Summary
ショウジョウバエ組織ホモジネテスにおける無傷のミトコンドリア塊を定量するためのクエン酸シンターゼ活性の比色アッセイのためのプロトコルを提示する。
Abstract
ミトコンドリアは、酸化リン酸化を通じてATPを産生し、様々な生理学的プロセスを調節することにより、細胞代謝において最も顕著な役割を果たしています。ミトコンドリア機能不全は、多くの代謝および神経変性疾患の主な原因である。無傷のミトコンドリアは、その適切な機能のために重要です.クエン酸酵素シンターゼはミトコンドリアマトリックスに局在しているため、無傷のミトコンドリア塊の定量酵素マーカーとして使用することができます。ミトコンドリアで重要な機能を持つ多くの分子や経路がヒトとショウジョウバレの間で高度に保存されており、ショウジョウバアラで強力な遺伝的ツールの配列が利用可能であることを考えると、ショウジョウバヤはミトコンドリア機能を研究するための良いモデルシステムとして機能します。ここでは、ミトコンドリアを単離することなく、成体ハエ由来の組織ホモジネートにおけるクエン酸シンターゼ活性を迅速かつ簡単に測定するためのプロトコルを提示する。このプロトコルはまた、幼虫、培養細胞、および哺乳動物組織におけるクエン酸シンターゼ活性を測定するのに適している。
Introduction
ミトコンドリアは、トリカルボン酸サイクル(すなわち、クレブスサイクル)および酸化リン酸化を介してエネルギー通貨ATPを生成するほとんどの真核生物における発電性オルガネラとして最もよく知られています。ミトコンドリアはまた、アポトーシス1、Ca2+恒常性2、3、反応性酸化種(ROS)生成4、および小胞体(ER)ストレス応答5の調節など、他の多くの生理学的過程において重要な役割を果たすることが判明している。ミトコンドリア機能障害は、任意の年齢で体内の任意の臓器に影響を与えることができるし、代謝、老化関連6、および神経変性疾患の主な原因である7。無傷のミトコンドリアは、ミトコンドリア機能に機械的に関連しています。従って、ミトコンドリア質量の適切な定量は、ミトコンドリア機能8を評価するために非常に重要である。クエン酸シンターゼは、トリカルボン酸サイクル9の第1工程における速度制限酵素であり、真核細胞内のミトコンドリアマトリックスに局在し、従って無傷のミトコンドリア質量9、10の存在のための定量マーカーとして使用することができる。クエン酸シンターゼ活性は、無傷のミトコンドリアタンパク質11、12の正規化因子としても使用することができる。
フルーツフライ、ショウジョウバエメラノガスターは、ミトコンドリアで重要な役割を果たす多くの分子および経路がショウジョウバエからヒト13、14、15に進化的に保存されているので、ミトコンドリア機能を研究するための優れたモデルシステムである。ここでは、ショウジョウバエ組織中の比色アッセイによるクエン酸シンターゼ活性を96ウェルプレート形式で均質化するクエン酸シンターゼ活性を測定するための迅速かつ簡単な方法のためのプロトコルを提示する。クエン酸シンターゼ活性アッセイにおいて、ショウジョウバエ組織中のクエン酸シンターゼは、アセチル補酵素A(アセチルCoA)とオキサロ酢酸塩の反応を触媒し、クエン酸CoA-SHおよびH+を形成する。CoA-SHはその後、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)(DTNB)と反応して着色物を生成し、2-ニトロ-5-チオ安息香酸塩(TNB)を生成し、412nmで分光法で容易に測定することができる。クエン酸シンターゼ活性は、色の生産速度によって反映することができる。
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Protocol
1. D.メラノガスターの比色クエン酸シンターゼ活性アッセイ16
- サンプルごとに10匹の大人のハエを収集します。各遺伝子型の少なくとも三重のサンプルを収集します。
- 20 mM HEPES (pH = 7.2)、1 mM EDTA、および 0.1% トリトン X-100 を含む氷冷抽出バッファーを 1 サンプルごとに 1.5 mL 試験管に用意します。
- 麻酔パッド上のCO2で成人のハエを麻酔し、所望の組織を分離する。例えば、大人のフライ・トラックスを隔離するには、ハエの胸部を鉗子で固定し、はさみを使って胸部と腹部の境界に沿って切断してハエの腹部を隔離する。筋肉クエン酸シンターゼ活性アッセイのためのフライタラキックスを収集します。
