Summary
We presenteren een protocol voor een colorimetrische assay van citraat synthase activiteit voor de kwantificering van intacte mitochondriale massa in Drosophila weefsel homogenates.
Abstract
Mitochondriën spelen de meest prominente rollen in cellulaire metabolisme door het produceren van ATP door middel van oxidatieve fosforylering en regulering van een verscheidenheid van fysiologische processen. Mitochondriale dysfunctie is een primaire oorzaak van een aantal metabole en neurodegeneratieve ziekten. Intact mitochondriën zijn van cruciaal belang voor hun goede werking. De enzym citraat synthase is gelokaliseerd in de mitochondriale matrix en kan dus worden gebruikt als een kwantitatieve enzym marker van intacte mitochondriale massa. Gezien het feit dat veel moleculen en trajecten die belangrijke functies in de mitochondriën hebben zeer worden bewaard tussen mensen en Drosophila, en dat een scala aan krachtige genetische hulpmiddelen zijn beschikbaar in Drosophila, Drosophila fungeert als een goed modelsysteem voor het bestuderen van de mitochondriale functie. Hier presenteren we een protocol voor snelle en eenvoudige meting van citraatsynthase-activiteit in weefsel homogenaat van volwassen vliegen zonder de mitochondriën te isoleren. Dit protocol is ook geschikt voor het meten van citraat synthase-activiteit in larven, gekweekte cellen en zoogdier weefsels.
Introduction
Mitochondriën zijn het best bekend als de Power-producerende organellen in de meeste eukaryotische organismen, die de energie valuta produceren, ATP, door middel van de tricarboxylzuur cyclus (dat wil zeggen, Krebs cyclus) en oxidatieve fosforylering. Mitochondriën zijn ook gevonden om te spelen belangrijke rollen in een heleboel andere fysiologische processen, zoals regulering van apoptosis1, CA2 + homeostase2,3, reactieve oxidatie soorten (Ros) generatie4, en endoplasmatisch reticulum (er)-stress response5. Mitochondriale dysfunctie kan elk orgaan in het lichaam op elke leeftijd beïnvloeden en is een primaire oorzaak van metabole, veroudering-gerelateerde6, en neurodegeneratieve ziekten7. Intact mitochondriën zijn mechanistisch gerelateerd aan mitochondriale functie. Dus, juiste kwantificering van intacte mitochondriale massa is zeer belangrijk voor de evaluatie van de mitochondriale functie8. Citraat synthase, een snelheidsbegrenzer enzym in de eerste stap van de tricarboxylzuurcyclus9, is gelokaliseerd in de mitochondriale matrix binnen eukaryotische cellen, en kan dus worden gebruikt als een kwantitatieve marker voor de aanwezigheid van intacte mitochondriale massa9,10. Citraat synthase activiteit kan ook worden gebruikt als een normalisatie factor voor intacte mitochondriale eiwitten11,12.
De fruitvlieg, Drosophila melanogaster, is een uitstekend modelsysteem voor het bestuderen van de mitochondriale functie, omdat veel moleculen en trajecten die cruciale rollen in mitochondriën spelen, evolutionair worden bewaard van Drosophila naar mensen13,14,15. Hier presenteren we een protocol voor een snelle en eenvoudige methode voor het meten van citraat synthase activiteit door een colorimetrische assay in Drosophila weefsel homogeniteert16 in een 96 goed plaat formaat. In de Citraatsynthase-activiteit test de citraat synthase in het weefsel van Drosophila een katalyseert de reactie van Oxaloacetaat met acetyl coenzym A (acetyl CoA) om de citraat COA-sh en H+te vormen. CoA-SH reageert vervolgens met 5,5 '-dithiobis-(2-nitrobenzoëzuur) (DTNB) voor het genereren van een gekleurd product, 2-Nitro-5-thiobenzoaat (TNB), die gemakkelijk spectrofotometrisch kan worden gemeten bij 412 nm. Citraatsynthase-activiteit kan worden weerspiegeld door de snelheid van de kleur productie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. colorimetrische citraat synthase-Activiteitstest voor D. melanogaster16
- Verzamel tien volwassen vliegen voor elk monster. Verzamel ten minste drie monsters voor elk genotype.
- Bereid 500 μL ijskoude extractiebuffer met 20 mM HEPES (pH = 7,2), 1 mM EDTA en 0,1% Triton X-100 in een test buis van 1,5 mL voor elk monster.
