמלית בגוף האדם, כגון סגירת הפצע, הפלישה של השליה לתוך הרחם ואת עטין מורפוגנזה1,2,3בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. בגוף האדם יש שליטה קפדני ומדויק של אירועים אלה ביולוגי; עם זאת, ישנם כמה חריגים. גידולים ממאירים, למשל, מסוגלים לברוח הגנה זו, מוצג התפשטות חריגה, לפלוש לתוך רקמות שכנות, אשר נקרא גרורות. גרורות הוא הגורם העיקרי של תמותה מסרטן4.
סרטן השד הוא הכי נפוץ אובחן סרטן אצל נשים, הוא הגורם השני-הגבוה של מוות מסרטן בקרב נשים במדינות מפותחות ברחבי העולם5. סרטן השד מקורו של צינוריות או האוניות המורכבים של שכבה אחת או יותר של תאים אפיתל. בשד נורמלי, תאים אפיתל לדבוק אחד לשני וכדי קרום המרתף דרך הממברנה חלבונים כגון E-קדהרין אינטגרינים6. עם זאת, תאי סרטן שד פולשני איבדו קוטביות והצמדות התא-התא שלהם, ולא בסגנון קלאסי עוברים אפיתל המעבר mesenchymal (החובשים) ולהשיג את היכולת לנוע. לאחר extravasation, תאים אלה תנוע מטריצה חוץ-תאית (ECM) והזן את כלי הדם או מערכת הלימפה, ואחריו ואז intravasation וגידול גרורתי7. הבנת המנגנונים שבאמצעותו זו מתרחשת היא משמעות רבה, מאז גרורות הוא הגורם הנפוץ ביותר הקשורים לסרטן בהירושימה, קשורה קשר הדוק סרטן תא העברה/הפלישה. כדי להמחיש את התנועה של תאים סרטניים, מבחני ההעברה ופלישה הם מודלים אידיאלי ללמוד 2D and 3D תנועת התא, בהתאמה. העברה ישירות מעריך את התנועה של תאי ואילו הפלישה ושכוללת מגע עם microenvironment ואת היכולת לבזות את המחסומים הביולוגיים. שני התהליכים אינם עצמאית לחלוטין של זה, כמו הגירה היא דרישה של פלישה.
פותחו מספר שיטות ללמוד הגירה ו הפלישה. כפי שנבדקו על ידי קרמר ואח ', העברת מבחני כגון ריפוי הפצע, גדר, מיקרו-המוביל מבחני ליצור אזור נטול תאים כדי לאפשר תאים להעביר, הערכת השינוי של אזור; ואילו, מבחני transwell ו נימי מבוססים על מספר התאים שנעים לכיוון attractant8. מבחני הפלישה, סביבה ECM צריך להיות מוגדרת עם ג'ל ECM או קולגן למשל, התנועה 3D יכול להיות מוערך על ידי ניטור הפלישה פינת, מרחק, תא הסעיפים (למשל assay transwell, ברווזן assay)8. סוג נוסף של הפלישה assay היא לשלב את התאים פולשנית עם תאים לא פולשנית, להעריך את ההתנהגות של התאים פולשני (למשל, מבחני ספרואיד). השיטות שהוזכרו לעיל יש את היתרונות שלהם, אסירים, דרך קלה לגישה, קל לחזור על, שילוב וזמינותו ההעברה והיא הפלישה assay בזרימת עבודה דומה מועדף בעיצוב ניסיוני.
פרוטוקול זה מתאר את המדידה של נדידת תאים ופלישה באמצעות imager לחיות תאים. . זה תא בזמן אמת ניטור מערכת המותקנת בתוך חממה התרבות תאים סטנדרטית. זה לוקח תמונות בחדות גבוהה לפי ערכת סריקה במרווחי זמן ומדידות על-ידי החלת מסיכות מתאימות התאים או מטרות פלורסנט. המודול של העברה/הפלישה assay כולל באמצעות כלי גירוד 96 פינים, אשר מתאים לייצור הומוגניות לגרד פצעים על טפט התא בצלחת 96-ובכן. המנגנון מבוסס על הפצע במבחנה ריפוי מבחני, ניטור תנועת התא 2D פלסטיק או משטח מצופה. הפלישה או תלת-ממד התנועה מעבר ECM נוספים בתוך השריטה פצע יכול גם להיות מוערך. זרימת עבודה קצרה מודגם באיור1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: שתי שורות תאים צריך להיות מטופל בנפרד. ההליכים הבאים צריך להיות מוחל על קו תא בודד אחד אם לא צוין.
