Summary
Nous présentons un protocole pour un test colorimétrique de l'activité de synthase de citrate pour la quantification de la masse mitochondriale intacte dans les homogénéités de tissu de Drosophila.
Abstract
Les mitochondries jouent les rôles les plus importants dans le métabolisme cellulaire en produisant de l'ATP par phosphorylation oxydative et en régulant une variété de processus physiologiques. Le dysfonctionnement mitochondrial est une cause primaire d'un certain nombre de maladies métaboliques et neurodégénératives. Les mitochondries intactes sont essentielles à leur bon fonctionnement. La synthase de citrate d'enzyme est localisée dans la matrice mitochondriale et peut ainsi être employée comme marqueur quantitatif d'enzyme de la masse mitochondriale intacte. Étant donné que de nombreuses molécules et voies qui ont des fonctions importantes dans les mitochondries sont fortement conservés entre les humains et Drosophila, et qu'un éventail d'outils génétiques puissants sont disponibles dans Drosophila, Drosophila sert de bon système modèle pour l'étude de la fonction mitochondriale. Ici, nous présentons un protocole pour la mesure rapide et simple de l'activité de synthase de citrate dans l'homogénéisation de tissu des mouches adultes sans isoler des mitochondries. Ce protocole convient également à la mesure de l'activité de synthase de citrate dans les larves, les cellules cultivées et les tissus mammifères.
Introduction
Les mitochondries sont surtout connues comme les organites producteurs d'énergie dans la plupart des organismes eucaryotes, qui produisent la monnaie de l'énergie, l'ATP, à travers le cycle de l'acide tricarboxylique (c.-à-d. le cycle Debs) et la phosphorylation oxydative. Les mitochondries jouent également un rôle important dans un grand nombre d'autres processus physiologiques, tels que la régulation de l'apoptose1, Ca2 ' homéostasie2,3, espèces d'oxydation réactive (ROS) génération4, et réticulum endoplasmique (ER)-réponse au stress5. Le dysfonctionnement mitochondrial peut affecter n'importe quel organe dans le corps à n'importe quel âge et est une cause primaire des maladies métaboliques, liées au vieillissement6,et neurodegenerative7. Les mitochondries intactes sont mécanistes liées à la fonction mitochondriale. Ainsi, la quantification appropriée de la masse mitochondriale intacte est très importante pour évaluer la fonction mitochondriale8. La synthase de citrate, une enzyme de limitation de taux dans la première étape du cycle d'acide tricarboxylique9,est localisée dans la matrice mitochondriale dans les cellules eucaryotes, et peut ainsi être employée comme marqueur quantitatif pour la présence de la masse mitochondriale intacte9,10. L'activité de synthase de citrate peut également être employée comme facteur de normalisation pour les protéines mitochondriales intactes11,12.
La mouche des fruits, Drosophila melanogaster, est un excellent système modèle pour l'étude de la fonction mitochondriale, comme de nombreuses molécules et les voies qui jouent des rôles pivots dans les mitochondries sont évolutivement conservés de Drosophila à l'homme13,14,15. Ici, nous présentons un protocole pour une méthode rapide et simple pour la mesure de l'activité de synthase de citrate par un test colorimétrique dans le tissu de Drosophila homogénéise16 dans un format de plaque de puits 96. Dans l'analyse de l'activité de synthase de citrate, la synthase de citrate dans le tissu de Drosophila homogénéise catalyse la réaction de l'oxaloacetate avec la coenzyme acétyle A (acétyl CoA) pour former le citrate CoA-SH etH. CoA-SH réagit par la suite avec 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) pour générer un produit coloré, 2-nitro-5-thiobenzoate (TNB), qui peut être facilement mesuré spectrophotometrically à 412 nm. L'activité de synthase de citrate peut être reflétée par le taux de production de couleur.
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Protocol
1. Colorimétrique Citrate Synthase Activity Assay pour D. melanogaster16
- Recueillir dix mouches adultes pour chaque échantillon. Recueillir au moins des échantillons tripler pour chaque génotype.