- Anesthetize volwassen vliegt met CO2 op een verdoving pad en isoleren van de gewenste weefsels. Om de volwassen vlieg thoraxes te isoleren, bijvoorbeeld, Fixeer je de vlieg thoraxes met een paar tang en Isoleer je vervolgens de vlieg buikjes door langs de rand van de thorax en de buik te snijden met behulp van een schaar. Verzamel de vlieg thoraxes voor de spier citraat synthase activity assay.
Opmerking: Bepaal het verse gewicht van het weefsel bij deze stap als u het gebruikt om citraat synthase-activiteit te normaliseren. - Breng 10 volwassen vliegthoraxes over naar 100 μL ijskoude extractiebuffer en homogeniseren met een stamper op ijs. Om de monsters ijskoud te houden, homogeniseren de monsters voor 5-10 s op ijs, dan hebben de monsters zitten op ijs voor 5 s, en herhaal totdat alle weefsels in de buis zijn volledig gehomogeniseerd.
Opmerking: plak de buis, Controleer de homogenaten om ervoor te zorgen dat er geen stolsels in de homogenaten zijn en dat de weefsels in de buis volledig worden gehomogeniseerd. Alle monster behandelingen moeten op ijs worden uitgevoerd. - Neem 10 μL van elk gehomogeniseerd monster in een nieuwe buis voor meting van de eiwit inhoud. Houd de monsters voor de eiwit meting op ijs.
Opmerking: de proteïne monsters kunnen worden bevroren en opgeslagen bij-80 °C voor latere analyse. De eiwit concentraties dienen als een interne parameter voor het normaliseren van citraatsynthase-activiteiten. - Voeg 400 μL ijskoude extractiebuffer toe aan elk resterend monster om een totaal volume van 500 μL te maken. Meng goed door zachtjes op en neer te pipetteren ten minste 5x, waardoor de ballonvorming wordt vermeden. Voeg voor elke reactie 1 μL verdund cellysaat toe aan 150 μL van de vers bereide reactie oplossing (20 mM tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM DTNB, 0,3 mM acetyl CoA, 1 mM oxaloazijnzuur). Meng grondig en onmiddellijk door het zachtjes pipetteren, het vermijden van Bubble vorming. Meet de extinctie bij 412 nm elke 10-30 s gedurende 4 minuten bij 25 °C met behulp van een plaat lezer die bij een minimum interval van 10 sec. de extinctie kan meten bij 412 nm.
Opmerking: Wijzig de punt voordat u een ander reagens Pipetteer en Vermijd het vormen van bubbels in de putjes. Onvolledige menging van de reagentia kan variaties in de metingen veroorzaken. De Citraatsynthase-activiteit test moet worden uitgevoerd bij kamertemperatuur onmiddellijk nadat de monsters zijn verzameld, omdat deze test wordt gebruikt om de intacte mitochondriale massa te kwantificeren. De reactiebuffer moet onmiddellijk voor gebruik worden bereid en mag niet worden opgeslagen. - Plot gegevens als optische dichtheid (OD) extinctie (ABS) (Y-as) versus tijd (in minuten) (X-as). Bereken vervolgens de helling voor het lineaire gedeelte van de curve, waarbij de reactiesnelheid
Verdeel de waarde door de eiwitconcentratie van het monster om de citraat synthase-activiteit te normaliseren. De citraat synthase-activiteit wordt berekend als
Opmerking: de eiwitconcentratie van het monster kan worden gemeten met een eiwit concentratiekit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 geeft een voorbeeld van de kinetische curven voor de OD-extinctie bij 412 nm na verloop van tijd verkregen met behulp van de Citraatsynthase-activiteit colorimetrische assay om het Drosophila thorax-weefsel te meten homogeneert van verschillende genotypes. Het is bekend dat PGC-1α een Master regulator is van de mitochondriale biogenese. PGC-1α is functioneel bewaard tussen Drosophila en mensen. Drosophila RNF34 (dRNF34) is een E3 ubiquitine ligase voor Drosophila PGC-1Α, DPGC-1, en bevordert DPGC-1 eiwit degradatie17. Transmissie elektronenmicroscopie en mitochondriaal DNA qPCR hebben aangetoond dat knockdown van dRNF34 in Drosophila spier mitochondriale inhoud verhoogt, die wordt onderdrukt door de knockdown van DPGC-117. Op basis van deze resultaten veronderstellen we dat knockdown van dRNF34 in Drosophila spier mitochondriale citraat synthase activiteit zou verhogen, die moet worden omgekeerd door de knockdown van DPGC-1. Inderdaad, met behulp van de colorimetrische assay van citraat synthase activiteit hier beschreven, vonden we dat knockdown van dRNF34 in Drosophila spier verhoogde mitochondriale citraat synthase activiteit, die werd omgekeerd door de knockdown van DPGC-1. Specifiek met behulp van de hier beschreven methode werd voor elke assay een initiële lineaire enzymatische snelheid vastgesteld (Figuur 1). De trendlijnen met hun formules en determinatiecoëfficiënt (R2) worden weergegeven in de grafiek (Figuur 1). De hellingen van de trendlijnen vertegenwoordigen de maximale reactiesnelheden, die equivalenten zijn van de maximale citraat synthase-activiteiten van de verschillende genotypes. De pistes voor de verschillende genotypen zijn verschillend (Figuur 1). De determinatiecoëfficiënt ligt dichter bij 1; de formules van de trendlijnen zijn betrouwbaarder. De eiwitconcentratie genormaliseerd maximale citraat synthase activiteiten van verschillende genotypen werden berekend uit de Figuur 1 gegevens (Figuur 2). De maximale citraat synthase activiteit van vlieg thoraxes met spier-specifieke dRNF34 knockdown verhoogd, die werd omgekeerd door spier-specifieke dPGC-1 knockdown (Figuur 2).
