Biochemistry

מטריקה שיטת הצביעה של פעילות ציטראט סינתאז בדרוזופילה מלאנוסטר

Published: January 16, 2020 doi: 10.3791/59454

Ping Wei*¹, Qihong Liu*², Wen Xue², Jiwu Wang²

¹Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai Clinical Center for Diabetes, Shanghai Jiao Tong University Affiliated Sixth People's Hospital, ²Department of Anatomy of Physiology, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

* These authors contributed equally

Summary

אנו מציגים פרוטוקול לצורך שיטת הצביעה של פעילות ציטראט ומטריקה לכימות של מסה מיטוכונדריאלי שלמה ברקמת דרוזוהילה .

Abstract

המיטוa לשחק את התפקידים הבולטים ביותר בחילוף החומרים הסלולר על ידי הפקת ATP באמצעות זרחון חמצוני ויסות מגוון של תהליכים פיזיולוגיים. תפקוד מיטוכונדריאלי הוא הגורם העיקרי של מספר מחלות מטבולית וניווניות. המיטו, שלמים הם קריטיים. לתפקוד התקין שלהם האנזים ציטראט סינתאז מקומי במטריקס מיטוכונדריאלי ולכן ניתן להשתמש בו כסמן אנזים כמותי של מסה מיטוכונדריאלי שלמה. בהינתן כי מולקולות ומסלולים רבים כי יש פונקציות חשובות במיטויום הם שימור מאוד בין בני אדם, Drosophila ילה, וכי מערך של כלים גנטיים רבי-עוצמה זמינים בדרוזוהילה, drosophila ילה משמש מערכת מודל טובה ללימוד תפקוד מיטוכונדריאלי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור מדידה מהירה ופשוטה של פעילות ציטראט סינתאז ברקמות הומואכל מזבובים מבוגרים מבלי לבודד המיטו,. פרוטוקול זה מתאים גם למדידת פעילות ציטראט וסינתאז בזחלים, בתאים מתורבתים וברקמות היונקים.

Introduction

המיטויום הם הידועים ביותר כארגון הפקת כוח ברוב האורגניזמים איקריוטית, אשר מייצרים את מטבע האנרגיה, ATP, דרך מחזור חומצה tricarboxylic (כלומר, מחזור קרבס) וזירחון חמצוני. המיטומטר מצאו גם לשחק תפקידים חשובים הרבה תהליכים פיזיולוגיים אחרים, כגון רגולציה של אפופטוזיס¹, Ca^{2 +} הומאוסטזיס²^,³, מינים חמצון תגובתי (ROS) דור⁴, ו-רשתית פלזמית רשתית (ER)-התגובה הלחץ⁵. תפקוד מיטוכונדריאלי יכול להשפיע על כל איבר בגוף בכל גיל והוא גורם עיקרי של חילוף החומרים, ההזדקנות⁶, מחלות ניווניות⁷. המיטו, שלמים הם המכונה הקשורים לתפקוד מיטוכונדריאלי. לפיכך, כימות נאותה של מסה מיטוכונדריאלי שלם חשוב מאוד להערכת פונקציה מיטוכונדריאלי⁸. ציטראט סינתאז, האנזים הגבלת קצב בשלב הראשון של^{מחזור חומצה}tricarboxylic מקומי מותאם מטריצה מיטוכונדריאלי בתוך התאים איקריוטית, ולכן ניתן להשתמש בתור סמן כמותי לנוכחות של המסה מיטוכונדריאלי שלם⁹^,¹⁰. פעילות ציטראט סינתאז יכולה לשמש גם כגורם נורמליזציה עבור חלבונים מיטוכונדריאלי שלמים¹¹^,¹².

זבוב הפירות, דרוסופילה מלאנוסטר, היא מערכת מודל מעולה לחקר תפקוד מיטוכונדריאלי, כמו מולקולות ומסלולים רבים הפועלים תפקידים מרכזי במיטו, שנשמרים בפועל מדרוסוהילה לבני אדם¹³^,¹⁴^,¹⁵. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשיטה מהירה ופשוטה למדידה של פעילות ציטראט ומדידה באמצעות שיטת הצביעה בשיטת דרוזוהילה הומוכטים¹⁶ בפורמט 96 לצלחת היטב. בתוך שיטת הפעילות הציטראט, הציטראט של העור בדרוזואז , מזרז את התגובה של הקוקלואצטט באמצעות קוקסיל (coa) כדי ליצור את ה-coa הציטראט-SH ו-H⁺. CoA-SH מגיב לאחר מכן 5, 5 '-dithiobis-(2-החומצה בנזועית) (DTNB) כדי ליצור מוצר צבעוני, 2-ניטרו-5-thiobenzoate (TNB), אשר ניתן למדוד בקלות spectrophotometrically ב 412 nm. פעילות ציטראט סינתאז יכול להיות משתקף על ידי שיעור ייצור הצבע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. צביעת מטריקה ציטראט ושיטת הפעילות של ד. מלאנוגסטר¹⁶

