Summary
نحن نقدم بروتوكولا لفحص ألوان من النشاط synthase سيترات للقياس الكمي من كتله الميتوكوندريا سليمه في الانسجه المتجانسة .
Abstract
الميتوكوندريا تلعب الأدوار الأكثر بروزا في الأيض الخلوية عن طريق إنتاج ATP من خلال فوسفولات الاكسده وتنظيم مجموعه متنوعة من العمليات الفسيولوجية. خلل الميتوكوندريا هو السبب الرئيسي لعدد من الامراض الايضيه والعصبية. الميتوكوندريا سليمه هي حاسمه لأداءها السليم. يتم تعريب سيترات الانزيم synthase في مصفوفة الميتوكوندريا التالي يمكن استخدامها كعلامة انزيم الكمية من كتله الميتوكوندريا سليمه. النظر إلى ان العديد من الجزيئات والمسارات التي لها وظائف هامه في الميتوكوندريا يتم الحفاظ عليها بشكل كبير بين البشر و دروفيسيلا، وان هناك مجموعه من الاداات الجينية القوية متوفرة في دروفيا، فان دروفيسيلا تعمل كنظام نموذجي جيد لدراسة وظيفة الميتوكوندريا. هنا ، ونحن نقدم بروتوكول لقياس سريع وبسيط من النشاط synthase سيترات في المتجانسات الانسجه من الذباب الكبار دون عزل الميتوكوندريا. هذا البروتوكول هو أيضا مناسبه لقياس النشاط synthase سيترات في اليرقات, الخلايا المستزرعة, وانسجه الثدييات.
Introduction
الميتوكوندريا هي المعروفة باسم العضوية المنتجة للطاقة في معظم الكائنات الحية النواة ، والتي تنتج العملة الطاقة ، ATP ، من خلال دوره حمض تريكاربوكسيليك (اي ، دوره كريبس) والاكسده فوسفولات. ووجدت الميتوكوندريا أيضا للعب ادوار هامه في الكثير من العمليات الفسيولوجية الأخرى, مثل تنظيم المبرمج1, Ca2 + التوازن2,3, أنواع الاكسده التفاعلية (ROS) جيل4, والشبكية إندوبلازمي (ER)-استجابه الإجهاد5. الخلل الميتوكوندريا يمكن ان تؤثر علي اي عضو في الجسم في اي عمر وهو السبب الرئيسي لاستقلاب, الشيخوخة المرتبطة6, وامراض الأعصاب7. الميتوكوندريا سليمه ذات الصلة ميكانيكيه إلى وظيفة الميتوكوندريا. التالي, التحديد الكمي السليم للكتلة الميتوكوندريا سليمه مهم جدا لتقييم وظيفة الميتوكوندريا8. Synthase سيترات, انزيم الحد من معدل في الخطوة الاولي من دوره حمض تريكاربوكسيليك9, مترجمه في مصفوفة الميتوكوندريا داخل الخلايا النواة, التالي يمكن استخدامها كعلامة كميه لوجود كتله الميتوكوندريا سليمه9,10. سيترات synthase النشاط يمكن أيضا ان تستخدم كعامل تطبيع للبروتينات الميتوكوندريا سليمه11,12.
ذبابه الفاكهة ، دروكوفيلا ميلغاستر، هو نظام نموذجي ممتاز لدراسة وظيفة الميتوكوندريا ، كما العديد من الجزيئات والمسارات التي تلعب دورا محوريا في الميتوكوندريا يتم الحفاظ عليها تطوريا من دروفيبيلا إلى البشر13،14،15. هنا ، نقدم بروتوكولا لطريقه سريعة وبسيطه لقياس النشاط synthase سيترات بواسطة فحص الملونة في الانسجه دروفيا المتجانسات16 في شكل لوحه جيد 96. في اختبار النشاط سينثاز سيترات ، synthase سيترات في الانسجه المتجانسة في دروفيسيلا يحفز رد فعل اوكسالوخلات مع انزيم اسيتيل A (اسيتيل coa) لتشكيل سيترات COA-SH وH +. CoA-SH يتفاعل لاحقا مع 5 ، 5 '-dithiobis-(2-حمض نيتروبنزويك) (DTNB) لتوليد منتج ملون ، 2-نيترو-5-ثيوبنزواتي (TNB) ، والتي يمكن قياسها بسهوله فوتومتر في 412 nm. يمكن ان ينعكس نشاط synthase سيترات بمعدل إنتاج ألوان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. القياس اللوني سيترات Synthase النشاط المقايسة ل d. الميلاغوجاستر16
- جمع عشره الذباب الكبار لكل عينه. جمع علي الأقل عينات ثلاثية لكل النمط الجيني.