Figuur 1: een voorbeeld van de kinetische curven voor de colorimetrische assay van citraat synthase-activiteit. De volwassen Fly thorax homogeniteert (a) 24B-Gal4 > + (b) 24b-GAL4 > dRNF34RNAi (II), en (c) 24B-Gal4 ≫ DRNF34RNAi (II), DPGC-1rnai werden onderworpen aan de colorimetrische assay van citraatsynthase-activiteit. De horizontale assen representeren de reactietijden en de verticale assen vertegenwoordigen OD-absorptie bij 412 nm. Voor elk genotype werd een lineair enzymatische snelheid vastgesteld. De trendlijnen zijn getekend en de formules en R2 van de trendlijnen worden weergegeven in de grafiek. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: de maximale citraat synthase-activiteiten berekend op basis van de kinetische curven en genormaliseerd door de eiwitconcentratie. De maximale citraat synthase activiteit van vlieg thoraxes met muscle-specifieke dRNF34 knockdown verhoogd, die werd omgekeerd door spier-specifieke dPGC-1 knockdown. Alle gegevens worden weergegeven als gemiddelden ± SEM (*p < 0,01, door ANOVA-test, en tukey's test voor meervoudige vergelijkingen, n = 3, 10 thoraxes per replicaat). Dit cijfer wordt gewijzigd van Wei et al.17. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metabole studies met Drosophila als model moeten rekening houden met de genetische achtergrond, voeding en voorraad onderhoud van de vliegen18. Om de effecten van verschillende genetische achtergronden op de meting van citraat synthase activiteit te voorkomen, moeten verschillende stammen van Drosophila gedurende 10 generaties worden teruggestoken naar de controlestam. De genetische achtergrond van alle Drosophila stammen gebruikt in onze experimenten is w1118, dus we gebruikten w1118 als een controle. Over het algemeen denken we dat w1118 een goede controle is, want het is de genetische achtergrond voor de meeste Drosophila stammen en is veel gemakkelijker te backcross dan Canton-S. Het voedings-en voorraad onderhoud moet exact hetzelfde zijn voor alle experimentele groepen. In onze experimenten worden vliegen normaalgesproken gehandhaafd op 25 °C en 50-60% relatieve vochtigheid. De monster voorbereidingsstap moet ook met voorzichtigheid worden uitgevoerd. De kruisingen die zijn ingesteld voor het experiment moeten op een vergelijkbare en geschikte schaal zijn. Voor het opzetten van een kruis, 3-4 vrouwelijke Maagd volwassen vliegen worden gehouden met 2-3 mannelijke volwassen vliegt in een 4 cm diameter, 15 cm hoge injectieflacon geleverd met vers voedsel. Het voedsel recept kan variëren (bijv. vetrijke voeding, normaal dieet, hoog suiker dieet), afhankelijk van het experimentele ontwerp. Twee dagen later wordt de ouder generatie van vliegen overgebracht naar een nieuwe injectieflacon met vers voedsel. De verzorging van de in het eten uitgekomen larven omvat het toevoegen van wat water indien nodig. Wanneer de kinderlijke generatie vliegen begint te uitkomen, worden de flacons elke 24 uur omgedraaid, worden de vliegen van het gewenste genotype verzameld in een nieuwe injectieflacon voor het experiment, en wordt de datum van het luik van de vliegen op elke injectieflacon gemarkeerd. Ongeveer 20-30 verzamelde vliegen van hetzelfde genotype, geslacht en leeftijd worden in een flesje met voedsel bewaard. De verzamelde vliegen moeten worden overgebracht naar verse flesjes met passende voedsel om de twee dagen totdat de experimenten worden uitgevoerd. Om het effect van leeftijd op Citraatsynthase-activiteit te voorkomen, moeten de vliegen van de verschillende geteste groepen op dezelfde dag uitkomen. Daarnaast moet het geslacht van de vliegen worden geëvenaard. Meestal is de lichaamsgrootte van vrouwtjes groter dan die van mannetjes, dus de eiwitconcentratie van vrouwelijke lichamen is hoger dan die van mannelijke lichamen.
