自動生細胞固体撮像素子を使用して単純な移行/侵略ワークフロー

Summary

現在のプロトコルでは、がん細胞の遊走とリアルタイムで単一のプラットフォームに侵略を調査、細胞の移動と形態の勉強を簡単に再現できると時間効率の良いオプションを提供する統合的な手法について説明します。

Abstract

がん細胞移動は転移の開始にとって重要です。したがって、細胞運動と侵襲的な容量の調査は意義があります。移行の試金は浸潤アッセイは、生体内でがん細胞外れて元のサイトの真似をして細胞外マトリックスを介して侵入、もっと生理学的関連に対し 2 D レベルで細胞運動の基本的な洞察力を提供します。現在のプロトコルは、移行および侵略の試金のための単一のワークフローを提供します。一緒に統合された自動顕微鏡カメラ リアルタイム HD 画像と内蔵の解析モジュールのため、それは研究者、時間の効率的なシンプルで再現性のある実験的なオプションを提供します。このプロトコルには、消耗品の置換とから選択するユーザーのための代替手法も含まれています。

Introduction

細胞の遊走と浸潤は、創傷閉鎖、胎盤の子宮と乳腺形態^1,2,3への侵入など、人間の体の正常な機能を可能にする重要な生物学的プロセスです。人間の体はこれらの生物学的イベントの正確かつ厳格に管理ただし、いくつかの例外があります。悪性腫瘍、たとえば、このセーフガードを脱出し、異常増殖を示す転移と呼ばれる、周辺の組織に侵入することが。転移は癌関連死亡率⁴の主要な原因です。

乳がんは、最も一般的女性の癌を診断され、先進国世界⁵の女性の間で癌関連死の 2 番目に高い原因です。乳がんは、ダクトや小葉の上皮細胞の 1 つまたは複数のレイヤーで構成されるから起きる。通常の乳房の上皮細胞は互いと E-カドヘリンやインテグリン⁶などの膜蛋白質を介して基底膜に付着します。しかし、浸潤性乳癌細胞の極性や細胞接着を失っている古典的な上皮間葉転換 (EMT) を受けるし、移動する能力を得る。血管外漏出後、これらの細胞は細胞外マトリックス (ECM) の間で移動し、血管やリンパ系、それから続いて intravasation と転移の成長⁷を入力します。これが発生するメカニズムを理解することが重要、以来、転移癌関連死亡の最も一般的な原因し、密接に関連してがん細胞の移行/侵略。がん細胞の動きを可視化、移行と浸潤アッセイ、2 D と 3 D の細胞運動をそれぞれ研究に理想的なモデルです。移行は直接侵入、微小環境と生物学的障壁を低下させる能力との相互作用を含むに対し、細胞の運動を評価します。移行は侵略の要件として 2 つのプロセスは、互いに完全に独立しています。

移行と侵略を研究するいくつかの方法が開発されています。フェンスとマイクロ キャリア ・ アッセイが領域の変化を評価するセルを移動できるように携帯無料領域を生成として Kramer ら、創傷治癒など移行アッセイによって一方、transwell と毛細血管のアッセイは、誘引⁸に向かって移動するセルの数に基づいています。ECM 環境は例えば、ECM ゲルやコラーゲンを設定する、浸潤アッセイと侵攻エリア、距離、セル数 (例えば transwell 試金、カモノハシの試金) を監視することによって 3次元の動きを評価する⁸。浸潤能の測定の別のタイプは、非侵襲的な細胞の侵襲性のセルを結合し、侵襲的な細胞の行動を評価する (例: 回転楕円体試金)。上記の方法の長所と短所と簡単にアプローチを繰り返して、移行アッセイを結合する簡単な方法があるし、似たようなワークフローの浸潤能の測定は実験的なデザインで優遇。