- اعداد 500 μL من الجليد الباردة استخراج العازلة التي تحتوي علي 20 مم HEPES (pH = 7.2) ، 1 مم أدتا ، و 0.1 ٪ تريتون X-100 في أنبوب اختبار 1.5 mL لكل عينه.
- تخدير الكبار الذباب مع CO2 علي وساده التخدير وعزل الانسجه المطلوبة. لعزل الصدر ذبابه الكبار ، علي سبيل المثال ، إصلاح الصدر ذبابه من قبل زوج من الملقط ، ومن ثم عزل ذبابه بطون عن طريق قطع علي طول الحدود للصدر والبطن باستخدام زوج من المقص. جمع الصدر ذبابه لاختبار النشاط سيترات العضلات synthase.
ملاحظه: تحديد الوزن الطازج من الانسجه في هذه الخطوة إذا استخدامه لتطبيع سيترات synthase النشاط. - نقل 10 الكبار يطير الصدر إلى 100 μL من الجليد الباردة استخراج العازلة علي الفور والتجانس مع مدقه علي الجليد. للحفاظ علي عينات الجليد الباردة ، والتجانس عينات ل 5-10 s علي الجليد ، ثم يكون عينات الجلوس علي الجليد لمده 5 ليالي ، وتكرار حتى جميع الانسجه في الأنبوب متجانسة تماما.
ملاحظه: الشريط الأنبوب ، والتحقق من تجانس للتاكد من انه لا توجد جلطات في المتجانسات وان الانسجه في الأنبوب متجانسة تماما. وينبغي اجراء جميع العلاجات عينه علي الجليد. - خذ 10 μL من كل عينه متجانسة في أنبوب جديد لقياس محتوي البروتين. الحفاظ علي عينات لقياس البروتين علي الجليد.
ملاحظه: يمكن تجميد عينات البروتين وتخزينها في-80 درجه مئوية للتحليل في وقت لاحق. تركيزات البروتين بمثابه معلمه داخلية لتطبيع الانشطه synthase سيترات. - أضافه 400 μL من الجليد الباردة استخراج العازلة لكل عينه المتبقية لجعل حجم الكلي من 500 μL. اخلط جيدا عن طريق السحب بلطف صعودا وهبوطا 5x علي الأقل ، وتجنب تشكيل فقاعه. لكل رد فعل, أضافه 1 μl من الخلايا المخففة محلله إلى 150 μl من حل رد فعل أعدت حديثا (20 مم تريس-HCl (pH 8.0), 0.1 mm dtnb, 0.3 مم اسيتيل CoA, 1 مم حمض اوكسالواستيك). تخلط جيدا وعلي الفور عن طريق الأنابيب بلطف ، وتجنب تشكيل فقاعه. قياس الامتصاص في 412 nm كل 10-30 s ل 4 دقيقه عند 25 درجه مئوية باستخدام قارئ لوحه قادره علي قياس الامتصاص في 412 nm علي فترات الحد الأدنى من 10 s.
