Summary
Vi præsenterer en protokol for en kolorimetrisk analyse af citrat syntase aktivitet til kvantificering af intakt mitokondrie masse i Drosophila væv homogenater.
Abstract
Mitokondrier spiller de mest fremtrædende roller i cellulære metabolisme ved at producere ATP gennem oxidativ fosforylering og regulere en række fysiologiske processer. Mitokondriel dysfunktion er en primær årsag til en række metaboliske og neurodegenerative sygdomme. Intakt mitokondrier er afgørende for deres korrekte funktion. Enzym citrat syntase er lokaliseret i mitokondrie matrix og kan således anvendes som en kvantitativ enzym markør af intakt mitokondriel masse. I betragtning af at mange molekyler og veje, der har vigtige funktioner i mitokondrier er meget bevaret mellem mennesker og Drosophila, og at en række stærke genetiske værktøjer er tilgængelige i Drosophila, Drosophila fungerer som et godt model system til at studere mitokondrie funktion. Her præsenterer vi en protokol for hurtig og enkel måling af citrat syntase aktivitet i vævs homogenatet fra voksne fluer uden at isolere mitokondrier. Denne protokol er også egnet til måling af citrat syntase aktivitet i larver, dyrkede celler og pattedyrs væv.
Introduction
Mitokondrier er bedst kendt som de Power-producerende organeller i de fleste Eukaryote organismer, der producerer energi valutaen, ATP, gennem tricarboxylsyre cyklus (dvs., krebs cyklus) og oxidativ fosforyl. Mitokondrier er også fundet for at spille vigtige roller i en masse andre fysiologiske processer, såsom regulering af apoptose1, ca2 + homøostase2,3,reaktive oxidations arter (ros) generation4, ogendoplasmatiske reticulum (er)-stress respons5. Mitokondriel dysfunktion kan påvirke ethvert organ i kroppen i alle aldre og er en primær årsag til metaboliske, aging-relaterede6, og neurodegenerative sygdomme7. Intakte mitokondrier er mekanisk relateret til mitokondrie funktion. Således korrekt kvantificering af intakt mitokondrie masse er meget vigtigt for evaluering mitokondrie funktion8. Citrat syntase, en sats-begrænsende enzym i første trin af tricarboxylsyre cyklus9, er lokaliseret i mitokondrie matrix inden for eukaryote celler, og dermed kan bruges som en kvantitativ markør for tilstedeværelsen af intakt mitokondrie masse9,10. Citrat syntase-aktivitet kan også anvendes som normaliseringsfaktor for intakte mitokondrielle proteiner11,12.
Frugten flue, Drosophila melanogaster, er et glimrende model system til at studere mitokondrie funktion, så mange molekyler og veje, der spiller centrale roller i mitokondrier er evolutionært bevaret fra Drosophila til mennesker13,14,15. Her præsenterer vi en protokol for en hurtig og enkel metode til måling af citrat syntase aktivitet ved en kolorimetrisk analyse i Drosophila væv-homogenater16 i en 96 brønd plade format. I citrat syntase aktivitetsanalyse, citrat syntase i Drosophila væv homogenatet katalyserer reaktionen af oxaloacetat med acetyl coenzym A (acetyl COA) til dannelse af citrat COA-sh og H+. CoA-SH reagerer efterfølgende med 5,5 '-dithiobis-(2-nitrobenzoesyre) (DTNB) for at frembringe et farvet produkt, 2-Nitro-5-thiobenzoat (TNB), som let kan måles spektrofotometrisk ved 412 nm. Citrat syntase aktivitet kan afspejles af hastigheden af farveproduktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. colorimetrisk citrat syntase-Aktivitetsanalyse for D. melanogaster16
- Saml ti voksne fluer for hver prøve. Indsamle mindst tre eksemplarer af prøverne for hver genotype.
- Der forberedes 500 μL iskold ekstraktions buffer indeholdende 20 mM HEPES (pH = 7,2), 1 mM EDTA og 0,1% Triton X-100 i et 1,5 mL-prøveglas til hver prøve.