1. למטב את צפיפות התאים לפני פציעתו
- התרבות תאים חסיד ב T75 ס מ2 תרביות רקמה מבחנות עד כ 80% למפגש ב Dulbecco חינם של פנול אדום שונה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), 200 מ מגלוטמין ו- 2 µg/mL אינסולין ב 37 ° C עם 5% CO2 ( הדגירה סטנדרטי עבור רוב שורות תאים סרטן, תרבות ניסוחים התנאים תא תלויי-קו).
- להסיר את המדיה התרבות על ידי pipetting לתוך מיכל פסולת. Pipet 2 מיליליטר מראש ומחוממת 0.1% טריפסין-EDTA בקצרה לשטיפה תא טפט של pipet. להוסיף עוד 2 מ"ל של 0.1% טריפסין-EDTA ולמקם את הבקבוקון בתנאים סטנדרטיים הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
- טפח בעדינות את הבקבוק כדי להבטיח ניתוק של התאים ולאחר מכן להוסיף 10 מ של מדיה תרבות ומחוממת מראש כדי לעצור את התגובה הפרוטאוליטי.
- העברת התליה תא לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל ספין למטה ב x 200 גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). בזהירות להסיר את תגובת שיקוע מבלי לזעזע את צניפה תא, resuspend עם עוד 10 מ"ל מראש ומחוממת תרבות המדיה.
2. לספור את מספר הטלפון הנייד באמצעות מונה הניתן תא אוטומטית (או כל שיטות ספירה)
- µL 200 שתדללו של השעיה תא resuspended עם µL 800 1 x פוספט של Dulbecco במאגר מלוחים (DPBS) שפופרת צנטרפוגה 1.5 mL.
- לצרף בחיישן ספירת תאים מיקרומטר 60 הדלפק תא, החזק את דו-מצבי, למזג את הטיפ התליה תא. לאט לאט לשחרר את הדו-מצבי עד התליה תא בהצלחה הוא נשאב לתוך החיישן. ריכוז התאים מוצג ב תאים למ"ל.
- לחשב את המספר הסלולרי התליה תא 10 מ"ל.
3. תא יופיצ
- צלחת תאים בטווח של תאים צפיפויות (40,000-90,000 תאים/טוב) שהפקידים בצלחת 96-ובכן.
-
למקם את הצלחת םלצה תא חי, לתזמן סריקה כל שעתיים במשך 24 שעות ביממה.
- התוכנה, לחץ על לוח הזמנים סריקות מתוך רשימת המשימות. בחלונית הגדרת מגירה, לקבוע את המיקום של הצלחת, לחץ על הוסף כלי ולבחור את סוג הצלחת. בחלונית הגדרת סריקה , לבחור או ערוך את תבנית הסריקה לפי הגדרת צלחת ניסיוני, להגדיר סוג סריקה כמו רגיל.
- לחץ לחיצה ימנית על הזמן, ציר הזמן , בחר להגדיר מרווחי. הגדר להוסיף כל סורק 2 h-לוח זמנים 24 שעות ביממה. לחץ על החל.
4. לקבוע את התא אופטימלית זריעה צפיפות עבור וזמינותו ההעברה
- סנטהמבצע סריקה לאחר 24 שעות, החל המפגש עיבוד כלי ניתוח לתמונות חדות HD-פאזי שנאספו באופן אוטומטי ולהפיק עיקול התפשטות תא נגד הזמן.
- לקבוע 3-6 להחליפן בתמונות ומניחים בתוך אוסף תמונהחדשה.
- לקבוע מסכה נכונה כמו ההגדרה עיבוד.
- ההשקה עבודה ניתוח.
- לקבוע תא ממוטבת צפיפות בהתאם למפגש נגד הזמן (כ 100% זרימה בתוך 6: תרכיזי h תלוי מתי מתחילה וזמינותו ההעברה).
הערה: משך הזמן שנדרש כדי לגדול תאי זרימה משתנה בהתאם דילול זריעה.