De Citraatsynthase-activiteitstest kan ook worden gebruikt voor het meten van de citraat synthase-activiteit in larven. Daartoe kan elk monster uit vijf zwervende derde instar larven bestaan. De derde instar larven kunnen worden onderscheiden door een donker oranje ring op het puntje van hun posterieure spiracles, die ontbreekt of zwak aanwezig is in de tweede instar larven.
In stap 6 kunnen de verdunnings verhoudingen van de monsters voor verschillende monsters verschillen. Voor de monsters die eerst worden gemeten, moeten verschillende verdunnings verhoudingen worden beproefd om een geschikte verdunningsverhouding te bepalen om een lineair enzymatische snelheid in de test vast te stellen. De totale meet tijd voor de maximale enzymactiviteit die een lineair enzymatische snelheid in de test vaststelt, varieert afhankelijk van de enzym-substraat verhouding. Als het substraat extreem overgedoseerd is in vergelijking met het enzym, bereikt de enzymactiviteit of de reactiesnelheid maximaal, waardoor de vaststelling van een lineair enzymatische snelheid in de assay mogelijk is. Naarmate de reactie doorgaat, neemt de hoeveelheid van het substraat af en vertraagt de enzymactiviteit of de reactiesnelheid. Als een lineaire enzymatische snelheid niet kan worden uitgezet, wat betekent dat het substraat niet overgedoseerd is ten opzichte van het enzym, Verdun het weefsel verder met een reactie oplossing of verkort de intervaltijd voor de 412 nm-metingen totdat een lineair enzymatische tarief plot Vastgesteld. De intervaltijd voor de 412 nm-meting mag niet meer dan 30 s zijn. De duur van de 412 nm-meting is gebaseerd op de reactiesnelheid en-tijd. De meting van de spectrofotometer moet stoppen wanneer er geen verdere kleurverandering wordt waargenomen voor alle reacties.
De Citraatsynthase-activiteit kan worden genormaliseerd door de eiwitconcentratie van het monster, het verse gewicht van het monster of het celnummer. Het verse gewicht van het monster kan worden gemeten vóór homogeniseren zoals in stap 3. Het celnummer kan ook worden gebruikt om het lysaat van gekweekte cellen te normaliseren, maar de cellen moeten volledig lysed zijn. DNA-inhoud is geen goede optie voor een interne controle, omdat de DNA-extractieprocedure variaties in de monsters kan introduceren, met name voor monsters die een kleine hoeveelheid DNA bevatten.
Als na de reactie geen kleurverandering wordt waargenomen, kunnen verschillende stappen voor probleemoplossing worden genomen:
1. Controleer de monster voorbereidingsstap, zorg ervoor dat de monsters goed worden verwerkt, houd de monsters op ijs en Vermijd meerdere vries-dooi cycli.
2. Probeer een hogere eiwitconcentratie te gebruiken, omdat sommige monsters veel lagere uitdrukkings niveaus van citraat synthase kunnen hebben die niet detecteerbaar zijn door de Citraatsynthase-activiteitstest.
3. Merk op dat sommige in de handel verkrijgbare Kits voor citraat synthase activity assay niet kunnen worden gebruikt voor Drosophila, omdat deze kits de mitochondriale citraat synthase-activiteit bepalen op basis van immunocapture van zoogdier citraat synthase en het zoogdier citraat synthase-antilichaam de Drosophila citraat synth
Evenzo, als er een discrepantie tussen de monsters:
1. Zorg ervoor dat er geen bubbels in de putjes zitten.
2. Controleer of dit wordt veroorzaakt door een slechte pipetteertechniek.
In tegenstelling tot het meten van citraat synthase activiteit door een colorimetrische assay in gezuiverde mitochondriën, die vereist bijna 200 vliegen voor de zuivering van de mitochondriën van elk genotype19, presenteren we een protocol voor een snelle en eenvoudige assay voor het meten van citraat synthase activiteit door een colorimetrische methode in weefsel homogenaat of in hele celextracten16 Voor elk monster zijn slechts tien vliegen die op dezelfde dag uitkomen, nodig; voor monsters van elk genotype zijn 30 vliegen nodig. Het beschreven protocol is niet alleen van toepassing op Drosophila , maar ook op andere systemen, zoals gekweekte cellen en weefsels van zoogdieren.