- Anesthetize voksne fluer med CO2 på en anæstesi pad og isolere det ønskede væv. For at isolere de voksne flyve thorakler, for eksempel, fastsætte flue thorakserne ved et par tang, og derefter isolere flue mave ved at skære langs grænsen af thorax og maven ved hjælp af et par saks. Saml flyve thorakserne for muskel citrat syntase aktivitetsanalyse.
Bemærk: Bestem den friske vægt af vævet på dette trin, hvis du bruger det til at normalisere citrat syntase aktivitet. - Overfør 10 voksne flyve thorakser til 100 μL iskold ekstraktions buffer med det samme og homogeniser med en Pestle på is. For at holde prøverne iskold, homogenisere prøverne til 5-10 s på is, så har prøverne sidde på is for 5 s, og Gentag, indtil alle væv i røret er homogeniseret fuldstændigt.
Bemærk: tape røret, Kontroller homogenaterne for at sikre, at der ikke er blodpropper i homogenaterne, og at vævet i røret er homogeniseret fuldstændigt. Alle prøve behandlinger skal udføres på is. - Der udtages 10 μL af hver homogeniseret prøve i et nyt rør til måling af proteinindhold. Opbevar prøverne til protein måling på is.
Bemærk: protein prøverne kan fryses og opbevares ved-80 °C til senere analyse. Protein koncentrationerne fungerer som en intern parameter for normalisering af citrat syntase aktiviteter. - Der tilsættes 400 μL iskold ekstraktions buffer til hver resterende prøve for at lave et samlet rumfang på 500 μL. Bland godt ved forsigtigt pipettering op og ned mindst 5x, undgå bobledannelse. For hver reaktion tilsættes 1 μL fortyndet celle lysat til 150 μL af den frisk tilberedte reaktions opløsning (20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM DTNB, 0,3 mM acetyl CoA, 1 mM oxaloeddikesyre). Bland grundigt og straks ved forsigtigt pipettering, undgå bobledannelse. Absorbansen måles ved 412 nm hver 10-30 s i 4 min ved 25 °C ved hjælp af en plade læser, der kan måle absorbans ved 412 nm med minimum intervaller på 10 s.
Bemærk: Skift spidsen før Pipettering af en anden reagens, og undgå at danne bobler i brøndene. Ufuldstændig blanding af reagenserne kan medføre variationer i målingerne. Analysen af citrat syntase-aktiviteten skal foretages ved stuetemperatur umiddelbart efter, at prøverne er indsamlet, da denne analyse anvendes til at kvantificere intakt mitokondriel masse. Reaktions bufferen skal tilberedes umiddelbart før brug og må ikke opbevares. - Afbild data som optisk densitet (OD) absorbans (ABS) (Y-akse) versus tid (i minutter) (X-akse). Derefter beregnes hældningen for den lineære del af kurven, hvor reaktionshastigheden
Dividerer værdien med prøve proteinkoncentrationen for at normalisere citrat syntase-aktiviteten. Citrat syntase-aktiviteten beregnes som
Bemærk: prøve proteinkoncentrationen kan måles ved hjælp af et protein koncentrations Analysesæt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 præsenterer et eksempel på de kinetiske kurver for OD absorbans ved 412 nm over tid opnået ved hjælp af citrat syntase aktivitet kolorimetrisk assay til måling af Drosophila thorax vævs homogenater af forskellige genotyper. Det er velkendt, at PGC-1α er en Master regulator af mitokondrie Biogenesis. PGC-1α er funktionelt bevaret mellem Drosophila og mennesker. Drosophila RNF34 (dRNF34) er en E3 ubiquitin ubiquitinligase til Drosophila PGC-1Α, dpgc-1, og fremmer dpgc-1 protein nedbrydning17. Transmission elektronmikroskopi og mitokondrie DNA qPCR har vist, at Knockdown af dRNF34 i Drosophila muskel øger mitokondriel indhold, som er undertrykt af Knockdown af dpgc-117. Baseret på disse resultater vi hypotese, at Knockdown af dRNF34 i Drosophila muskel ville øge mitokondrie citrat syntase aktivitet, som bør vendes ved Knockdown af dpgc-1. Faktisk, ved hjælp af den kolorimetriske assay af citrat syntase aktivitet beskrevet her, vi fandt, at Knockdown af dRNF34 i Drosophila muskel øget mitokondrie citrat syntase aktivitet, som blev vendt ved Knockdown af dpgc-1. Specifikt ved hjælp af den beskrevne metode blev der fastsat en Initial lineær enzymatisk hastighed for hver analyse (figur 1). Tendensen linjer med deres formler og koefficient for bestemmelse (R2) er vist i grafen (figur 1). Skråningerne af tendenslinjerne repræsenterer de maksimale reaktions rater, som svarer til de forskellige Geno typers maksimale citrat syntase-aktiviteter. Skråningerne for de forskellige genotyper er forskellige (figur 1). Bestemmelses koefficienten er tættere på 1; formlerne på Trend linjerne er mere pålidelige. Proteinkoncentrationen normaliseret maksimal citrat syntase aktiviteter af forskellige genotyper blev beregnet ud fra figur 1 data (figur 2). Den maksimale citrat syntase aktivitet af flyve thorakser med muskel-specifikke dRNF34 Knockdown steg, som blev vendt af muskel-specifikke dPGC-1 Knockdown (figur 2).
