Summary
目前的协议描述了一种实时研究癌症细胞迁移和入侵的综合方法, 为研究细胞迁移和形态提供了一个易于重现和省时的选择。
Abstract
癌细胞的移动性是开始转移的关键。因此, 对细胞运动和侵入能力的调查具有重要意义。迁移检测提供了2d 水平细胞运动的基本见解, 而入侵检测在生理上更相关, 在体内模拟体内癌细胞从原始部位脱落, 并通过细胞外基质入侵。当前协议为迁移和入侵检测提供了一个单一的工作流。与用于实时高清图像的集成自动化显微镜相机和内置分析模块相结合, 它为研究人员提供了一个省时、简单且可重复的实验选项。该协议还包括耗材的替换和供用户选择的替代分析方法。
Introduction
细胞迁移和侵袭是使人体正常功能的重要生物过程, 如伤口闭合、胎盘侵入子宫和乳腺形态发生1,2,3。人体对这些生物事件有精确而严格的控制;但是, 也有一些例外。恶性肿瘤, 例如, 能够逃脱这种保护, 表现出异常增殖, 并侵入邻近组织, 这被称为转移。转移是导致癌症相关死亡的主要原因4。
乳腺癌是妇女最常见的癌症, 也是全世界发达国家妇女癌症相关死亡的第二大原因5。乳腺癌起源于由一个或多个上皮细胞层组成的导管或小叶。在正常乳房中, 上皮细胞通过膜蛋白 (如 e-钙粘蛋白和整合素 6) 相互粘附并粘附到基底膜上。然而, 浸润性乳腺癌细胞已经失去了极性和细胞粘附, 并经典地进行上皮间充质转变 (emt), 并获得移动能力。外渗后, 这些细胞在细胞外基质 (ecm) 上移动, 进入血管或淋巴系统, 然后是静脉内和转移生长7。了解这种情况发生的机制具有重要意义, 因为转移是癌症相关死亡的最常见原因, 与癌细胞迁移/浸润密切相关。为了想象癌细胞的运动, 迁移和入侵检测是研究二维和三维细胞运动的理想模型。迁移直接评估细胞的运动, 而入侵则涉及与微环境的相互作用和降解生物屏障的能力。这两个过程并不完全独立, 因为移徙是入侵的要求。
研究移民和入侵的方法有几种。根据 kramer 等人的评论, 移情检测, 如伤口愈合, 围栏和微载体检测产生一个无细胞的区域, 使细胞进入, 评估区域的变化;然而, 经井和毛细血管检测是基于向吸引物8移动的细胞数量。例如, 对于入侵检测, 必须使用 ecm 凝胶或胶原蛋白建立 ecm 环境, 并可通过监测入侵区域、距离和细胞计数 (如转井检测、鸭排检测)来评估3d 运动。另一种类型的入侵检测是将浸润性细胞与非侵入性细胞结合起来, 并评估浸润细胞的行为 (例如球体检测)。上述方法有其优缺点, 在相似的工作流程中, 一种易于接近、易于重复、并在相似工作流程中结合迁移分析和入侵分析的方法是有利的。
该协议描述了使用活细胞成像仪测量细胞迁移和入侵的方法。它是安装在标准细胞培养孵化器中的实时细胞监测系统。它通过对细胞或荧光目标应用适当的掩模, 根据设定的扫描间隔和测量方法拍摄高清晰度图像。迁移/入侵检测模块包括使用96针划伤工具, 该工具适用于在96孔板的细胞单层上制造均匀的划痕伤。该机制基于体外伤口愈合检测, 监测塑料或涂层表面的2d 细胞运动。还可以评估划伤伤口内其他 ecm 的入侵或3d 运动。图 1显示了一个简短的工作流。
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Protocol
请注意:两个细胞系应该单独处理。如果未指定, 应将以下过程应用于单个单元格。
1. 优化伤前的细胞密度
- 在 t75 厘米2组织培养瓶中培养粘附细胞, 在37°c 与 5% co 2, 以10% 的胎牛血清 (fbs)、200 mm l-谷氨酰胺和2μgml 胰岛素为补充, 约80% 融合在酚类红自由的 dulbecco 的修饰鹰培养基 (dmem) 中 ,大多数癌细胞系的标准培养条件, 培养配方与细胞系有关)。
- 通过移液进入废容器来去除培养基。将预热0.1% 的色氨酸 edta 的移液2毫升, 以短暂冲洗细胞单层和移液器。再加入2毫升0.1% 的色氨酸 edta, 并将烧瓶置于标准孵育条件下, 在37°c 下5分钟。
- 轻轻点击烧瓶, 确保细胞脱离, 然后加入10毫升预热培养基, 停止蛋白溶解反应。
- 将细胞悬浮液转移到15毫升的离心管中, 在室温 (rt) 下以 200 x g的速度旋转5分钟。在不搅拌细胞颗粒的情况下小心去除上清液, 然后再使用10毫升预热培养基重新悬浮。