このプロトコルでは、細胞の遊走と浸潤細胞の撮像素子を使用しての測定について説明します。標準細胞文化のインキュベーターでインストールされているシステムを監視リアルタイム細胞です。スキャン間隔と測定セルまたは蛍光体に適切なマスクを適用することによって設定によると高精細画像がかかります。96 ウェル プレートに細胞膜上に均一なひっかき傷を作りに適した 96 ピンのスクラッチ ツールを使用して移行・浸潤アッセイのモジュールが含まれます。機構は、体外傷癒しの試金、プラスチックや塗装面に 2次元細胞運動の監視に基づいています。侵略やスクラッチ傷内追加 ECM 間で 3次元の動きも評価することができます。簡単なワークフローを図 1に示します。

Protocol

注:2 つのセルラインを個別に処理する必要があります。次の手順する必要がありますが 1 つの単一セルの行に適用されます指定されていません。

1 負傷する前に細胞密度を最適化します。

1. T75 cm²培養フラスコを約 80% の付着性細胞の培養でフェノール レッド無料ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS)、200 mM L グルタミン 5% CO₂ (37 ° C で 2 μ g/mL インスリンと合流ほとんど癌セルライン文化製剤の標準培養条件がセルの行に依存) です。
2. 廃棄物コンテナーにオフ ピペッティングによる文化メディアを削除します。予め温めておいた 0.1% トリプシン-EDTA を単層細胞とピペットを簡単に洗うことの 2 mL をピペットで移しなさい。0.1% トリプシン-EDTA の別の 2 mL を追加し、5 分の 37 ° C で標準的な培養条件下でフラスコを置きます。
3. 細胞の剥離を確実に、フラスコを軽くし、タンパク質分解反応を停止するために予め温めておいた培地 10 mL を追加します。
4. 15 mL 遠心管、室温 (RT) で 5 分間 200 x gでスピンダウンに細胞懸濁液を転送します。慎重に細胞ペレットを撹拌せず上澄みを除去し、別の 10 mL に予め温めておいた文化メディアで再懸濁します。

2. 自動化された細胞カウンター (またはカウントのメソッド) を使用してセル数を数える

1. ダルベッコ リン酸 x 1 の 800 μ L で再懸濁細胞懸濁液の希釈 200 μ L は、1.5 mL 遠心チューブに生理食塩水 (DPBS) をバッファーしました。
2. 60 μ m 細胞カウント センサーを付けるセル カウンター、トグルを押し細胞懸濁液に先端をマージします。細胞懸濁液はセンサーに正常に描画されるまでゆっくりとトグルを解放します。細胞濃度は細胞/ml に表示されます。
3. 10 mL の細胞懸濁液の細胞数を計算します。

3. セルめっき

1. プレート細胞細胞の密度 (40,000 90,000 細胞/ウェル) 96 ウェル プレートで 3 通の範囲で。
2. 住セルイメージ イメージャにプレートを置き、24 時間すべての 2 h をスキャンをスケジュール設定します。
   1. ソフトウェアで、タスク一覧から「スケジュール スキャン」をクリックしてします。引き出しのセットアップ ウィンドウでプレートの位置を決定する、追加の容器をクリックし、プレートの種類を選択します。スキャン セットアップウィンドウを選択または板実験設定に従ってスキャン パターンを編集し、標準としてスキャンの種類を設定します。
   2. タイムラインを右クリックし、間隔の設定を選択します。24 時間スケジュールで 2 h に追加スキャンすべてを設定します。適用をクリックします。

4. 移行の試金のための播種密度最適のセルを決定します。

1. 24 h 後スキャン Stop 合流点処理に自動的に収集される HD 位相コントラストの画像解析ツールを適用し、時間に対する細胞増殖曲線の生成します。
   1. 3-6 代表的なイメージを決定し、新しいイメージのコレクションで配置します。
   2. 処理定義として適切なマスクを決定します。
   3. 分析ジョブを起動します。
   4. 時間と合流点によると最適化された細胞密度を決定 (約 100% 合流 6 内遊走試験開始時に応じて-18 h)。
      注:合流する細胞の成長にかかる時間の量は、播種の希釈によって異なります。