Figur 1: et eksempel på de kinetiske kurver for den kolorimetriske analyse af citrat syntase-aktiviteten. Den voksne flue thorax-homogenater af (a) 24b-Gal4 > + (b) 24b-Gal4 > (II), og (c) 24b-Gal4 > dRNF34RNAi (II), dpgc-1rnai blev underkastet den kolorimetriske assay af citrat syntase aktivitet. De vandrette akser repræsenterer reaktionstider, og de lodrette akser repræsenterer OD-absorbanser ved 412 nm. Der blev fastsat en lineær enzymatisk hastighed for hver genotype. Tendensen linjer blev trukket og formlerne og R2 af tendensen linjer er vist i grafen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: de maksimale citrat syntase-aktiviteter beregnet ud fra de kinetiske kurver og normaliseret ved proteinkoncentration. Den maksimale citrat syntase aktivitet af flyve thorakser med muskel-specifikke dRNF34 Knockdown steg, som blev vendt af muskel-specifikke dPGC-1 Knockdown. Alle data er repræsenteret som betyder ± SEM (*p < 0,01, ved ANOVA test, og tukey's test for flere sammenligninger, n = 3, 10 thorakser per replikat). Dette tal er modificeret fra Wei et al.17. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metaboliske undersøgelser ved hjælp af Drosophila som model skal tage hensyn til den genetiske baggrund, kost, og lager vedligeholdelse af fluer18. For at undgå virkningerne af forskellige genetiske baggrunde på målingen af citrat syntase aktivitet, bør forskellige stammer af Drosophila tilbageføres til kontrol stamme for 10 generationer. Den genetiske baggrund af alle Drosophila stammer, der anvendes i vores eksperimenter er w1118, så vi brugte w1118 som en kontrol. Generelt tror vi w1118 er en god kontrol, da det er den genetiske baggrund for de fleste Drosophila stammer og er meget lettere at backcross end Canton-S. Kosten og bestanden vedligeholdelse skal være nøjagtig den samme for alle de eksperimentelle grupper. I vores eksperimenter vedligeholdes fluer normalt ved 25 °C og 50-60% relativ luftfugtighed. Prøve forberedelses trinnet skal også udføres med forsigtighed. De krydsninger, der er oprettet for forsøget, skal være i en tilsvarende og passende skala. For at oprette et kors, 3-4 kvindelige jomfru voksne fluer holdes med 2-3 mandlige voksne fluer i en 4 cm diameter, 15 cm høj hætteglas leveres med frisk mad. Maden opskrift kan variere (f. eks, højt fedtindhold kost, normal kost, høj sukker kost), afhængigt af den eksperimentelle design. To dage senere overføres forældregenerationen af fluer til et nyt hætteglas med frisk mad. Omsorg for larverne klækket i fødevarer omfatter tilføje noget vand, hvis det er nødvendigt. Når den filial generation af fluer begynder at luge, er hætteglassene vendt hver 24 h, fluerne af den ønskede genotype opsamles i et nyt hætteglas til forsøget, og lugen dato for fluerne er markeret på hvert hætteglas. Ca. 20-30 indsamlede fluer af samme genotype, køn og alder holdes i et hætteglas med mad. De indsamlede fluer skal overføres til friske hætteglas med passende mad hver anden dag, indtil eksperimenterne er udført. For at undgå effekten af alder på citrat syntase aktivitet, skal fluer af de forskellige testede grupper luge på samme dag. Desuden bør det køn af fluerne matches. Normalt kropsstørrelse af kvinder er større end for mænd, således proteinkoncentrationen af kvindelige kroppe er højere end for mandlige kroppe.