2. 使用自动单元格计数器 (或任何计数方法) 计数单元号
- 用800μl 的 1x dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 (dpbs) 在 1.5 ml 离心管中稀释200μl 的悬浮细胞悬浮液。
- 将60μm 的细胞计数传感器连接到电池计数器, 按住切换键并将尖端合并到电池悬架中。慢慢释放切换, 直到细胞悬架成功地被拉入传感器。细胞浓度显示在细胞中。
- 计算 10 ml 细胞悬浮液中的细胞编号。
3. 细胞电镀
- 在96孔板中的一系列电池密度 (40, 000-90, 000 细胞井) 的板细胞一式三份。
-
将板放入活孔成像仪中, 并将扫描每2小时安排一次, 时间为24小时。
- 在软件中, 单击 "计划任务列表中的扫描" 。在抽屉设置窗格中, 确定板的位置, 单击 "添加容器", 然后选择板类型。在 "扫描设置" 窗格中, 根据实验板设置选择或编辑扫描模式, 并将"扫描类型"设置为"标准"。
- 右键单击时间轴, 然后选择"设置间隔"。在24小时的时间安排下, 将 "添加扫描" 设置为 "每2小时"。单击 "应用"。
4. 确定迁移检测的最佳细胞播种密度
- 24小时后的圣 op 扫描, 将汇流处理分析工具应用于自动采集的 hd 相对比度图像, 并生成相对于时间的细胞增殖曲线.
- 确定3-6 代表性图像, 并将其放置在新的图像集合中。
- 将正确的掩码确定为"处理定义"。
- 启动分析作业。
- 根据融合时间确定优化的细胞密度 (约100% 融合在6-18小时内, 具体取决于迁移试验开始的时间)。
请注意:细胞生长到融合所需的时间取决于播种稀释。
5. 第1天和第2天: 移民和入侵检测的准备
-
第1天, 涂上印板进行入侵检测。
注: ecm 凝胶应始终在冰上处理, 并在冰箱中放置一夜的提示。- 用冰凉培养基稀释 ecm 凝胶, 使其达到 100μgml, 并在指定的井中加入50μl 的稀释 ecm 凝胶。
- 将板材放置在标准的孵育条件下过夜。
- 第2天, 轻轻吸气多余的培养基。在下午晚些时候, 在第1-3 节之后, 将细胞密度优化为 2个96孔板, 用于迁移分析 (未涂布) 和入侵分析 (涂层) (在当前协议中, 优化了播种密度zr75-1 和 mda-mb-231 分别为 90, 000/井和 50, 000/井)。
- 在标准孵育条件下放置板材过夜。
6. 第3天: 伤口划伤
- 在将划痕工具和2艘用70% 乙醇清洗后, 再将其放入生物安全柜。分别用45毫升的无菌 (蒸压) 蒸馏水和70% 的乙醇填充1号和2号洗涤船。
- 对于灭菌, 请将划痕工具销块 (顶部) 放置在1号和2号洗涤船上, 每次5分钟。
-
从迁移检测板开始。
- 将含有细胞的板从孵化器中取出, 确保没有井是干燥的, 以避免划伤工具的损坏。取下板盖, 插入划痕工具的基板支架, 并通过引导下角小心地将顶部放置在基部。按住黑色拉杆, 同时小心地提起引脚块。每口井的缝隙通常可以通过肉眼和显微镜才能看到。
- 快速将针脚浸泡在水中;如果防伤检测板的设置相同, 这足以在划伤检测板之前清洁划痕工具。否则, 重复灭菌步骤与无菌蒸馏水, 然后70% 乙醇每次5分钟。
- 用预热培养基清洗板1或 2次, 以避免分离的细胞或细胞片重新连接到油井上。
- 在指定的井中加入100μl 新鲜的温介质, 无论是否经过处理。
-
入侵检测的其他步骤。
- 将入侵检测板置于 4°c 5分钟, 以平衡并小心吸气冷介质。
- 用冰凉培养基稀释 ecm 凝胶至 5 mg/ml, 将50μl 稀释的 ecm 凝胶加入指定的井中, 并在标准培养下放置30分钟。
- 添加100μl 的加热介质, 无论是否有测试化合物。
- 将板材放入活孔成像仪中, 使其平衡 5分钟. 选择容器类型作为成像板。将扫描类型设置为划痕伤口,根据实验板设置 (1 图像/井/井和宽模式) 选择或编辑扫描模式, 并计划24小时重复扫描每 1-2小时 72小时, 直到伤口愈合。
- 要清洁划痕工具, 请将顶部销块放入以下每个溶液中 (洗涤船中的45毫升) 5分钟: 0.5% 的洗涤剂 1 (见材料表), 1% 的洗涤剂 2 (见材料表), 无菌蒸馏水和70% 乙醇。将划痕工具放回其基板上, 并存储在无尘环境中。
7. 数据分析