5 日 1 と 2: 移行と侵略の試金のための準備

1. 1 日目に浸潤アッセイ用プレートをコートします。
   注: ECM ゲルは、一晩冷蔵庫の中に配置されているヒントと氷の上常に処理する必要があります。
   1. ECM ゲルを 100 μ g/mL の冷たい培地を希釈し、指定されたウェルに希釈した ECM ゲル/メディアの 50 μ L を追加します。
   2. 場所標準的な培養条件でプレートを一夜します。
2. 2 日目、優しく余分なメディアを吸い出しなさい。(現在のプロトコルの最適化された播種密度で午後遅くに移行の試金 (コーティング) のための指定 2 の 96 ウェル プレートと次のセクション 1-3 トリプリケートで (コーティング) 浸潤能の測定に最適化された細胞密度と細胞をプレートします。ZR75-1 と MDA MB 231 90,000/ウェルと 50,000/まあ、それぞれでした)。
3. 標準培養条件にプレートを一晩置きます。

6. 3 日目: 傷傷

1. スプレーでスクラッチ ツールと 2 キャビネット、バイオ セーフティにそれらを置く前に 70% のエタノールのボートを洗って拭きます。正確 45 ml の滅菌 (オートクレーブ) 蒸留水と 70% のエタノールの洗濯船 1 と 2 をそれぞれ入力します。
2. 殺菌、洗浄 5 分の 1 と 2 のボートのスクラッチ ツール ピン ブロック (上) を配置します。
3. 移行アッセイ プレートを始めます。
   1. インキュベーターから細胞を含むプレートを移動し、スクラッチ ツールの損傷を防ぐため乾燥井戸がないかどうかを確認します。プレート カバーを取り外しますとスクラッチ ツールのベース プレート ホルダーに挿入し、ダボを導くことによって基本の部分に上の部分を慎重に配置。黒いレバー キーを押しながら一方 pin ブロックを慎重に持ち上げます。各ウェル内のギャップが肉眼および顕微鏡下で通常表示されます。
   2. すぐに水でピンを浸すこれはプレートの設定が同じ場合、浸潤アッセイ プレートをスクラッチ前にスクラッチ ツールをきれいにするための十分なです。それ以外の場合、5 分間滅菌蒸留水とし、70% エタノール殺菌手順を繰り返します。
4. 洗浄剥離細胞または細胞を避けるために予め温めておいた文化メディアでプレート 1 または 2 回は、井戸に再アタッチ シートします。
5. 指定された井戸または治療せずに新鮮な暖かいメディアの 100 μ L を追加します。
6. 浸潤能の測定のための追加の手順です。
   1. 均衡を取って、慎重に冷たいメディアを吸引に 5 分間、4 ° C で浸潤アッセイ プレートを配置します。
   2. ECM ゲル 5 mg/mL に冷えた培地を希釈指定井戸に希薄の ECM ゲルの 50 μ L を追加し、30 分の標準的な孵化の下に置きます。
   3. 化合物をテストすることがなくウォーム アップ メディアの 100 μ L を追加します。
7. 生細胞の撮像素子にプレートを置き、5 分 imagelock プレートとして容器の種類を選択の平衡それ。スクラッチ傷としてスキャンの種類を設定選択または板実験設定 (1 画像/ウェルとワイドモード) に従ってスキャン パターンを編集し、スキャンをスケジュール設定 24 時間繰り返し 72 時間ごとの 1-2 時間の傷が癒されるまで。
8. 5 分: 0.5% 洗剤 1 の次のソリューション (ボートの洗浄に 45 mL) の各トップ ピンのブロックを置くスクラッチ ツールをきれいにする (材料の表を参照)、1% 洗剤 2 (材料の表を参照してください)、滅菌蒸留水と 70% エタノール。埃のない環境で、ベース プレートと店に戻ってスクラッチ ツールを配置します。