5. בימים 1 ו- 2: לקראת העברה, מבחני הפלישה
-
יום 1, מעיל את הצלחת על הפלישה וזמינותו.
הערה: תמיד צריך להיות מטופל ECM ג'ל על קרח, עם טיפים הונחו במקרר למשך הלילה.- לדלל ג'ל ECM עם תרבות קר כקרח, למדיה µg 100/מ"ל ולהוסיף 50 µL של ג'ל ECM מדולל/מדיה לתוך בארות המיועד.
- המקום לצלחת-תנאים סטנדרטיים הדגירה למשך הלילה.
- יום 2, בעדינות תשאף התקשורת עודף. צלחת תאים עם תא ממוטבת צפיפויות לתוך שתי צלחות 96-ובכן המיועדים וזמינותו ההעברה (ללא ציפוי) ואת וזמינותו הפלישה (מצופה) ב- triplicates בעקבות סעיפים 1-3 אחר הצהריים המאוחרות (בפרוטוקול הנוכחי, צפיפויות זריעה ממוטב עבור ZR75-1 מד א-MB-231 היו 90,000/טוב ו 50,000/טוב, בהתאמה).
- למקם צלחות תנאים סטנדרטיים הדגירה למשך הלילה.
6. יום 3: פצע שריטה
- רסס ונגב בכלי גירוד ו- 2 שטיפה סירות עם אתנול 70% לפני הכנסתם אבטחה הקבינט. למלא את הסירה כביסה 1 ו- 2 בדיוק 45 מ ל סטרילי (בלוק) מזוקקים מים ו- 70% אתנול בהתאמה.
- עבור עיקור, במקום לבלוק הצמד בכלי גירוד (למעלה) על שטיפת הסירה 1 ו- 2 למשך 5 דקות.
-
להתחיל עם לוחית assay ההעברה.
- להעביר לצלחת המכילה תאים מן החממה וודא כי לא טוב הוא יבש כדי למנוע נזק של הכלי מאפס. הסר את מכסה לוח להכניס לתוך צלחת הבסיס האוחז הכלי מאפס, בזהירות המקום החלק העליון על החלק הבסיסי על ידי המנחה דובלי. הקש להחזיק את ידית שחורה ואני בינתיים בזהירות להרים את הבלוק pin. פערים מכל קידוח הם בדרך כלל גלויים בעין בלתי מזוינת, תחת המיקרוסקופ.
- במהירות להשרות את הסיכות במים; . זה מספיק כדי לנקות בכלי גירוד לפני מגרד את הצלחת assay הפלישה הצלחת ההתקנה הינו זהה. אחרת, חזור על השלבים עיקור עם מים מזוקקים סטריליים ולאחר מכן 70% אתנול למשך 5 דקות.
- לשטוף הזמנים צלחת 1 או 2 עם מדיה תרבות ומחוממת מראש כדי להימנע תאים מנותקת או תא גליונות חיבור מחדש אל הבאר.
- להוסיף 100 µL של התקשורת חם טרי לתוך בארות ייעודית עם או בלי טיפולים.
-
פעולות נוספות עבור הפלישה וזמינותו.
- מקם את הצלחת assay הפלישה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות equilibrate, בזהירות תשאף התקשורת קר.
- לדלל ג'ל ECM עם תרבות קר כקרח, למדיה 5 מ"ג/מ"ל, להוסיף 50 µL של ג'ל ECM מדולל לתוך בארות המיועד, תחת סטנדרט הדגירה למשך 30 דקות.
- להוסיף 100 µL של התקשורת חימם-up עם או בלי בדיקות תרכובות.
- למקם את הצלחת לחיות תאים imager ולתת לו equilibrate עבור 5 דק. בחר סוג אניה כמו צלחת imagelock. להגדיר סוג סריקה כמו לגרד פצע, לבחור או ערוך תבנית לסרוק בהתאם לכיוונון צלחת ניסיוני (1 תמונה/טוב, מצב רחב), לתזמן 24 שעות אני חוזר סריקת כל ה 1-2 עבור 72 h עד הפצעים הגלידו.