ملاحظه: تغيير غيض قبل الأنابيب كاشف مختلفه وتجنب تشكيل فقاعات في الآبار. خلط غير مكتملة من الكواشف قد يسبب اختلافات في القياسات. وينبغي ان يتم فحص النشاط سينثاز سيترات في درجه حرارة الغرفة مباشره بعد جمع العينات ، كما يتم استخدام هذا الفحص لقياس كتله الميتوكوندريا سليمه. يجب اعداد المخزن المؤقت للتفاعل مباشره قبل الاستخدام ويجب عدم تخزينه. - بيانات الرسم كامتصاص الكثافة البصرية (OD) (abs) (المحور ص) مقابل الوقت (بالدقائق) (المحور س). ثم يحسب الميل للجزء الخطي من المنحني ، حيث معدل التفاعل هو
تقسم القيمة حسب تركيز البروتين العينة لتطبيع نشاط synthase سيترات. يتم احتساب نشاط synthase سيترات كما
ملاحظه: يمكن قياس تركيز البروتين العينة بواسطة مجموعه فحص تركيز البروتين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويقدم الشكل 1 مثالا علي المنحنيات الحركية لامتصاص التردد الOD عند 412 نانومتر بمرور الوقت الذي تم الحصول عليه باستخدام الفحص اللوني لنشاط السيترات سيترات لقياس انسجه الصدر الصدرية المتجانسة لمختلف الأنماط الجينية. ومن المعروف جيدا ان PGC-1α هو منظم رئيسي لنشاه الميتوكوندريا الحيوية. يتم الحفاظ علي PGC-1α من الناحية الوظيفية بين دروفيا والبشر. دروفيا RNF34 (dRNF34) هو E3 اوبيكييتين ليتاز لل دروفيبيلا pgc-1Α ، dpgc-1 ، ويعزز تدهور البروتين dpgc-117. وقد أظهرت المجهر الكترون الإرسال والحمض النووي الميتوكوندريا qPCR ان ضربه قاضيه لdRNF34 في العضلات دروفيا يزيد من محتوي الميتوكوندريا ، والتي يتم قمعها بضربه قاضيه من dpgc-117. واستنادا إلى هذه النتائج افترضنا ان الضربة القاضية لdRNF34 في العضلات دروفيسيلا سوف تزيد من النشاط سينثاز سترات الميتوكوندريا ، والتي ينبغي عكسها بضربه قاضيه من dpgc-1. في الواقع ، باستخدام المقايسة اللونية من النشاط synthase سيترات الموصوفة هنا ، وجدنا ان ضربه قاضيه من dRNF34 في العضلات دروفيا زيادة النشاط سينثاز سيترات الميتوكوندريا ، والتي تم عكسها بضربه قاضيه من dpgc-1. علي وجه التحديد باستخدام الطريقة الموصوفة هنا ، تم إنشاء معدل الانزيميه الخطية الاوليه لكل فحص (الشكل 1). وترد خطوط الاتجاه مع صيغها ومعامل التحديد (R2) في الرسم البياني (الشكل 1). المنحدرات من خطوط الاتجاه تمثل معدلات التفاعل القصوى ، والتي هي مكافئه لأنشطه synthase سيترات القصوى من الأنماط الجينية المختلفة. المنحدرات لمختلف الأنماط الجينية مختلفه (الشكل 1). معامل التحديد أقرب إلى 1 ؛ الصيغ من خطوط الاتجاه هي أكثر موثوقيه. وقد تم حساب تركيز البروتين الذي تمت تسويته بالشكل الأقصى لأنشطه synthase من الأنماط الجينية المختلفة من البيانات رقم 1 (الشكل 2). وزاد نشاط synthase سيترات القصوى ذبابه الثور مع العضلات الخاصة dRNF34 ضربه قاضيه ، والتي انعكست من قبل العضلات المحددة dPGC-1 الضربة القاضية (الشكل 2).