- Préparer 500 l de tampon d'extraction à froid contenant 20 mM HEPES (pH à 7,2), 1 mM EDTA et 0,1 % de triton X-100 dans un tube à essai de 1,5 mL pour chaque échantillon.
- Anesthésier les mouches adultes avec du CO2 sur un coussin et isoler les tissus désirés. Pour isoler les thoraxes mouche adultes, par exemple, fixer les thoraxes mouche par une paire de forceps, puis isoler les abdomens de mouche en coupant le long de la frontière du thorax et de l'abdomen à l'aide d'une paire de ciseaux. Recueillir les thoraxes mouche pour le citrate musculaire synthase activité d'assay.
REMARQUE : Déterminez le poids frais du tissu à cette étape si vous l'utilisez pour normaliser l'activité de synthase du citrate. - Transférer immédiatement 10 thorax mouches adultes à 100 l de tampon d'extraction à froid et homogénéiser avec un pilon sur la glace. Pour garder les échantillons glacés, homogénéiser les échantillons pour 5-10 s sur la glace, puis faire les échantillons assis sur la glace pendant 5 s, et répéter jusqu'à ce que tous les tissus dans le tube sont homogénéisés complètement.
REMARQUE: Tapez le tube, vérifiez les homogénéates pour s'assurer qu'il n'y a pas de caillots dans les homogénéates et que les tissus dans le tube sont homogénéisés complètement. Tous les échantillons de traitements doivent être effectués sur glace. - Prenez 10 L de chaque échantillon homogénéisé dans un nouveau tube pour la mesure de la teneur en protéines. Conservez les échantillons pour la mesure des protéines sur la glace.
REMARQUE : Les échantillons de protéines peuvent être congelés et stockés à -80 oC pour une analyse ultérieure. Les concentrations protéiques servent de paramètre interne pour la normalisation des activités de synthase de citrate. - Ajouter 400 ll de tampon d'extraction à glace à chaque échantillon restant pour obtenir un volume total de 500 l. Bien mélanger en tirant doucement de haut en bas au moins 5 fois, en évitant la formation de bulles. Pour chaque réaction, ajouter 1 l de lysate dilué à 150 oL de la solution de réaction fraîchement préparée (20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM DTNB, 0,3 mM d'acétyl CoA, 1 mM d'acide oxaloacétique). Mélanger soigneusement et immédiatement en pipetilage doucement, en évitant la formation de bulles. Mesurer l'absorption à 412 nm tous les 10-30 s pendant 4 min à 25 oC à l'aide d'un lecteur de plaque capable de mesurer l'absorption à 412 nm à intervalles minimums de 10 s.
REMARQUE : Changez la pointe avant de pipetting un réactif différent et éviter de former des bulles dans les puits. Le mélange incomplet des réactifs peut entraîner des variations dans les mesures. L'analyse d'activité de synthase de citrate devrait être faite à la température ambiante immédiatement après que les échantillons soient rassemblés, car cet analyse est employé pour quantifier la masse mitochondrique intacte. Le tampon de réaction doit être préparé immédiatement avant utilisation et ne doit pas être stocké. - Tracer les données sous forme d'absorption de densité optique (OD) (abs) (axe Y) par rapport au temps (en minutes) (axe X). Calculez ensuite la pente pour la partie linéaire de la courbe, où le taux de réaction est
Divisez la valeur par la concentration de protéines de l'échantillon pour normaliser l'activité de synthase du citrate. L'activité de synthase du citrate est calculée comme
REMARQUE : La concentration en protéines de l'échantillon peut être mesurée par un kit d'analyse de concentration de protéines.