- כדי לנקות הכלי מאפס, לשים את הבלוק הסיכה העליונה בכל הפתרונות הבאים (45 מ ל שטיפה סירות) עבור 5 דקות: 0.5% אבקת 1 אבקת 1% (ראה טבלה של חומרים), 2 (ראה טבלה של חומרים), סטרילי אתנול 70% ומים מזוקקים. מניחים בכלי גירוד חזרה אל צלחת הבסיס שלה, חנות בסביבה נטולת אבק.
7. ניתוח נתונים
- הפסק סריקה המשטח המיועד לאחר כל הפצעים הגלידו על-ידי בחירת את הצלחת הניסוי על המגירה ההתקנה ולחיצה להסיר כלי.
- לאסוף 3-6 להחליפן בתמונות המתפרסות על-פני טווח אחוזים סאונד, כולל תמונות ימין לאחר הפצע בוצע, פצע הסגר על-ידי 10% ו 50%.
- כדי לקבוע הגדרה עיבוד מתאים, השתמש פילוח ההתאמה, ניקוי ומסננים כדי להחיל המתאים לגרד פצע את המסכה ואת מסיכת הנהרות. השתמש המקדימה הנוכחית/כל כדי להציג את הדיוק של המסכות.
- הפעל משימת ניתוח.
- נתונים שניתן לנתח בתוך התוכנה או מיוצא לצורך ניתוח נוסף. שלושה מדדים הניתנים על ידי התוכנה ניתן להשתמש כדי להעריך את תמונות HD-פאזי: פצע רוחב (מיקרומטר), פצע הנהרות (%) וצפיפות הפציעה היחסי (%). השוואות יידונו בסעיף הבא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Assay הגירה/הפלישה הזו מבוססת על וזמינותו ריפוי הפצע, הבודקת את הקצב של התאים נעה לתוך אזור נטול תאים שנוצרו על-ידי הכלי מאפס 96 פינים. ההבדל בין מבחני ההעברה ופלישה הם מבחני ההעברה כי תאי מידות עובר בתאי רקמת-תרבות מטופלים פלסטיק משטח ופלישה אמצעים העברת ECM ג'ל.
בכלי גירוד נועד לגרום עקבי פצעי הזמני בצלחת המיועד, םלצה לחיות תאים מתוכנן לקחת תמונות ברזולוציה גבוהה בזמן אמת עם הפצעים מאפס באמצע. השניים השד סרטן קווים המשמשים את הפרוטוקול הנוכחי הם ZR75-1 ומד א-MB-231, יסווגו luminal B, משולש שלילי תת בהתאמה9. גירוד הפצעים שנוצרו על-ידי בכלי גירוד 96 פינים נפוץ בין 700-900 מיקרומטר אך עשויים להשתנות בין שורות תאים שונים (איור 2).
עבור ההעברה וזמינותו, ניתנים בשלושה מדדים: הפצע (1) רוחב (מיקרומטר) הוא המרחק הממוצע בין גליונות תא לצד הפצע (איור 3). (2) הפצע הנהרות (%) הוא המפגש בתוך אזור wounding (איור 3). המפגש האידיאלי הפצע הראשוני צריך להיות קרוב 0%. (3) צפיפות הפציעה היחסי (%) היא אלגוריתם חיסור-רקע [% יחסית פצע צפיפות = 100 * (w(t) - w(0)) / (c(t) - w(0)), t = בזמן t, w = צפיפות של אזור הפצע c = צפיפות של תאים באזור], מדידת הצפיפות של אזור הפצע ביחס לצפיפות של האזור תא.
ניתן להשיג שלושה מדדים זכאי בהתאם לצרכים. הפצע היחסי צפיפות, הפצע הנהרות לרמוז המהירות של תאים כובש את אזור הפצע מאפס, הם כמעט חופפים בשני הקווים התא. אבל השניים תא קווים הראה שונה מאוד ריפוי הפצע יכולות, איפה בסיום (בסביבות 50 h) של הפצע תהליך של מד א-MB-231 תאים, התאים ZR75-1 הריפוי היה כ-50% פצע כיסוי (שני מדדים לעיל), מעל 400 מיקרומטר שנותרו פצע רוחב, המציין בעל יכולת העברה נמוך יותר של תאי ZR75-1 (איור 4).