الشكل 1: مثال علي المنحنيات الحركية لمقايسة القياس اللوني لنشاط سينثاز سيترات. الصدر يطير الكبار الخالطون (ا) 24B-Gal4 > + (ب) 24b-GAL4 > dRNF34RNAi (2) ، و (ج) 24B-Gal4 > dRNF34RNAi (2) ، واخضع dpgc-1rnai للفحص اللوني للنشاط synthase سيترات. تمثل المحاور الافقيه أوقات رد الفعل ، وتمثل المحاور الراسية الفوط OD في 412 نانومتر. تم إنشاء معدل انزيمي خطي لكل نمط جيني. تم رسم خطوط الاتجاه ويتم عرض الصيغ و R2 من خطوط الاتجاه في الرسم البياني. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الانشطه synthase سيترات القصوى محسوبة من المنحنيات الحركية وتطبيعها بتركيز البروتين. وزاد نشاط synthase سيترات القصوى ذبابه الثور مع العضلات الخاصة dRNF34 ضربه قاضيه ، والتي انعكست من قبل العضلات المحددة dPGC-1 بالضربة القاضية. ويتم تمثيل جميع البيانات كما يعني ± SEM (*p < 0.01 ، بواسطة اختبار ANOVA ، واختبار tukey لمقارنات متعددة ، ن = 3 ، 10 صدور لكل نسخ متماثل). وقد تم تعديل هذا الرقم من ويي وآخرون17. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يجب ان تاخذ الدراسات الايضيه التي تستخدم دروفيسيلا كنموذج في الاعتبار الخلفية الوراثية ، والنظام الغذائي ، وصيانة المخزون من الذباب18. لتجنب اثار الخلفيات الوراثية المختلفة علي قياس النشاط synthase سيترات ، يجب ان تكون السلالات المختلفة من دروكوفيلا إلى سلاله السيطرة لمده 10 أجيال. الخلفية الجينية لجميع سلالات دروفيا المستخدمة في تجاربنا هي w1118، لذلك استخدمنا w1118 كعنصر تحكم. عموما ، ونحن نعتقد w1118 هو السيطرة الجيدة ، كما هو الخلفية الوراثية لمعظم سلالات دروفيسيلا وأسهل بكثير لتزاوج تبادلي من كانتون-S. يجب ان يكون النظام الغذائي وصيانة المخزون بالبالضبط نفس الشيء بالنسبة لجميع المجموعات التجريبية. في تجاربنا ، وعاده ما يتم الحفاظ علي الذباب في 25 درجه مئوية و 50-60 ٪ الرطوبة النسبية. وينبغي أيضا اجراء خطوه اعداد العينة بحذر. وينبغي ان تكون الصلبان التي تم اعدادها للتجربة في نطاق مماثل ومناسب. لأقامه صليب ، يتم الاحتفاظ 3-4 الإناث الذباب الكبار البكر مع 2-3 الذباب الكبار الذكور في قطرها 4 سم ، 15 سم قارورة عاليه الموردة مع المواد الغذائية الطازجة. يمكن ان تختلف وصفه الطعام (علي سبيل المثال ، حمية عاليه الدهون ، والنظام الغذائي العادي ، وارتفاع السكر النظام الغذائي) ، اعتمادا علي التصميم التجريبي. بعد يومين ، يتم نقل الجيل الأبوي من الذباب إلى قنينة جديده مع الطعام الطازج. وتشمل رعاية اليرقات التي فقست في الطعام أضافه بعض الماء إذا لزم الأمر. عندما يبدا الجيل الصناعي من الذباب في اليفقس ، يتم تقليب القنينات كل 24 ساعة ، ويتم جمع الذباب من النمط الجيني المطلوب في قارورة جديده للتجربة ، ويتم وضع علامة علي تاريخ يفقس الذباب علي كل قنينة. ويتم الاحتفاظ بحوالي 20-30 من الذباب من نفس النمط الجيني والجنس والعمر في قارورة مع الطعام. يجب نقل الذباب التي تم جمعها إلى قوارير جديده مع الطعام المناسب كل يومين حتى يتم تنفيذ التجارب. لتجنب تاثير العمر علي النشاط synthase سيترات ، يجب ان يفقس الذباب من المجموعات المختلفة التي تم اختبارها في نفس اليوم. الاضافه إلى ذلك ، ينبغي ان يقابل جنس الذباب. عاده ما يكون حجم الجسم من الإناث أكبر من الذكور ، التالي فان تركيز البروتين من الهيئات الانثويه اعلي من الهيئات الذكور.
ويمكن أيضا ان تستخدم لقياس النشاط سيترات synthase سترات النشاط synthase سيترات في اليرقات. وتحقيقا لهذه الغاية ، يمكن ان تتكون كل عينه من خمس يرقات instar الثالثة المتجولة. ويمكن تمييز يرقات الinstar الثالثة بحلقه برتقالية داكنه في طرف الديدان الخلفية ، والتي تفتقر إلى اليرقات الثانية أو ضعيفه الوجود فيها.