- 通过选择抽屉设置上的实验板并单击 "拆卸容器", 在所有伤口愈合后停止扫描指定的板。
- 收集3-6 个代表性的图像, 跨越一系列的声音百分比, 包括伤口完成后的图像, 伤口关闭10% 和50%。
- 若要确定正确的处理定义, 请使用分段调整、清理和筛选器应用适当的划痕伤口蒙版和混合面膜。使用预览当前全部查看遮罩的准确性。
- 启动分析作业。
- 数据可以在软件中进行分析, 也可以导出以进行进一步分析。该软件提供的三个指标可用于评估 hd 相位图像: 伤口宽度 (μm)、伤口融合 (%) 和相对伤口密度 (%)。比较将在下一节中讨论。
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Representative Results
这种迁移/入侵检测是基于伤口愈合试验, 该试验评估了细胞进入96针划伤工具创建的无细胞区域的速度。迁移和入侵检测之间的区别在于, 迁移检测测量在组织培养处理的塑料表面上移动的细胞, 以及在 ecm 凝胶上移动的入侵措施细胞。
划痕工具的设计是为了在指定的盘子里制造一致的划痕伤细胞成像仪的设计是为了拍摄实时高分辨率图像 , 中间有划痕伤口。本协议中使用的两个乳腺癌细胞系分别是 zr75-1 和 mda-mb-231, 分别分为 luminal b 和三重阴性亚型 9.96针划伤工具产生的划伤伤口通常在70-900μm 之间, 但可能因细胞系而异 (图 2)。
对于迁移分析, 提供了三个指标: (1) 伤口宽度 (μm) 是伤口旁边细胞片之间的平均距离 (图 3)。(2) 伤口汇合处 (%) 是伤人区域内的汇合处 (图 3)。理想的初始伤口融合应接近0%。(3) 相对伤口密度 (%) 是一种背景下减去的算法 [相对伤口密度 = 100 * (w)-w (0))/(c) (t)-w (0)), t = 在时间 t, w = 伤口区域密度, c = 细胞区域的密度], 测量伤口区域相对于细胞区域密度的密度。
可以根据需要实现三个合格的指标。相对伤口密度和伤口融合意味着细胞占据划伤伤口区域的速度, 它们几乎在两个细胞系中重叠。但这两个细胞系表现出非常不同的伤口愈合能力, 在 mda-mb-231 细胞的伤口愈合过程完成 (约 50小时) 时, zr75-1 细胞的伤口覆盖率约为 50% (以上两个指标), 剩余伤口宽度超过 400μm,表示 zr75-1 单元格的迁移能力较低 (图 4)。
两种细胞类型的迁移行为不同, 可以根据记录的图像进行比较。在迁移开始时在迁移前部的 mda-mb-231 细胞中观察到清脂 (层压突起), 这是细胞骨架重排的典型标志, 引导细胞向无细胞区移动 10 ( 图 5)).zr75-1 细胞在同一时间点没有细胞迁移的迹象 (图 5)。
公制相对伤口密度是制造商推荐的细胞入侵, 因为它是一个三维分析, 并基于融合分析是不适用的。在50小时内, mda-mb-231 细胞的相对创面密度饱和 (100%), 而 zr75-1 细胞的相对创面密度没有随时间变化, 表明 mda-mb-231 细胞的高侵入性表型和 zr75-1 细胞的非侵入性 (100%)。图 6)。
mda-mb-231 细胞在通过 ecm 凝胶入侵时也表现不同 (图 7)。与在迁移前有泡泡的细胞相比, 浸润细胞表现出拉长的形态和领先的突起。
图 1当前协议中的迁移和入侵分析工作流.请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 划痕工具在乳腺癌细胞系 zr75-1 和 mda-mb-231 (上板) 上的性能, 测量了初始伤口宽度和初始伤口融合 (下板).请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 用 hd 相位对比图像和 mda-mb-231 中的面罩混合模式进行迁移分析.蓝色, 划伤;黄色, 细胞周围的划伤伤口;粉红色, 细胞进入划伤伤口在24小时后的抓伤。刻度条 = 300μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 三种算法 (乳腺癌细胞系 zr75-1 (左) 和 mda-mb-231 (右) 的伤口宽度、相对伤口密度和伤口融合) 的比较.