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Representative Results
La figure 1 présente un exemple des courbes cinétiques de l'absorption de l'OD à 412 nm au fil du temps obtenue s'appuyant sur l'analyse colorimétrique de l'activité de synthase de citrate pour mesurer les homogénéités du tissu thorax Drosophila de différents génotypes. Il est bien connu que PGC-1 est un régulateur principal de la biogenèse mitochondriale. PgC-1 est fonctionnellement conservé entre la drosophile et l'homme. Drosophile RNF34 (dRNF34) est une ligase d'ubiquitine E3 pour Drosophila PGC-1, dPGC-1, et favorise la dégradation des protéines dPGC-117. La microscopie électronique de transmission et le qPCR d'ADN mitochondrial ont montré que le renversement de dRNF34 dans le muscle de Drosophila augmente le contenu mitochondrique, qui est supprimé par knockdown de dPGC-117. Sur la base de ces résultats nous avons supposé que le renversement de dRNF34 dans le muscle de Drosophila augmenterait l'activité de synthase de citrate mitochondrial, qui devrait être renversée par knockdown de dPGC-1. En effet, en utilisant l'analyse colorimétrique de l'activité de synthase de citrate décrite ici, nous avons constaté que le knockdown de dRNF34 dans le muscle de Drosophila a augmenté l'activité de synthase de citrate mitochondrial, qui a été renversée par knockdown de dPGC-1. Plus précisément, à l'aide de la méthode décrite ici, un taux enzymatique linéaire initial a été établi pour chaque analyse (figure 1). Les lignes de tendance avec leurs formules et leur coefficient de détermination (R2) sont indiquées dans le graphique (Figure 1). Les pentes des lignes de tendance représentent les taux de réaction maximaux, qui sont équivalents aux activités maximales de synthase de citrate des différents génotypes. Les pentes des différents génotypes sont différentes (Figure 1). Le coefficient de détermination est plus proche de 1; les formules des lignes de tendance sont plus fiables. La concentration protéique normalisée des activités maximales de synthase de citrate de différents génotypes a été calculée à partir des données de la figure 1 (Figure 2). L'activité maximale de synthase de citrate des thoraxes de mouche avec le knockdown dRNF34 muscle-spécifique a augmenté, qui a été renversée par le knockdown spécifique de dPGC-1 de muscle-spécifique (figure 2).
Figure 1 : Exemple des courbes cinétiques de l'œmaïde colorimétrique de l'activité de synthase du citrate. Les homogénéités adultes de thorax de mouche de (a) 24B-Gal4-gt;(b) 24B-Gal4-gt;dRNF34RNAi(II), et (c) 24B-Gal4-gt;dRNF34RNAi(II),dPGC-1RNAi ont été soumis à l'exemple colorimétrique de l'activité de synthase de citrate. Les axes horizontaux représentent les temps de réaction, et les axes verticaux représentent des absorbants d'OD à 412 nm. Un taux enzymatique linéaire a été établi pour chaque génotype. Les lignes de tendance ont été tracées et les formules et R2 des lignes de tendance sont indiquées dans le graphique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Les activités maximales de synthase de citrate calculées à partir des courbes cinétiques et normalisées par la concentration de protéine. L'activité maximale de synthase de citrate des thoraxes de mouche avec le knockdown de dRNF34 muscle-spécifique a augmenté, qui a été renversée par le knockdown spécifique de dPGC-1 de muscle-spécifique. Toutes les données sont représentées comme des moyens - SEM(p 'lt; 0.01, par test ANOVA, et le test de Tukey pour les comparaisons multiples, n ' 3, 10 thoraxes par réplique). Ce chiffre est modifié à partir de Wei et coll.17. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les études métaboliques utilisant Drosophila comme modèle doivent prendre en considération le fond génétique, l'alimentation, et l'entretien de stock des mouches18. Afin d'éviter les effets de différents milieux génétiques sur la mesure de l'activité de la synthase du citrate, différentes souches de Drosophila doivent être rétrocroisées à la souche témoin pendant 10 générations. Le fond génétique de toutes les souches de Drosophila utilisées dans nos expériences est w1118, donc nous avons utilisé w1118 comme un contrôle. En général, nous pensons que w1118 est un bon contrôle, car il est le fond génétique pour la plupart des souches de Drosophila et est beaucoup plus facile à faire reculer que Canton-S. Le régime alimentaire et l'entretien des stocks doivent être exactement les mêmes pour tous les groupes expérimentaux. Dans nos expériences, les mouches sont normalement maintenues à 25 oC et 50-60% d'humidité relative. L'étape de préparation de l'échantillon doit également être effectuée avec prudence. Les croix qui sont mis en place pour l'expérience doivent être dans une échelle similaire et appropriée. Pour mettre en place une croix, 3-4 mouches femelles adultes vierges sont conservés avec 2-3 mouches adultes mâles dans un diamètre de 4 cm, 15 cm de haut flacon fourni avec de la nourriture fraîche. La recette alimentaire peut varier (p. ex., régime riche en graisses, régime normal, régime riche en sucre), selon la conception expérimentale. Deux jours plus tard, la génération parentale de mouches est transférée dans une nouvelle fiole avec des aliments frais. Prendre soin des larves éclos dans la nourriture comprend l'ajout d'un peu d'eau si nécessaire. Lorsque la génération filiale de mouches commence à éclore, les flacons sont retournés tous les 24 h, les mouches du génotype désiré sont recueillies dans une nouvelle fiole pour l'expérience, et la date d'éclosion des mouches est marquée sur chaque flacon. Environ 20-30 mouches collectées du même génotype, sexe, et âge sont gardés dans une fiole avec de la nourriture. Les mouches collectées doivent être transférées à des flacons frais avec de la nourriture appropriée tous les deux jours jusqu'à ce que les expériences soient effectuées. Pour éviter l'effet de l'âge sur l'activité de la synthase de citrate, les mouches des différents groupes testés doivent éclore le même jour. En outre, le sexe des mouches doit être apparié. Habituellement, la taille du corps des femelles est plus grande que celle des mâles, donc la concentration en protéines des corps féminins est plus élevée que celle des corps masculins.
L'analyse de l'activité de synthase de citrate peut également être utilisée pour mesurer l'activité de synthase de citrate chez les larves. À cette fin, chaque échantillon peut se composer de cinq larves errantes troisième instar. Les troisièmes larves instar se distinguent par un anneau orange foncé à l'extrémité de leurs spiracles postérieurs, qui est absent ou faiblement présent chez les larves de la deuxième étoile.
À l'étape 6, les rapports de dilution des échantillons peuvent varier selon les échantillons. Pour les échantillons qui sont d'abord mesurés, plusieurs rapports de dilution doivent être essayés pour déterminer un rapport de dilution approprié pour établir un taux enzymatique linéaire dans l'essai. Le temps de mesure total pour l'activité enzymatique maximale qui établit un taux enzymatique linéaire dans l'essai varie selon le rapport enzyme-substrat. Si le substrat est extrêmement surdosé par rapport à l'enzyme, alors l'activité enzymatique ou le taux de réaction atteint un maximum, ce qui permet l'établissement d'un taux enzymatique linéaire dans l'analyse. Au fur et à mesure que la réaction se poursuit, la quantité du substrat diminue, et l'activité enzymatique ou le taux de réaction ralentit. Si un taux enzymatique linéaire ne peut pas être tracé, ce qui signifie que le substrat n'est pas surdosé par rapport à l'enzyme, diluer davantage les homogénéités tissulaires avec une solution de réaction ou raccourcir le temps d'intervalle pour les lectures de 412 nm jusqu'à ce qu'une parcelle linéaire de taux enzymatique soit Établi. Le temps d'intervalle pour la lecture de 412 nm ne doit pas être supérieur à 30 s. La durée de la lecture de 412 nm est basée sur le taux de réaction et le temps. La lecture du spectrophotomètre doit cesser lorsqu'aucun autre changement de couleur n'est observé pour toutes les réactions.