注:クエン酸シンターゼ活性を正規化するためにそれを使用する場合は、このステップで組織の新鮮な重量を決定します。 - 10人の大人のフライ・トラクセンクスを直ちに100°Lの氷冷抽出バッファーに移し、氷上の害虫と均質化する。サンプルを氷冷状態に保つには、氷上で5~10sのサンプルを均質化し、サンプルを氷の上に5s置き、チューブ内のすべての組織が完全に均質化されるまで繰り返します。
注:チューブをテープでテープに入れ、ホモジネテをチェックして、ホモジネテに血塊がないこと、チューブ内の組織が完全に均質化されていることを確認します。すべてのサンプル処理は氷上で行う必要があります。 - タンパク質含有量測定用の新しいチューブで、各均質化サンプルの10μLを取ります。タンパク質測定用のサンプルを氷の上に保管してください。
注:タンパク質サンプルを凍結し、後で分析するために-80°Cで保存することができます。タンパク質濃度は、クエン酸シンターゼ活性の正常化のための内部パラメータとして機能する。 - 残りの各サンプルに400μLの氷冷抽出バッファーを加えて、合計体積を500°Lにします。反応ごとに、調製した反応液の150μL(20mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.1 mM DTNB、0.3 mMアセチルCoA、1mMオキサロ酢酸)に希釈された細胞溶解物を1μL添加します。気泡の形成を避け、穏やかにピペットで徹底的かつ直ちに混合します。10sの最小間隔で412 nmで吸光度を測定できるプレートリーダーを使用して、25°Cで4分間40〜30s毎に412 nmで吸光度を測定します。
注:別の試薬を配管する前に先端を変更し、井戸に気泡を形成しないようにしてください。試薬の不完全な混合は、測定にばらつきを引き起こす可能性があります。クエン酸シンターゼ活性アッセイは、サンプルが採取された直後に室温で行う必要があります。反応バッファーは、使用の直前に準備する必要があり、保存しないでください。 - 光学密度(OD)吸光度(abs)(Y軸)対時間(分)(X軸)としてデータをプロットします。次に、反応速度が
サンプルタンパク質濃度で値を割り、クエン酸シンターゼ活性を正規化する。クエン酸シンターゼ活性は、
注:サンプルタンパク質濃度は、タンパク質濃度アッセイキットにより測定することができる。
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Representative Results
図1は、クエン酸シンターゼ活性比色アッセイを用いて得られた412nmにおけるOD吸光度に対する運動曲線の一例を示し、異なる遺伝子型のショウジョウバエ胸郭組織ホモジナートを測定する。PGC-1αがミトコンドリア生形成の主レギュレータであることはよく知られている。PGC-1αはショウジョウバアラとヒトの間で機能的に保存されています。ショウジョウバアラRNF34(dRNF34)は、ショウジョウバエPGC-1α、dPGC-1に対するE3ユビキチンリガーゼであり、dPGC−1タンパク質分解を促進する。透過型電子顕微鏡およびミトコンドリアDNA qPCRは、ショウジョウバエ筋におけるdRNF34のノックダウンがミトコンドリア含有量を増加させ、dPGC-117のノックダウンによって抑制されることを示している。これらの結果に基づいて、ショウジョウバエ筋におけるdRNF34のノックダウンは、dPGC-1のノックダウンによって逆転するはずのミトコンドリアクエン酸シンターゼ活性を増加させるという仮説を立てた。実際、ここで説明するクエン酸シンターゼ活性の比色アッセイを用いて、ショウジョウバエ筋におけるdRNF34のノックダウンは、dPGC-1のノックダウンによって逆転したミトコンドリアクエン酸シンターゼ活性を増加させることを発見した。具体的には、ここで説明する方法を用いて、アッセイごとに初期線形酵素速度が確立された(図1)。その式と決定係数(R2)を含む傾向線がグラフに示されています(図1)。トレンドラインの傾きは、異なる遺伝子型の最大クエン酸シンターゼ活性に相当する最大反応速度を表します。異なる遺伝子型の傾きは異なります(図1)。決定係数は 1 に近くなります。傾向線の数式の方が信頼性が高くなります。異なる遺伝子型のプロテノ化最大クエン酸シンターゼ活性をプロマル化したタンパク質濃度を図1データから算出した(図2)。筋肉特異的dRNF34ノックダウンを伴うフライトラックスの最大クエン酸シンターゼ活性が増加し、これは筋肉特異的なdPGC-1ノックダウンによって逆転した(図2)。