ההתנהגויות הגירה של תא שני הסוגים שונים, ניתן להשוות המבוסס על תמונות מוקלטות. Lamellipodia (בליטות blebbing) נצפו בתאים מד א-MB-231 בחזית ההעברה בתחילת ההעברה, אשר היה סימן אופייני של שלד התא שחלוף, בימוי תנועת התא לכיוון האזור תא10 (איור 5 ). תאים ZR75-1 הראה שום סימן נדידת תאים באותו הזמן-הנקודה (איור 5).
מטרי פצע צפיפותה היחסית מומלצת על ידי היצרן עבור תא הפלישה, כמו זה וזמינותו תלת-ממד, ניתוח המבוסס על הנהרות אינה ישימה. בתוך זובידאת, הצפיפות הפציעה היחסי של מד א-MB-231 תאים היה רווי (100%), ואילו הצפיפות הפציעה היחסי של תאים ZR75-1 לא השתנה במשך הזמן, המציין את פנוטיפ פולשני ביותר של מד א-MB-231 התאים הלא-invasiveness של ZR75-1 תאים ( איור 6).
מד א-MB-231 תאים גם התנהגו אחרת תוך פלישה באמצעות ECM ג'ל (איור 7). בהשוואה לתאים bleb בחזית ההעברה, פולשים התאים הראה על מורפולוגיה מוארך עם בליטות המובילים.
איור 1 : זרימת העבודה של ההעברה ופלישה assay בפרוטוקול הנוכחי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : ביצועים של הכלי שריטות על תאי סרטן השד קווים ZR75-1 ומד א-MB-231 (החלונית העליונה) עם זרימה הפצע הראשונית (החלונית התחתונה) והרוחב הפצע הראשונית נמדד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : העברה assay מאויר על ידי תמונות חדות HD שלב ומצב מעורבב עם מסכות של מד א-MB-231. כחול, לגרד פצע; צהוב, התאים המקיפים את השריטה פצע; תאים ורוד, זה עבר לגור השריטה פצע-24 שעות לאחר שריטה. גודל ברים = 300 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : השוואה של שלושה אלגוריתמים (רוחב הפצע, הפצע היחסי צפיפות, הפצע זרימה של שורות תאים של סרטן השד ZR75-1 (משמאל), מד א-MB-231 (מימין)- כל הניסויים מייצגים הממוצע של 3 ניסויים עצמאית, ± בפסי סולם ש = 300 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : העברה הקדמי של ZR75-1 ומד א-MB-231 תאים 4 שעות לאחר שריטה. חיצים, lamellipodia בחזית ההעברה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 : כימות של הפלישה באמצעות המדד היחסי פצע צפיפות (%) של השד סרטן תאים בטור ZR75-1 (משמאל), מד א-MB-231 (מימין)- כל הניסויים מייצגים הממוצע של 3 ניסויים עצמאית, ± ש אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7 : מאפיינים שונים הסלולר של מד א-MB-231 תאים ההעברה (משמאל) ואת הפלישה (מימין)- אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 8 : דוגמה של שריטה פצע זה לא יכול להיות מנותח על ידי העברה משולב מודול מצלחת 96-ובכן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההעברה הפלישה פרמטרים חשובים כדי להעריך את הניידות של תאי הסרטן בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. על-ידי שימוש בכלי גירוד 96 פינים, זה אפשרי לערוך ריפוי מבחני ב 2D and 3D בו זמנית הפצע. מלבד בהנחיה בסריקה אוטומטית באמצעות סביבת התרבות התא יציב עם הפרעה מינימלית, וזמינותו מאפס נערך באמצעות הכלי מאפס 96 פינים מספק עקבי פצעי הזמני, הפעלת ניסויים כי הם עמידים יותר, לשחזור. התבנית 96-ובכן צלחת נותן אפשרויות נוספות של הגדלת מספר שורות תאים או טיפולים תרופות שונות. בנוסף, שינויים מורפולוגיה תאים ותנועה דינמי ניתן לרשום לצורך ניתוח נוסף.