Naast de Citraatsynthase-activiteitstest kunnen andere methoden worden gebruikt om de mitochondriale massa te kwantificeren. Vergeleken met andere veelgebruikte kwantitatieve methoden van mitochondriën, zoals het meten van het mitochondriale DNA-gehalte door qPCR en kwantificering van mitochondriale eiwitten door westerse blotting, die alle mitochondriën detecteren ongeacht hun functie, wordt de Citraatsynthase-activiteitstest gebruikt om de aanwezigheid van intacte mitochondriale massa te kwantificeren. In tegenstelling tot de mitochondriale Ademhalings test, die mitochondriale zuivering en gespecialiseerde assay-apparatuur16nodig heeft, stelt de citraat synthase activity assay onderzoekers in staat om snelle metingen uit te voeren door spectrofotometrie met eenvoudige monstervoorbereiding, zoals het hele celextract of weefselhomogenaat, en geen behoefte aan mitochondriale isolatie. De Citraatsynthase-activiteitstest is dus een snelle en economische assay voor de kwantificering van intacte mitochondriale massa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de subsidies van de National Natural Science Foundation of China (31401013 en 31471010), de Science and Technology Commission van Shanghai Municipality, Shanghai Pujiang programma (14PJ1405900), en Natural Science Foundation van Shanghai (19ZR1446400).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Pellet pestle | Sangon | F619072 | |
| Pellet pestle motor | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Plate reader | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Assay kit | Beyotime | P0010S | |
| Scissors | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
References
- Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans. Cell. 157 (4), 897-909 (2014).
- Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (4), 1453-1466 (2015).
- Oxenoid, K., et al.
- Hekimi, S., Wang, Y., Noe, A. Mitochondrial ROS and the Effectors of the Intrinsic Apoptotic Pathway in Aging Cells: The Discerning Killers! Frontiers in Genetics. 7, 161 (2016).
- Kim, H. E., et al. Lipid Biosynthesis Coordinates a Mitochondrial-to-Cytosolic Stress Response. Cell. 166 (6), 1539-1552 (2016).
- Wang, Y., Hekimi, S. Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot. Science. 350 (6265), 1204-1207 (2015).
- Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson's model. Cell Death & Disease. 5, e984 (2014).
- Tronstad, K. J., et al. Regulation and quantification of cellular mitochondrial morphology and content. Current Pharmaceutical Design. 20 (35), 5634-5652 (2014).
- Wiegand, G., Remington, S. J. Citrate synthase: structure, control, and mechanism. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).
- Lopez-Lluch, G., et al. Calorie restriction induces mitochondrial biogenesis and bioenergetic efficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (6), 1768-1773 (2006).
- MacInnis, M. J., et al. Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work. Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).
- Gillen, J. B., et al. Twelve Weeks of Sprint Interval Training Improves Indices of Cardiometabolic Health Similar to Traditional Endurance Training despite a Five-Fold Lower Exercise Volume and Time Commitment. PLoS One. 11 (4), e0154075 (2016).
- Mukherjee, S., Basar, M. A., Davis, C., Duttaroy, A. Emerging functional similarities and divergences between Drosophila Spargel/dPGC-1 and mammalian PGC-1 protein. Frontiers in Genetics. 5, 216 (2014).
- Mukherjee, S., Duttaroy, A. Spargel/dPGC-1 is a new downstream effector in the insulin-TOR signaling pathway in Drosophila. Genetics. 195 (2), 433-441 (2013).
- Diop, S. B., et al. PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase. Cell Reports. 10 (9), 1572-1584 (2015).
- Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).
- Wei, P., et al. RNF34 modulates the mitochondrial biogenesis and exercise capacity in muscle and lipid metabolism through ubiquitination of PGC-1 in Drosophila. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50 (10), 1038-1046 (2018).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Bosco, G., et al. Effects of oxygen concentration and pressure on Drosophila melanogaster: oxidative stress, mitochondrial activity, and survivorship. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 88 (4), 222-234 (2015).