図1:クエン酸シンターゼ活性の比色アッセイの運動曲線の例。成人フライトラックスホモジナート(a)24B-Gal4>+ ( b ) 24B-Gal4>dRNF34RNAi(II), (c) 24B-Gal4>dRNF34RNAi(II), dPGC-1RNAiをクエン酸シンハス活性の比色アッセイを行った。水平軸は反応時間を表し、垂直軸は 412 nm の OD 吸収性を表します。遺伝子型ごとに線形酵素速度が確立された。傾向線が描画され、傾向線の数式と R2がグラフに表示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:運動曲線から算出され、タンパク質濃度によって正規化された最大クエン酸シンターゼ活性。筋肉特異的dRNF34ノックダウンを伴うフライトラックスの最大クエン酸シンターゼ活性が増加し、筋肉特異的なdPGC-1ノックダウンによって逆転した。すべてのデータは、平均 ± SEM (*p < 0.01、ANOVA 検定、および複数比較の Tukey の検定 、 n = 3、 10 トーラックス)として表されます。この図はWeiら17から改変されている。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ショウジョウバエをモデルとして使用した代謝研究は、ハエ18の遺伝的背景、食事、およびストックメンテナンスを考慮する必要があります。クエン酸シンターゼ活性の測定に異なる遺伝的背景の影響を避けるために、ショウジョウバエの異なる株は、10世代のコントロール株にバッククロスする必要があります。我々の実験で使用されるすべてのショウジョウバレ株の遺伝的背景はw 1118であり、我々は対照としてw1118を使用した。一般的に、w1118は、ほとんどのショウジョウバレ株の遺伝的背景であり、カントン-Sよりもバッククロスがはるかに簡単であるため、良好なコントロールであると考えています。食事と在庫の維持は、すべての実験グループでまったく同じでなければなりません。私たちの実験では、ハエは通常25°Cと50-60%の相対湿度で維持されます。サンプルの準備手順も注意して実行する必要があります。実験用に設定された十字架は、類似した適切なスケールである必要があります。クロスを設定するために、3-4女性の処女成成ハエは、生鮮食品を供給された4センチの直径、15センチの高さのバイアルで2-3男性の大人のハエで保たれています。食品のレシピは、実験計画に応じて(例えば、高脂肪食、通常の食事、高糖食)異なる場合があります。2日後、ハエの親の世代は新鮮な食べ物と新しいバイアルに移されます。食べ物に孵化した幼虫の世話は、必要に応じていくつかの水を追加が含まれます。ハエの親孝行生成が孵化し始めると、バイアルは24時間ごとに反転され、所望の遺伝子型のハエは実験用の新しいバイアルに集まり、ハエの孵化日が各バイアルに印付けされます。同じ遺伝子型、性別、年齢の約20~30本のハエを食べ物と共にバイアルに保管しています。収集したハエは、実験が行われるまで2日ごとに適切な食品を含む新鮮なバイアルに移す必要があります。クエン酸シンターゼ活性に対する年齢の影響を避けるために、テストされた異なるグループのハエは、同じ日に孵化する必要があります。また、ハエの性別を一致させる必要があります。通常、女性の体の大きさは男性の体よりも大きいので、女性の体のタンパク質濃度は男性の体よりも高い。
クエン酸シンターゼ活性アッセイは、幼虫におけるクエン酸シンターゼ活性を測定するためにも使用することができる。この用に、各サンプルは、5つの放浪第3インスター幼虫から構成され得る。第3のインスター幼虫は、第2のインスター幼虫に欠けているか、または弱く存在する後尖塔の先端に濃いオレンジ色のリングによって区別することができる。
ステップ6では、サンプルの希釈比は、サンプルごとに異なる場合があります。最初に測定されるサンプルについて、アッセイで線形酵素率を確立するために適切な希釈比を決定するために、いくつかの希釈比を決定しようとする必要があります。アッセイで線形酵素率を確立する最大酵素活性の総測定時間は、酵素基質比によって異なる。基質が酵素と比較して極めて過剰摂取している場合、酵素活性または反応速度は最大に達し、アッセイにおける線形酵素速度の確立を可能にする。反応が進むにつれて、基質の量が減少し、酵素活性または反応速度が遅くなります。線形酵素速度をプロットできない場合、これは基質が酵素と比較して過剰に過剰に使用されないことを意味し、さらに反応溶液で組織ホモジを希釈するか、線形酵素速度プロットまで412nm測定値の間隔時間を短縮します。確立。412 nm 読み取りの間隔時間は 30 s 以下にする必要があります。412 nmの読み取り時間は反応速度および時間に基づいている。分光光度計の読み取りは、すべての反応に対してそれ以上の色の変化が観察されていない場合に停止する必要があります。