העברה/הפלישה וזמינותו נועד לחול בקלות עם כמה תנאים מוקדמים. טפט תא confluent היא קריטית לפני ופצעו כדי להבטיח תנועה תא מכוונת כלפי הפער. לכן מומלץ מאוד כדי למטב את התא זריעה צפיפות ולאחר פרק זמן בין 6-18 h הוא בדרך כלל אידיאלי. היכולת של התאים ניסיוני צירוף השטח ואת קצב התפשטות ישפיעו על פרק זמן זה. דגירה ממושך זמן עשוי להוביל התא-התא חזק אדהזיה וליצור תא דו-כיווני עקום חזיתות עקב הסרת תאים גליונות. ציפוי biomatrix תהיה שימושית עם פחות שורות תאים דבק, כדי להקטין את זמן ההמתנה. התאים ניתן להרעיב לפני פציעתו. תזמון הרעבה דומה לגרד תזמון, אשר כאשר המפגש מגיע כמעט 100%, רעב מדיה ומשך סוג התא התלויים. גם יכול להיות transfected תאים, אך זריעה צפיפות יש נקבע זמן ממושך לפני פציעתו, בהתחשב זמן הדגירה של תהליך תרביות תאים. ופצעו יכולה להיות מושגת תוך כמה שניות שימוש בכלי גירוד 96 פינים. סיכות בגודל מוגדר מבטיחים לקו הזינוק העברה מדויקים/הפלישה בעלת מרחק. חשוב, הסעיפים התחתונים והעליונים חייב להיות מסודרים היטב כדי להשלים שריטה מלאה על פני הבארות, כך התמונות לחיות תאים לא תכלול גם מסוף פצעי הזמני. פצעי גירוד יכול להיות שנצפו בקלות דרך העיניים עירומה על טפט תא confluent ולא ניתן במהירות לבדוק תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. כביסה הבארות צריכה להתבצע באופן מיידי, בעדינות כדי להימנע reattachment של יצא ממקומו תאים והסרה של תאים דו צדדיים. אם כביסה אחת מספיקה לנקות את האזור הרצוי ללא תאים, יש צורך ושטוף נוספים.
העברת מבחני ניתן להשלים על ידי הוספת מדיה תרבות עם או בלי טיפולים והם מוכנים לסרוק, בעוד כמה צעדים נוספים יש צורך לקחת בחשבון עבור וזמינותו פלישה. בניגוד נדידת תאים, התאים הפולשים לחדור דרך ECM, אשר באופן הדוק יותר משקף ויוו תנועת התא טוב יותר. המנהל של פרוטוקול הנוכחית היא לייצר סביבה מוקף ECM באמצעות ECM ג'ל. התאים הם נזרע על ECM מצופים ג'ל בארות, לאחר פציעתו, ECM ג'ל מורכבת משכבות על התאים, הפצע מאפס. בעת טיפול ECM ג'ל, עדיף לשמור את הכול קר כדי להימנע gelation. ג'ל ECM לצר מבוזרת עלול לגרום לבעיות כאשר התמקדות המיקרוסקופ. בשל אופיו צמיגה של ECM ג'ל, זה ניתן להפיק בועות, אבל הבועות ניתן להסיר בקלות באמצעות כ רפה בעברית 70% אתנול באמצעות בקבוק ספריי. כדי ליצור תרסיס דק, אבל לא מוגזם, פשוט פתחו את הברגת הפקק של הבקבוק ספריי, תרסיס את האתנול 70% עודף בתוך הקש הצבעה במקום אחר. על ידי ריסוס במרחק מעל ואופקיים לצלחת, התרסיס בסדר של אתנול 70% מספיקה לחסל את הבועות.
הסריקה הראשונה צריך להתחיל בהקדם האפשרי לאחר פציעתו, כדי ללכוד אזור הפצע ללא תא הראשונית, וזה חשוב לגיבוש הקריטריונים לניתוח. המרווחים הסריקה תלוי בסוג התא, כמו שורות תאים פולשניים יותר יש קצב סגירת הפצע מהירה יותר.
יישום הגירה/הפלישה זה היא פשוטה יחסית, באמצעות ניתוח מובנה המודול, תנועת התא יכול להיות בגרף kinetically עם 3 מדדים: הרוחב פצע, פצע הנהרות, הצפיפות היחסית הפצע (איור 3). כל השלושה יכול לשמש כדי להעריך את ההעברה. הפצע רוחב מתאר את המרחק הממוצע במיקרומטר הסדינים תא הדו-צדדיים להזיז יחסית במקביל, היא עצמאית של גבולות הפצע הראשונית. הפצע הנהרות וצפיפות הפציעה היחסי, להפך, דורשים את הגבול הפצע הראשונית בחישוב, לתאר את המפגש בתוך אזור הפצע, צפיפות תא יחסית באזור unwounded, בהתאמה. הפלישה וזמינותו, צפיפות הפצע יחסית מומלץ, מאז הוא מחשב אזור הפצע ביחס הסדינים תא הדו-צדדיים. הקוראים יכולים לבחור את אחד המייצג בצורה הטובה ביותר לצרכים שלהם.