Analysen af citrat syntase-aktiviteten kan også anvendes til måling af citrat syntase-aktiviteten i larverne. Til dette formål kan hver prøve bestå af fem omvandrende tredje INSTAR larver. Den tredje INSTAR larver kan skelnes ved en mørk orange ring på spidsen af deres posterior Spirakler, som mangler eller er svagt til stede i den anden INSTAR larver.
I trin 6 kan fortyndingsforholdet for prøverne variere for forskellige prøver. For de prøver, der først måles, skal flere fortyndingsforhold prøves for at bestemme et passende fortyndingsforhold for at fastslå en lineær enzymatisk hastighed i analysen. Den samlede måle tid for den maksimale enzymaktivitet, der etablerer en lineær enzymatisk hastighed i analysen, varierer afhængigt af enzym substrat forholdet. Hvis substratet er ekstremt overdoseret i forhold til enzymet, så når enzymaktiviteten eller reaktionshastigheden maksimalt, hvilket gør det muligt at etablere en lineær enzymatisk hastighed i analysen. Som reaktionen fortsætter, falder mængden af substratet, og enzymaktiviteten eller reaktionshastigheden sænkes. Hvis en lineær enzymatisk hastighed ikke kan afbildes, hvilket betyder, at substratet ikke er overdoseret i forhold til enzymet, fortyndes yderligere vævet homogenater med reaktions opløsning eller forkorter intervaltiden for 412 nm-målingerne, indtil et lineært enzymatisk sats plot er Etableret. Intervallet tid for 412 nm læsning bør ikke være mere end 30 s. Varigheden af 412 nm-aflæsning er baseret på reaktionshastigheden og tiden. Spektrofotometrets aflæsning bør ophøre, når der ikke observeres yderligere farveændringer for alle reaktioner.
Citrat syntase-aktiviteten kan normaliseres ved prøve proteinkoncentrationen, prøve frisk vægt eller celle nummer. Prøven frisk vægt kan måles før homogenisering som i trin 3. Celle nummeret kan også bruges til at normalisere lysbilledet af dyrkede celler, men cellerne skal være helt lysed. DNA-indhold er ikke en god mulighed for en intern kontrol, da DNA-ekstraktions proceduren kan indføre variationer i prøverne, især for prøver, der indeholder en lille mængde DNA.
Hvis der ikke observeres nogen farveændring efter reaktionen, kan der tages flere forskellige fejlfindingstrin:
1. Kontroller prøve forberedelses trinnet, Sørg for at håndtere prøverne korrekt, Opbevar prøverne på is, og undgå flere fryse-tø cyklusser.
2. Prøv at bruge en højere proteinkoncentration, fordi nogle prøver kan have meget lavere ekspressionsniveauer af citrat syntase, som ikke kunne påvises ved citrat syntase-aktivitets analysen.
3. Bemærk, at nogle kommercielt tilgængelige kits til citrat syntase-aktivitetsanalyse ikke kan anvendes til Drosophila, fordi disse kits afgør mitokondrie citrat syntase aktivitet baseret på immunocapture af pattedyrs citrat syntase og pattedyrs citrat syntase antistof kan ikke genkende Drosophila citrat syntase.
Ligeledes, hvis der er en uoverensstemmelse mellem prøverne:
1. Sørg for, at der ikke er bobler i brøndene.
2. Undersøg, om dette skyldes dårlig pipetteringsteknik.
I modsætning til måling af citrat syntase aktivitet ved en kolorimetrisk analyse i renset mitochondrier, som kræver næsten 200 fluer til rensning af mitokondrier af hver genotype19, præsenterer vi en protokol for en hurtig og enkel analyse til måling af citrat syntase aktivitet ved en kolorimetrisk metode i vævs homogenatet eller i hele celleekstrakter16. For hver prøve er der kun behov for ti fluer, der er klækket samme dag. for triplicatprøver af hver genotype er der behov for 30 fluer. Den beskrevne protokol gælder ikke kun for Drosophila , men også for andre systemer, såsom dyrkede celler og pattedyrs væv.