في الخطوة 6 ، قد تختلف نسب التخفيف من العينات لعينات مختلفه. بالنسبة للعينات التي يتم قياسها أولا ، يجب ان تحاول عده نسب التخفيف لتحديد نسبه التخفيف المناسبة لإنشاء معدل الانزيميه الخطية في الفحص. يختلف الوقت الإجمالي لقياس النشاط الانزيم الأقصى الذي يؤسس معدل الانزيميه الخطية في الفحص اعتمادا علي نسبه الانزيم-الركيزة. إذا كانت الركيزة مفرطة الجرعة بالمقارنة مع الانزيم ، فان نشاط الانزيم أو معدل التفاعل يصل إلى الحد الأقصى ، والذي يسمح بإنشاء معدل انزيمي خطي في الفحص. كما يحدث رد فعل علي ، وكميه من الركيزة تنخفض ، ونشاط الانزيم أو معدل التفاعل يبطئ. إذا كان لا يمكن رسم معدل الانزيميه الخطية ، مما يعني ان الركيزة ليست مداوي بالمقارنة مع الانزيم ، وزيادة تمييع الانسجه المتجانسة مع حل رد الفعل أو تقصير الفاصل الزمني لقراءات 412 nm حتى المؤامرة معدل الانزيميه الخطي هو المنشاه. يجب ان يكون الوقت الفاصل الزمني لقراءه 412 nm لا يزيد عن 30 ثانيه. وتستند مده القراءة 412 nm علي معدل التفاعل والوقت. يجب ان تتوقف قراءه الطيف الطيفي عند عدم ملاحظه تغيير اللون لجميع ردود الفعل.
يمكن تطبيع النشاط سينثاز سيترات بتركيز البروتين عينه ، عينه الوزن الطازج ، أو رقم الخلية. يمكن قياس الوزن الطازج العينة قبل المجانسة كما في الخطوة 3. ويمكن أيضا استخدام رقم الخلية لتطبيع محلله من الخلايا المستزرعة ، ولكن يجب ان تكون الخلايا تماما lysed. محتوي الحمض النووي ليس خيارا جيدا للرقابة الداخلية ، كما اجراء استخراج الحمض النووي قد إدخال الاختلافات في العينات ، وخاصه بالنسبة للعينات التي تحتوي علي كميه صغيره من الحمض النووي.
إذا لم يتم ملاحظه تغيير لون بعد رد الفعل ، يمكن اتخاذ عده خطوات مختلفه لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها:
1. تحقق من خطوه اعداد عينه ، والتاكد من التعامل مع العينات بشكل صحيح ، والحفاظ علي عينات علي الجليد ، وتجنب عده دورات تجميد الذوبان.
2. في محاولة لاستخدام تركيز البروتين اعلي ، لان بعض العينات قد يكون اقل بكثير من مستويات التعبير من synthase سيترات التي لا يمكن الكشف عنها من قبل الفحص النشاط سينثاز سيترات.
3. لاحظ ان بعض مجموعات المتاحة تجاريا لفحص النشاط السيترات سيترات لا يمكن استخدامها ل دروفيسيلا، لان هذه المجموعات تحديد النشاط سينثاز سترات الميتوكوندريا استنادا إلى المناعية من سينثاز سيترات الثدييات والأجسام المضادة synthase سيترات الثدييات قد لا تعترف سيترات دروفيميلا سترات.
المثل ، إذا كان هناك اختلاف بين العينات:
1. تاكد من عدم وجود فقاعات في الآبار.
2. فحص ما إذا كان هذا بسبب تقنيه الأنابيب الرديءه.
علي النقيض من قياس النشاط synthase سيترات بواسطة فحص ألوان في الميتوكوندريا المنقية ، والذي يتطلب ما يقرب من 200 الذباب لتنقيه الميتوكوندريا من كل النمط الجيني19، ونحن نقدم بروتوكول لفحص سريع وبسيط لقياس النشاط سينثاز سيترات بواسطة طريقه التلوين في الانسجه المتجانسة أو في الخلية كامله مقتطفات16. لكل عينه ، هناك حاجه فقط عشره الذباب فقست في نفس اليوم ؛ للعينات ثلاثية النسخ من كل النمط الجيني ، هناك حاجه إلى 30 الذباب. وينطبق البروتوكول الموصوف ليس فقط علي دروفيا بل أيضا علي النظم الأخرى ، مثل الخلايا المستزرعة وانسجه الثدييات.
