Presentamos un protocolo para un ensayo colorimétrico de la actividad citrato sintasa para la cuantificación de la masa mitocondrial intacta en el tejido Drosophila homogeneatos.
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Artículo de método
Un ensayo colorimétrico de la actividad de citrato sintasa en Drosophila Melanogaster
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En este artículo
Resumen
Resumen
Las mitocondrias desempeñan el papel más prominente en el metabolismo celular mediante la producción de ATP a través de la fosforilación oxidativa y la regulación de una variedad de procesos fisiológicos. La disfunción mitocondrial es una causa primaria de una serie de enfermedades metabólicas y neurodegenerativas. Las mitocondrias intactas son fundamentales para su correcto funcionamiento. La enzima citrato sintasa se localiza en la matriz mitocondrial y por lo tanto se puede utilizar como un marcador de enzima cuantitativa de la masa mitocondrial intacta. Dado que muchas moléculas y vías que tienen funciones importantes en las mitocondrias están altamente conservadas entre los seres humanos y Drosophila,y que una serie de potentes herramientas genéticas están disponibles en Drosophila, Drosophila sirve como un buen sistema modelo para el estudio de la función mitocondrial. Aquí, presentamos un protocolo para la medición rápida y sencilla de la actividad citrato sintasa en el tejido homogeneizado de moscas adultas sin aislar las mitocondrias. Este protocolo también es adecuado para medir la actividad de la citrato sintasa en larvas, células cultivadas y tejidos de mamíferos.
Introducción
Las mitocondrias son más conocidas como los orgánulos que producen energía en la mayoría de los organismos eucariotas, que producen la moneda energética, ATP, a través del ciclo del ácido tricarboxílico (es decir, ciclo Krebs) y fosforilación oxidativa. Mitocondrias también se encuentran para desempeñar un papel importante en una gran cantidad de otros procesos fisiológicos, tales como la regulación de la apoptosis1, Ca2 + homeostasis2,3, especies de oxidación reactiva (ROS) generación4, y retículo endoplasmático (ER)-respuesta de estrés
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Protocolo
1. Ensayo de actividad de citrato colorimétrico de la síntesis para D. melanogaster16
- Recoger diez moscas adultas para cada muestra. Recoger al menos muestras triplicadas para cada genotipo.
- Preparar 500 ml de tampón de extracción en frío-hielo que contenga 20 mM de HEPES (pH a 7,2), EDTA de 1 mM y trífino X-100 del 0,1% en un tubo de ensayo de 1,5 ml para cada muestra.
- Anestetiza las moscas adultas conCO2 en una almohadilla de anestesia y aísla los tejidos deseados. Para aislar los thoraxes de mosca adultos, por ejemplo, fijar los thoraxes de mosca por un par de fórceps, y luego aislar los abdo....
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Resultados
La Figura 1 presenta un ejemplo de las curvas cinéticas para la absorbancia de la OD a 412 nm con el tiempo obtenidas utilizando el ensayo colorimétrico de actividad citrato sintasa para medir los homogeneios del tejido del tórax Drosophila de diferentes genotipos. Es bien sabido que el PGC-1 es un regulador maestro de la biogénesis mitocondrial. El PGC-1se conserva funcionalmente entre Drosophila y los humanos. Drosophila El RNF34 .......
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Discusión
Los estudios metabólicos utilizando Drosophila como modelo deben tener en cuenta los antecedentes genéticos, la dieta y el mantenimiento de las acciones de las moscas18. Para evitar los efectos de diferentes fondos genéticos en la medición de la actividad citrato sintasa, diferentes cepas de Drosophila deben ser retrocruzadas a la cepa de control durante 10 generaciones. El trasfondo genético de todas las cepas Drosophila utilizadas en nuestros experimentos es w.......
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Divulgaciones
Los autores no declaran conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31401013 y 31471010), la Comisión de Ciencia y Tecnología del Municipio de Shanghái, el Programa Pujiang de Shanghái (14PJ1405900), y la Fundación de Ciencias Naturales de Shanghái (19ZR1446400).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ácido 2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]etanosulfónico (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol (base TRIZMA) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| acetil-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Ácido ditio-bis-nitrobenzoico (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacetato | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Mortero de pellets | Sangon | F619072 | |
| Motor de mortaja de pellets | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Lector de placas | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Kit de ensayo | Beyotime | P0010S | |
| Tijeras | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
Referencias
- Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans. Cell. 157 (4), 897-909 (2014).
- Sarasija, S., Norman, K. R.
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Reimpresiones y permisos