所有实验都代表了三个独立实验的平均值, 即 s. d. 刻度柱 = 300μm. 请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 5: 在划伤4小时后, 迁移 zr75-1 和 mda-mb-231 细胞.箭头, 在迁徙的前面的板层。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: 使用乳腺癌细胞系 zr75-1 (左) 和 mda-mb-231 (右) 的公制相对伤口密度 (%) 对入侵进行定量.所有的实验都代表了三个独立实验的平均值, 即 to. 请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 7: mda-mb-231 细胞在迁移 (左) 和侵袭 (右) 中的不同细胞特征.请点击这里查看此图的较大版本.
图 8: 一个划伤伤口的例子, 不能由集成迁移模块从96孔板进行分析.请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
迁移和入侵是评估癌细胞流动性的重要参数。通过使用96针划伤工具, 可以同时在2d 和3d 中进行伤口愈合检测。除了促进自动扫描, 提供稳定的细胞培养环境, 最大限度地中断, 使用96针划伤工具进行划痕检测提供了一致的划痕伤口, 使实验更加强大和重现。96孔板的格式提供了增加细胞系数量或不同药物治疗的额外选择。此外, 还可以记录细胞形态变化和动态运动, 以便进一步分析。
迁移/入侵检测的设计是为了便于应用, 有几个先决条件。在受伤之前, 融合细胞单层是至关重要的, 以确保向缝隙方向移动细胞。因此, 强烈建议优化细胞播种密度, 6-18小时之间的时间框架通常是理想的。附着在表面的实验细胞的能力和增殖率将影响这一时间框架。长时间的孵育可能会导致强大的细胞粘附, 并产生弯曲的双侧细胞战线, 由于去除细胞片。生物光层涂层将有助于减少粘附细胞系, 减少等待时间。细胞在受伤前可能会挨饿。饥饿时间类似于划痕时间, 即融合达到近 100%, 饥饿介质和持续时间与细胞类型有关。细胞也可以转染, 但种子密度必须在伤人之前长时间确定, 同时考虑转染过程的潜伏期。使用96针划伤工具可以在几秒钟内实现焊接。确定尺寸的引脚保证了精确的迁移/入侵起始线和距离。重要的是, 顶部和底部部分必须对齐, 以完成整个井的完整划痕, 这样活细胞图像就不包括划痕伤口的任何一个终端。划伤伤口可以很容易地通过肉眼在融合细胞单层上观察到, 并可以在明亮的场显微镜下快速检查。应立即轻轻清洗水井, 以避免被移出的细胞重新附着和切除双侧细胞。如果一个清洗足以清理所需的无细胞区, 就不需要额外的清洗。
迁移检测可以通过添加有或没有治疗的培养基来最终确定, 并准备进行扫描, 而在入侵检测中还需要考虑到一些额外的步骤。与细胞迁移不同, 入侵细胞通过 ecm 渗透, ecm 更紧密地反映了体内细胞的运动。当前协议的原理是使用 ecm 凝胶生成 ecm 包围环境。细胞在 ecm 凝胶涂层井上播种, 伤后, ecm 凝胶被分层在细胞和划伤伤口上。在处理 ecm 凝胶时, 最好保持所有的冷, 以避免凝胶化。在聚焦显微镜时, 分布不均的 ecm 凝胶可能会导致问题。由于 ecm 凝胶的粘性, 可以产生气泡, 但通过喷雾瓶吸入70% 的乙醇可以很容易地去除气泡。要产生精细但不过度的喷雾, 只需拧开喷雾瓶的瓶盖, 然后在指向其他地方的秸秆中喷洒过多的70% 乙醇。通过在板上方和水平处的距离喷洒, 精细的70% 乙醇喷雾足以消除气泡。
第一次扫描应在受伤后尽快开始, 以捕获最初的无细胞伤口区域, 这对于建立分析标准非常重要。扫描间隔取决于细胞类型, 因为更多的侵入性细胞系具有更快的伤口闭合率。
这种迁移入侵应用相对简单, 通过使用内置的分析模块, 可以用3个指标动态地绘制细胞运动图: 伤口宽度、伤口融合和相对伤口密度 (图 3)。这三种方法都可用于评估迁移。伤口宽度描述了双侧细胞片移动相对平行时的平均距离 (μm), 并且与初始伤口边界无关。相反, 在计算中, 伤口汇合处和相对伤口密度要求初始伤口边界, 并分别描述伤口区域内的融合和相对于未受伤区域的细胞密度。对于入侵试验, 建议使用相对伤口密度, 因为它参照双侧细胞片计算伤口面积。读者可以选择一个最能代表他们需求的。