7. データ解析

1. 引き出しセットアップ板の実験を選択、容器の削除をクリックしてすべての傷が癒された後に指定されたプレートをスキャンを停止します。
2. 傷が行われた後、創傷閉鎖 10% と 50% の画像権利を含む音の割合の範囲にまたがる 3-6 代表的な画像を収集します。
3. 適正処理の定義を調べるには、セグメンテーション調整、クリーンアップとフィルターを使用して適切なスクラッチ傷マスクと合流マスクを適用します。電流/すべてのプレビューを使用すると、マスクの精度を表示できます。
4. 分析ジョブを起動します。
5. データをソフトウェア内で分析またはさらなる分析のためにエクスポートすることができます。HD 位相画像を評価するソフトウェアによって提供される 3 つのメトリックを使用できます: 傷傷の幅 (μ m)、合流 (%) および相対的な傷密度 (%)。比較は、次のセクションで説明します。

Representative Results

この移行・浸潤アッセイは、96 ピン スクラッチ ツールによって作成された無料のセル領域に移動細胞の率を評価する創傷治癒アッセイに基づいています。移行と浸潤アッセイの違いは、移行がメジャーのセル処理培養プラスチック表面との侵略対策細胞の ECM ゲルを渡って移動を試金。

スクラッチ ツールは、指定されたプレートに一貫性のあるスクラッチ傷をように設計されています、住セルイメージ イメージャが途中でひっかき傷とリアルタイム高解像度画像を撮影する設計されています。2 つの乳房のがん細胞の現在のプロトコルで使用する線は、ZR75 1 および MDA-MB-231、内腔 B として分類し、トリプル ネガティブ サブタイプそれぞれ⁹。96 ピン スクラッチ ツールによって生成されたスクラッチ傷一般 700 900 μ m の間が異なる細胞 (図 2) の間で異なる場合があります。

移行分析の 3 つの指標が提供されます: (1) の巻き幅 (μ m)、細胞シート傷 (図 3) の横にある間の平均距離。(2) 創傷合流 (%) は、(図 3) の負傷の領域内で合流です。理想的な初期傷合流は 0% に近いする必要があります。(傷 3) 相対密度 (%) はバック グラウンド減算アルゴリズム [% 相対傷密度 = 100 * (w(t) - w(0))/(c(t) - w(0))、 t時間t、 w = = 傷領域の密度、 c = セルの領域の密度]、セル領域の密度に比例した傷の領域の密度を測定します。

ニーズに基づいて 3 つの対象となる指標を実現できます。傷の相対的な密度および傷合流スクラッチ傷面積セルの速度を意味し、両方の細胞にほぼ重なります。しかし、2 つの非常に異なる創傷治癒能力、どこ傷 (50 h) 頃の竣工で治癒過程 MDA MB 231 ZR75 1 細胞の約 50% に巻いたカバレッジ (上記の 2 つの指標)、残りの以上 400 μ m 巻き幅を示した線セルZR75 1 細胞 (図 4) の低い移行の能力を示します。

2 つのセル型の移行挙動は異なっていたし、記録画像に基づいて比較することができます。ケラトサイト (ブレブ突起) にみ MDA MB 231 細胞骨格転位の典型的な兆候は、移行の先頭に移行前ではセル フリー領域¹⁰ (図 5 に向けた細胞動きを演出).ZR75 1 セルが同じ時間の時点 (図 5) で細胞遊走の兆候を示した。

それは 3 D のアッセイと合流ベースの分析は適用されません、メトリックの相対的な傷の密度は細胞浸潤については、製造元が推奨されます。50 時間以内 MDA MB 231 セルの相対傷密度が飽和 (100%)、ZR75 1 セルの相対傷密度変化しない時間、ZR75 1 セル (非侵襲 MDA MB 231 細胞の高度侵襲的な表現型を示すに対し図 6)。