クエン酸シンターゼ活性は、サンプルタンパク質濃度、サンプル新鮮な重量、または細胞数によって正規化することができる。サンプルの新鮮な重量は、ステップ3のように均質化する前に測定することができる。細胞番号は、培養細胞のリサートを正規化するためにも使用できますが、細胞は完全にリゼする必要があります。DNA抽出手順は、特に少量のDNAを含むサンプルの場合、サンプルにばらつきを導入する可能性があるため、DNA含有量は内部制御に適していません。
反応後に色の変化が見られなかった場合は、いくつかの異なるトラブルシューティング手順を実行できます。
1. サンプルの準備ステップを確認し、サンプルを適切に処理し、サンプルを氷の上に保持し、複数の凍結融解サイクルを避けてください。
2.一部のサンプルはクエン酸シンターゼ活性アッセイで検出できないクエン酸シンターゼの発現レベルがはるかに低い可能性があるため、より高いタンパク質濃度を使用してみてください。
3. クエン酸シンターゼ活性アッセイのための一部の市販キットはショウジョウバエには使用できないことに注意してください, これらのキットは、哺乳動物クエン酸シンターゼの免疫捕獲に基づいてミトコンドリアクエン酸シンターゼ活性を決定するので、哺乳動物クエンターゼ抗体と哺乳酸クエンターゼ抗体はショウジョウバレク酸合成酵素を認識しない場合があります。
同様に、サンプル間に不一致がある場合は、次の手順を実行します。
1. 井戸に泡がないことを確認します。
2. これが不十分なピペット技術によるものかどうかを調べます。
各遺伝子型19のミトコンドリアの精製に約200個のハエを必要とする精製ミトコンドリアにおける比色アッセイによるクエン酸シンターゼ活性の測定とは対照的に、組織ホモゲンまたは全細胞抽出物における色分法によるクエン酸シンターゼ活性の測定のための高速かつ簡単なアッセイのためのプロトコルを提示する。各サンプルに対して、同じ日に孵化した10個のハエのみが必要です。各遺伝子型の三重サンプルのために、30のハエが必要である。記載されているプロトコルは、ショウジョウバアラだけでなく、培養細胞や哺乳動物組織などの他のシステムにも適用可能である。
クエン酸シンターゼ活性アッセイに加えて、ミトコンドリア質量を定量するために他の方法を使用することができる。qPCRによるミトコンドリアDNA含有量の測定やウェスタンブロッティングによるミトコンドリアタンパク質の定量など、ミトコンドリアの他の一般的に使用される定量方法と比較して、その機能に関係なくすべてのミトコンドリアを検出し、クエン酸シンターゼ活性アッセイを使用して、ミトコンドリア質量の存在を定量する。ミトコンドリアの浄化と特殊なアッセイ装置16を必要とするミトコンドリア呼吸アッセイとは異なり、クエン酸シンターゼ活性アッセイにより、細胞抽出物全体や組織ホモジネートなどの簡単なサンプル調製による分光法による迅速な測定を行い、ミトコンド単離の必要がない。従って、クエン酸シンターゼ活性アッセイは、無傷のミトコンドリア質量を定量するための迅速かつ経済的なアッセイである。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しない。
Acknowledgments
この研究は、中国国立自然科学財団(31401013および31471010)、上海市科学技術委員会、上海浦江プログラム(14PJ1405900)、自然科学財団の助成金によって支援されました。上海 (19ZR1446400).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Pellet pestle | Sangon | F619072 | |
| Pellet pestle motor | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Plate reader | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Assay kit | Beyotime | P0010S | |
| Scissors | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
References
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