这种刮伤迁移入侵检测方法很方便, 但它需要96针划伤工具、指定板和带有集成迁移/入侵模块的活细胞成像仪来再现本协议中提出的典型结果,这些可能是昂贵的。成本效益高的替代, 如一个平坦的底部96井多井板可以使用, 并可以产生体面的划伤伤口 (数据没有显示)。但是, 划痕工具的性能不如使用指定的板, 并且扫描模式无法拾取某些伤口 (图 8), 因此无法正确定义初始伤口区域。此外, 划痕工具还可用于创建划痕伤口, 可以手动进行分析, 也可以通过图像处理程序进行分析, 也可以使用其他端点可视化和分析工具。它们提供了更大的灵活性来定位最初的伤口, 因此不限于指定的板材。另一方面, 迁移/入侵检测结合活细胞成像在当前协议中是更少的耗时和较少的错误易发性。这对于实验一致性和提高效率特别有用。
总之, 该迁移-入侵试验快速、简便、鲁棒性强。用户可以根据自己的需要和预算从我们的协议和其他协议中进行选择。
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Disclosures
提交人声明, 他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
我们要感谢布隆菲尔德集团基金会通过亨特医学研究所 (hmri 13-02) 提供的资金支持。x. z 通过纽卡斯尔大学和 hcra 生物标志物旗舰博士奖学金获得 apa 奖学金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | Dilute to 2x in DPBS |
| Countess II FL Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Detergent 1 (Alconox) | Sigma-Aldrich | 242985 | 0.5% working concentration |
| Detergent 2 (Virkon S) | VetProduct DIRECT | 1% working concentration | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplimented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 μg/ml insulin |
| ECM Gel (matrigel) | Sigma-Aldrich | E6909 | Growth-factor reduced, phenol red free |
| Essen ImageLock 96-well plate, flat bottom | Essen | 4379 | |
| EVE Counting slides | BioTools | EVS-50 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| IncuCyte 96-well scratch wound cell invasion accessories | Essen | 4444 | Including CoolBox, 2x CoolSink |
| IncuCyte Cell migration kit | Essen | 4493 | Including the 96-well pin block, 2x wash boats and the software |
| IncuCyte ZOOM | Essen | Live cell analysis system | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | 19278-5ML | |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-091 | |
| Tissue culture flask, 75 cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 |
References
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