MDA MB 231 細胞はまた ECM ゲル (図 7) を侵略しながら異なった。移行前に胞細胞と比較して、主要な突起と細長い形態を示した細胞に侵入します。

図 1: 現在のプロトコルの移行と浸潤アッセイのワークフロー 。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: スクラッチ ツールを乳癌細胞上のパフォーマンス線測定の初期傷幅と初期傷合流 (下段) ZR75 1 と MDA-MB-231 (上部パネル).この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: HD 位相コントラスト画像と MDA MB 231 のマスクとブレンド モード移行アッセイ。青、スクラッチ傷;黄色、細胞周囲のスクラッチ傷;24 h で傷の傷の後で最初に移動ピンク、セルです。スケール バー = 300 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: 3 つのアルゴリズムの比較 (傷幅、相対的な傷密度および乳房癌セルライン ZR75 1 (左) と (右) MDA-MB-231 の傷合流。すべての実験を表す 3 つの独立した実験、± の平均エスディ スケールバー = 300 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 5: 移行の前面 ZR75 1 および MDA MB 231 細胞傷の後の 4 h.矢印、移行フロント ケラトサイト。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 6: 乳房癌セルライン ZR75 1 (左) および MDA-MB-231 (右) のメトリック相対傷密度 (%) を使用して侵入の定量化します。すべての実験は 3 つの独立した実験、±、標準偏差の平均値を表すこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 7: 移行 (左) と (右) の侵略の MDA MB 231 セルのさまざまな細胞特性。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 8: 96 ウェル プレートから統合移行モジュールによって分析することはできませんスクラッチ傷の例。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Discussion

移行と侵略は、癌細胞の移動を評価する重要なパラメーターです。96 ピンのスクラッチ ツールを使用して、2 D と 3 D の試金を同時に治癒を行うことが可能です。別に自動スキャンを促進する、最小限の中断で安定的な培養環境を提供する 96 ピンのスクラッチ ツールを用いてスクラッチ試験提供一貫したスクラッチ傷より堅牢な実験を有効にして再現できます。96-well 版のフォーマットは、細胞または別の薬剤の処置数の増加いずれかの追加のオプションを提供します。さらに、細胞の形態変化とダイナミックな動きは、さらに分析の記録できます。

移行/浸潤アッセイは、いくつかの前提条件を簡単に適用できるように設計されています。コンフルエントの細胞膜は、ギャップに指示細胞運動を確保するため負傷する前に重要です。したがって強くお勧め播種密度、セルを最適化するために、6-18 h の間の時間枠は通常理想的です。表面と増殖率に取り付ける実験細胞の能力はこの期間に影響を与えます。長時間インキュベーション時間が強い細胞接着につながるし、細胞シートの除去のための曲がった両側セル面を生成します。ニッピバイオ マトリックス コーティングは以下の接着細胞線、待機時間を短縮すると参考になります。負傷する前に、細胞を飢えことができます。飢餓タイミング、タイミングは合流がほぼ 100% に達したら、スクラッチに似ており、飢餓メディアと期間が携帯型依存。細胞をトランスフェクションもできますが播種密度負傷する前に長期の時間を決定する遺伝子導入プロセスのインキュベーション時間を考慮しました。負傷は、96 ピン スクラッチ ツールを使用して、ほんの数秒で実現できます。ピンのサイズの定義は、正確な移行/侵略開始行と距離を保証します。重要なは、上部と下部のセクションは、生細胞画像ないスクラッチ傷のいずれかの端子が含まれるように整列、井戸でフルス クラッチを完了するまでになりません。ひっかき傷は、コンフルエントの細胞膜上に肉眼で容易に観察できるし、明視野顕微鏡下ですぐにチェックすることができます。井戸の洗浄をすぐに実行する必要があり、優しくの付着を避けるために細胞を剥がれ、二国間細胞の除去。1 つの洗浄が目的セル フリーゾーンをクリーンアップするための十分な場合、追加の洗浄の必要はありません。

移行文化メディア治療の有無を追加することによって確定することができ、浸潤アッセイのため考慮するいくつか追加手順が必要に対し、スキャンする準備ができています。細胞の移動とは異なり侵入細胞貫通 ECM は、生体内で細胞運動より良いをより密接に反映します。現在のプロトコルのプリンシパルは、ECM ゲルを使用して ECM に囲まれた環境を生成することです。ECM ゲルコーティングされた井戸と負傷の後細胞がシードされ、ECM ゲルが細胞やスクラッチ傷と重なっています。ECM ゲルを処理する場合、すべてのゲル化を避けるために寒さを維持することをお勧めします。偏在の ECM ゲル顕微鏡に着目したとき問題が発生します。ECM ゲルの粘性の性質のため、泡を生成することが可能だが、吸引によって泡を簡単に除去することができます 70% エタノールをスプレー ボトル。罰金が過度でないスプレーを生成するためには、スプレー ボトルと他の場所を指すわら内の余分な 70% エタノールをスプレーのキャップをはずし単に。上下プレートに水平距離で噴霧することにより微細な噴霧は 70% エタノールで気泡を除去するために十分です。