Udover citrat syntase aktivitetsanalyse, andre metoder kan anvendes til at kvantificere mitokondrie masse. Sammenlignet med andre almindeligt anvendte kvantitative metoder til mitokondrier, såsom måling af mitokondrie DNA-indhold ved qPCR og kvantificering af mitokondrie proteiner ved Western blotting, som detekterer alle mitokondrier uanset deres funktion, anvendes citrat syntase aktivitets analysen til at kvantificere tilstedeværelsen af intakt mitokondriel masse. I modsætning til mitokondrie respiration assay, som kræver mitokondriel rensning og specialiseret analyseudstyr16, giver citrat syntase aktivitets analysen forskerne mulighed for at udføre hurtige målinger ved spektrofotometri med simpel prøveforberedelse, såsom hel celle ekstrakt eller vævs homogenat, og intet behov for mitokondriel isolation. Citrat syntase-aktivitets analysen er således en hurtig og økonomisk analyse til kvantificering af intakt mitokondriel masse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskuddene fra National Natural Science Foundation i Kina (31401013 og 31471010), videnskabs-og teknologi Kommissionen i Shanghai kommune, Shanghai Pujiang program (14PJ1405900), og Natural Science Foundation of Shanghai (19ZR1446400).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Pellet pestle | Sangon | F619072 | |
| Pellet pestle motor | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Plate reader | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Assay kit | Beyotime | P0010S | |
| Scissors | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
References
- Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans. Cell. 157 (4), 897-909 (2014).
- Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (4), 1453-1466 (2015).
- Oxenoid, K., et al.
- Hekimi, S., Wang, Y., Noe, A. Mitochondrial ROS and the Effectors of the Intrinsic Apoptotic Pathway in Aging Cells: The Discerning Killers! Frontiers in Genetics. 7, 161 (2016).
- Kim, H. E., et al. Lipid Biosynthesis Coordinates a Mitochondrial-to-Cytosolic Stress Response. Cell. 166 (6), 1539-1552 (2016).
- Wang, Y., Hekimi, S. Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot. Science. 350 (6265), 1204-1207 (2015).
- Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson's model. Cell Death & Disease. 5, e984 (2014).
- Tronstad, K. J., et al. Regulation and quantification of cellular mitochondrial morphology and content. Current Pharmaceutical Design. 20 (35), 5634-5652 (2014).
- Wiegand, G., Remington, S. J. Citrate synthase: structure, control, and mechanism. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).
- Lopez-Lluch, G., et al. Calorie restriction induces mitochondrial biogenesis and bioenergetic efficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (6), 1768-1773 (2006).
- MacInnis, M. J., et al. Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work. Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).
- Gillen, J. B., et al. Twelve Weeks of Sprint Interval Training Improves Indices of Cardiometabolic Health Similar to Traditional Endurance Training despite a Five-Fold Lower Exercise Volume and Time Commitment. PLoS One. 11 (4), e0154075 (2016).
- Mukherjee, S., Basar, M. A., Davis, C., Duttaroy, A. Emerging functional similarities and divergences between Drosophila Spargel/dPGC-1 and mammalian PGC-1 protein. Frontiers in Genetics. 5, 216 (2014).
- Mukherjee, S., Duttaroy, A. Spargel/dPGC-1 is a new downstream effector in the insulin-TOR signaling pathway in Drosophila. Genetics. 195 (2), 433-441 (2013).
- Diop, S. B., et al. PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase. Cell Reports. 10 (9), 1572-1584 (2015).
- Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).
- Wei, P., et al. RNF34 modulates the mitochondrial biogenesis and exercise capacity in muscle and lipid metabolism through ubiquitination of PGC-1 in Drosophila. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50 (10), 1038-1046 (2018).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Bosco, G., et al. Effects of oxygen concentration and pressure on Drosophila melanogaster: oxidative stress, mitochondrial activity, and survivorship. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 88 (4), 222-234 (2015).