الاضافه إلى فحص النشاط سيترات synthase ، يمكن استخدام أساليب أخرى لقياس كتله الميتوكوندريا. بالمقارنة مع غيرها من الطرق الكمية المستخدمة عاده من الميتوكوندريا ، مثل قياس محتوي الحمض النووي الميتوكوندريا من قبل qPCR والكمية من البروتينات الميتوكوندريا بواسطة التنقيط الغربية ، والتي تكشف عن جميع الميتوكوندريا بغض النظر عن وظيفتها ، يتم استخدام الفحص synthase سيترات لقياس وجود كتله الميتوكوندريا سليمه. وخلافا لفحص التنفس الميتوكوندريا ، والتي تحتاج إلى تنقيه الميتوكوندريا ومعدات الفحص المتخصصة16، واختبار النشاط سيترات synthase يسمح للباحثين لتنفيذ القياسات السريعة بواسطة قياس الطيف مع اعداد عينه بسيطه ، مثل استخراج الخلايا الكاملة أو المتجانسة الانسجه ، وليس هناك حاجه للعزل الميتوكوندريا. التالي ، فان اختبار النشاط synthase سيترات هو مقايسة سريعة واقتصاديه للقياس الكمي من كتله الميتوكوندريا سليمه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن أصحاب البلاغ عن اي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وكان هذا العمل مدعوما بالمنح المقدمة من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31401013 و 31471010) ، ولجنه العلوم والتكنولوجيا التابعة لبلديه شنغهاي ، وبرنامج شنغهاي بوجيانغ (14PJ1405900) ، ومؤسسه العلوم الطبيعية التابعة شنغهاي (19ZR1446400).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Pellet pestle | Sangon | F619072 | |
| Pellet pestle motor | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Plate reader | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Assay kit | Beyotime | P0010S | |
| Scissors | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
References
- Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans. Cell. 157 (4), 897-909 (2014).
- Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (4), 1453-1466 (2015).
- Oxenoid, K., et al.
- Hekimi, S., Wang, Y., Noe, A. Mitochondrial ROS and the Effectors of the Intrinsic Apoptotic Pathway in Aging Cells: The Discerning Killers! Frontiers in Genetics. 7, 161 (2016).
- Kim, H. E., et al. Lipid Biosynthesis Coordinates a Mitochondrial-to-Cytosolic Stress Response. Cell. 166 (6), 1539-1552 (2016).
- Wang, Y., Hekimi, S. Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot. Science. 350 (6265), 1204-1207 (2015).
- Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson's model. Cell Death & Disease. 5, e984 (2014).
- Tronstad, K. J., et al. Regulation and quantification of cellular mitochondrial morphology and content. Current Pharmaceutical Design. 20 (35), 5634-5652 (2014).
- Wiegand, G., Remington, S. J. Citrate synthase: structure, control, and mechanism. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).
- Lopez-Lluch, G., et al. Calorie restriction induces mitochondrial biogenesis and bioenergetic efficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (6), 1768-1773 (2006).
- MacInnis, M. J., et al. Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work. Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).
- Gillen, J. B., et al. Twelve Weeks of Sprint Interval Training Improves Indices of Cardiometabolic Health Similar to Traditional Endurance Training despite a Five-Fold Lower Exercise Volume and Time Commitment. PLoS One. 11 (4), e0154075 (2016).
- Mukherjee, S., Basar, M. A., Davis, C., Duttaroy, A. Emerging functional similarities and divergences between Drosophila Spargel/dPGC-1 and mammalian PGC-1 protein. Frontiers in Genetics. 5, 216 (2014).
- Mukherjee, S., Duttaroy, A. Spargel/dPGC-1 is a new downstream effector in the insulin-TOR signaling pathway in Drosophila. Genetics. 195 (2), 433-441 (2013).
- Diop, S. B., et al. PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase. Cell Reports. 10 (9), 1572-1584 (2015).
- Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).
- Wei, P., et al. RNF34 modulates the mitochondrial biogenesis and exercise capacity in muscle and lipid metabolism through ubiquitination of PGC-1 in Drosophila. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50 (10), 1038-1046 (2018).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Bosco, G., et al. Effects of oxygen concentration and pressure on Drosophila melanogaster: oxidative stress, mitochondrial activity, and survivorship. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 88 (4), 222-234 (2015).