L'activité de synthase de citrate peut être normalisée par la concentration de protéine d'échantillon, le poids frais d'échantillon, ou le nombre de cellules. Le poids frais de l'échantillon peut être mesuré avant l'homogénéisation comme à l'étape 3. Le numéro de cellule peut également être utilisé pour normaliser le lysate des cellules cultivées, mais les cellules doivent être complètement lysées. La teneur en ADN n'est pas une bonne option pour un contrôle interne, car la procédure d'extraction de l'ADN peut introduire des variations dans les échantillons, en particulier pour les échantillons contenant une petite quantité d'ADN.
Si aucun changement de couleur n'est observé après la réaction, plusieurs étapes de dépannage différentes peuvent être prises :
1. Vérifier l'étape de préparation de l'échantillon, en veillant à bien traiter les échantillons, à les conserver sur la glace et à éviter les cycles de gel et de dégel multiples.
2. Essayez d'utiliser une concentration plus élevée de protéines, parce que certains échantillons pourraient avoir des niveaux d'expression beaucoup plus faibles de la synthase de citrate qui sont indétectables par l'essai d'activité de synthase de citrate.
3. Notez que certains kits disponibles dans le commerce pour l'analyse d'activité de synthase de citrate ne peuvent pas être employés pour Drosophila,parce que ces kits déterminent l'activité mitochondriale de synthase de citrate basée sur l'immunocapture de la synthase de citrate de mammifère et l'anticorps de synthase de citrate de mammifère peut ne pas reconnaître la synthase de citrate de Drosophila.
De même, s'il y a un écart entre les échantillons :
1. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles dans les puits.
2. Examiner si cela est causé par une mauvaise technique de tuyauterie.
Contrairement à mesurer l'activité de synthase de citrate par un test colorimétrique dans les mitochondries purifiées, qui exige presque 200 mouches pour la purification des mitochondries de chaque génotype19,nous présentons un protocole pour un test rapide et simple pour la mesure de l'activité de synthase de citrate par une méthode colorimétrique dans l'homogénéité de tissu ou dans les extraits de cellules entières16. Pour chaque échantillon, seulement dix mouches éclos le même jour sont nécessaires; pour tripler les échantillons de chaque génotype, 30 mouches sont nécessaires. Le protocole décrit s'applique non seulement à la drosophile, mais aussi à d'autres systèmes, tels que les cellules cultivées et les tissus mammifères.
Outre l'analyse d'activité de synthase de citrate, d'autres méthodes peuvent être employées pour quantifier la masse mitochondrique. Comparé à d'autres méthodes quantitatives couramment utilisées des mitochondries, telles que la mesure de la teneur en ADN mitochondrial par qPCR et la quantification des protéines mitochondriales par le ballonnement occidental, qui détectent toutes les mitochondries indépendamment de leur fonction, l'essai d'activité de synthase de citrate est employé pour quantifier la présence de la masse mitochondriale intacte. Contrairement à l'analyse de la respiration mitochondriale, qui nécessite une purification mitochondriale et un équipement d'analyse spécialisé16,l'analyse de l'activité de synthase du citrate permet aux chercheurs d'effectuer des mesures rapides par spectrophotométrie avec une simple préparation d'échantillon, comme l'extrait de cellules entières ou l'homogénéité des tissus, et aucun besoin d'isolement mitochondrial. Ainsi, l'analyse d'activité de synthase de citrate est un test rapide et économique pour quantifier la masse mitochondriale intacte.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les subventions de la National Natural Science Foundation of China (31401013 et 31471010), de la Science and Technology Commission of Shanghai Municipality, du Shanghai Pujiang Program (14PJ1405900) et de la Natural Science Foundation of Shanghai (19ZR1446400).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Pellet pestle | Sangon | F619072 | |
| Pellet pestle motor | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Plate reader | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Assay kit | Beyotime | P0010S | |
| Scissors | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
References
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