最初のスキャンを初期無細胞傷の領域をキャプチャするが、負傷した後できるだけすぐに開始する必要があります、これは分析のための基準を確立するために重要です。スキャン間隔より侵襲的な細胞より迅速な創閉鎖率を持っていると、セルの種類とは異なります。

この移行/侵入アプリケーションは比較的簡単ですと内蔵の解析モジュールを使用することにより細胞運動グラフ化できる速度論的メトリックが 3: 傷幅、傷の合流および傷の相対密度 (図 3)。すべての 3 つは、移行を評価するために使用できます。傷の幅は、二国間の細胞シートを比較的平行移動と μ m で平均距離をについて説明し、初期傷境界とは無関係です。傷合流および傷の相対的な密度、それどころか、計算で初期傷の境界を必要とし、創傷部と無傷の領域に対する細胞密度内合流点をそれぞれ記述。それは両側の細胞シートを参考傷領域を計算しますので、浸潤アッセイの傷の相対密度をお勧めします。読者は、彼らのニーズを最もよく表しているものを選択できます。

このスクラッチ傷の移行/浸潤能の測定が便利なすることができますが、96 ピンのスクラッチ ツール、指定されたプレートと典型的な結果は、このプロトコルでは提示を再現する統合移行/侵略モジュールと生細胞撮像素子が必要ですし、これらは高価なことができます。底が平らな multiwell の 96 ウェル プレートなど費用対効果の置換は使え、まともなスクラッチ傷 (データは示されていない) を生成することができます。ただし、スクラッチ ツールのパフォーマンスなかった良いとして指定されたプレートが使用されたといくつかの傷ないピックアップされる可能性がスキャン モード (図 8)、従って、初期創傷部を正しく定義することができます。さらに、スクラッチのツールは、分析、画像処理プログラム、または他のエンドポイントの可視化と解析ツールを使用して手動でひっかき傷を作成する使用できます。彼らは初期の傷を見つけることのより多くの柔軟性を提供し、したがって指定されたプレートに限定されません。その一方で、住セルイメージ投射の現在のプロトコルと組み合わせて移行/浸潤能の測定はより時間がかかり、エラーが減ります。これは、特に実験的一貫性と効率性の向上に役に立つかもしれない。

結論としては、この移行/浸潤能の測定は、簡単迅速かつ堅牢です。我々 のプロトコルから選択できます、他の人が自分のニーズと予算に基づいています。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% trypsin-EDTA solution (10x)	ThermoFisher Scientific	30028-02	Dilute to 2x in DPBS
Countess II FL Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000	Automated cell counter
Detergent 1 (Alconox)	Sigma-Aldrich	242985	0.5% working concentration
Detergent 2 (Virkon S)	VetProduct DIRECT		1% working concentration
Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no phenol-red	ThermoFisher Scientific	21063-045	Supplimented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 μg/ml insulin
ECM Gel (matrigel)	Sigma-Aldrich	E6909	Growth-factor reduced, phenol red free
Essen ImageLock 96-well plate, flat bottom	Essen	4379
EVE Counting slides	BioTools	EVS-50
Fetal bovine serum (FBS)	Bovogen Biologicals	SFBS-F-500ml
IncuCyte 96-well scratch wound cell invasion accessories	Essen	4444	Including CoolBox, 2x CoolSink
IncuCyte Cell migration kit	Essen	4493	Including the 96-well pin block, 2x wash boats and the software
IncuCyte ZOOM	Essen		Live cell analysis system
Insulin solution human	Sigma-Aldrich	19278-5ML
L-glutamine solution (100x)	ThermoFisher Scientific	25030-091
Tissue culture flask, 75 cm2 growth area	Greiner Bio-One	658175