Assay הגירה/הפלישה זה פצע גירוד יכול להיות נוח, אבל זה דורש בכלי גירוד 96-pin המיועד צלחות, םלצה תא לחיות עם מודול ההעברה משולב/הפלישה לשחזר את התוצאות טיפוסי הוצג פרוטוקול זה, ו אלה יכול להיות יקר. החלפות חסכונית כמו תחתון שטוח צלחת 96-ובכן multiwell יכול לשמש וצור פצעי הזמני הגון (נתונים לא מוצג). עם זאת, הביצועים של כלי גירוד לא היה טוב כמו כאשר המשטח המיועד היה בשימוש, יש פצעים יכול לא להיות נטל על ידי מצב סריקה (איור 8), ובכך מסוגלת להגדיר כראוי את אזור הפצע הראשונית. בנוסף, בכלי גירוד יכול לשמש כדי ליצור, פצעי גירוד עם ניתוח באופן ידני, על-ידי תוכניות לעיבוד תמונה, או באמצעות כלי הדמיה וניתוח אחרים מובילים. הם מספקים גמישות רבה יותר כדי לאתר את הפצעים הראשונית, ולכן אינם מוגבלים הלוחות המיועדים לכך. מצד שני, וזמינותו הגירה/הפלישה בשילוב עם הדמיה לחיות תאים בפרוטוקול הנוכחי הוא פחות זמן רב פחות לשגיאות. זה יכול להיות שימושי במיוחד עבור עקביות ניסיוני ויעילות מוגברת.
לסיכום, זו assay הגירה/הפלישה הוא מהיר, קל וחזק. המשתמשים יכולים לבחור מתוך הפרוטוקול שלנו, אחרים בהתבסס על הצורך שלהם ואת התקציב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
ברצוננו להודות תמיכתנו מימון על ידי קרן קבוצת בלומפילד דרך צייד המכון למחקר רפואי (HMRI 13-02). X.Z נתמך על ידי מלגת APA דרך האוניברסיטה של ניוקאסל את המלגה לתואר שלישי HCRA הדגל סמנים ביולוגיים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | Dilute to 2x in DPBS |
| Countess II FL Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Detergent 1 (Alconox) | Sigma-Aldrich | 242985 | 0.5% working concentration |
| Detergent 2 (Virkon S) | VetProduct DIRECT | 1% working concentration | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplimented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 μg/ml insulin |
| ECM Gel (matrigel) | Sigma-Aldrich | E6909 | Growth-factor reduced, phenol red free |
| Essen ImageLock 96-well plate, flat bottom | Essen | 4379 | |
| EVE Counting slides | BioTools | EVS-50 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| IncuCyte 96-well scratch wound cell invasion accessories | Essen | 4444 | Including CoolBox, 2x CoolSink |
| IncuCyte Cell migration kit | Essen | 4493 | Including the 96-well pin block, 2x wash boats and the software |
| IncuCyte ZOOM | Essen | Live cell analysis system | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | 19278-5ML | |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-091 | |
| Tissue culture flask, 75 cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 |
References
- Graham, C. H., Lala, P. K. Mechanisms of placental invasion of the uterus and their control. Biochemistry and Cell Biology. 70, 867-874 (1992).
- Affolter, M., Zeller, R., Caussinus, E. Tissue remodelling through branching morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 831-842 (2009).
- Brugues, A., et al. Forces driving epithelial wound healing. Nature Physics. 10, 683-690 (2014).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van't Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5, 591-602 (2005).
- Breast Cancer: Estimated Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in 2012. GLOBOCAN. , Available from: http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx (2012).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A.
- Scully, O. J., Bay, B. H., Yip, G., Yu, Y.
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752, 10-24 (2013).
- Holliday, D. L., Speirs, V. Choosing the right cell line for breast cancer research. Breast Cancer Research. 13, 215 (2011).
- Clark, A. G., Vignjevic, D. M. Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment. Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).