לאסוף 10 זבובים מבוגרים עבור כל דוגמה. לאסוף דגימות לפחות טרילקאט עבור כל גנוטיפ.
להכין 500 μL של מאגר החילוץ קר קרח המכיל 20 מ"מ HEPES (pH = 7.2), 1 מ"מ EDTA, ו 0.1% טריטון X-100 במבחנה בתוך 1.5 mL עבור כל מדגם.
מבוגר מורדם זבובים עם CO₂ על משטח הרדמה ולבודד את הרקמות הרצויות. כדי לבודד את התצירים הבוגרים לטוס, למשל, לתקן את הטורצירים לטוס על ידי זוג מלקחיים, ולאחר מכן לבודד את בטנם לעוף על ידי חיתוך לאורך הגבול של בית החזה והבטן באמצעות זוג מספריים. לאסוף את ת'ורקס לטוס עבור השריר שריר ציטראט סטנדרטים הפעילות.
הערה: לקבוע את המשקל הטרי של הרקמה בשלב זה אם להשתמש בו כדי לנרמל את פעילות ציטראט וסטנדרטים.
העברה 10 מבוגרים לטוס thoraxes כדי 100 μl של מאגר החילוץ קר הקרח באופן מיידי והמגון עם כתש על הקרח. כדי לשמור את הדגימות קרח קר, המגון לסדר את הדגימות עבור 5-10 s על הקרח, אז יש את הדגימות לשבת על הקרח עבור 5 s, ולחזור עד שכל הרקמות בצינור הם הומוגניים לחלוטין.
הערה: הקלטת את השפופרת, בדוק את ההומוטים כדי לוודא שאין קרישי דם במגון ושהרקמות בצינור הן הומוגניים לחלוטין. כל הטיפולים לדוגמה צריך להתבצע על קרח.
קח 10 μL של כל מדגם הומוגניים בצינור חדש עבור מדידת תוכן חלבון. שמור את הדגימות. למדידת חלבון על הקרח
הערה: ניתן להקפיא את דגימות החלבון ולאחסנו ב-80 ° c לניתוח מאוחר יותר. ריכוזי החלבון משמשים כפרמטר פנימי לנורמליזציה של פעילויות ציטראט סינתאז.
הוסף 400 μL של מאגר החילוץ קר קרח לכל מדגם שנותר כדי להפוך את הנפח הכולל של 500 μL. Mix היטב על ידי ליטוף בעדינות למעלה ולמטה לפחות 5x, הימנעות היווצרות בועה. עבור כל תגובה, להוסיף 1 μL של תא מדולל ליפוסט כדי 150 μL של פתרון התגובה טרי מוכן (20 מ"מ Tris-HCl (pH 8.0), 0.1 mM DTNB, 0.3 m מילימטר מיקרומטר, 1 מ"מ חומצה אוקאלואצטט). מערבבים ביסודיות ובאופן מיידי על ידי ליטוף בעדינות, הימנעות היווצרות בועה. למדוד את ספיגת ב 412 ננומטר כל 10-30 s עבור 4 דקות ב 25 ° c באמצעות קורא צלחת מסוגל למדוד ספיגת בשנת 412 nm במרווחי זמן מינימלי של 10 s.
הערה: שנה את העצה לפני ליטוף מגיב שונה ולהימנע להרכיב בועות בבארות. ערבוב לא שלם של הריאגנטים עלול לגרום וריאציות במידות. שיטת הפעילות הציטראט הקיימת צריכה להתבצע בטמפרטורת החדר מיד לאחר איסוף הדגימות, מאחר שניתן להשתמש באותה שיטת לכמת מסה מיטוכונדריאלי שלמה. מאגר התגובות צריך להיות מוכן מיד לפני השימוש ולא צריך להיות מאוחסן.
התוויית נתונים כדחיסות אופטית (OD) ספיגת (abs) (ציר Y) לעומת זמן (בדקות) (ציר X). לאחר מכן חשב את השיפוע עבור החלק הליניארי של העקומה, כאשר קצב התגובה מ

לחלק את הערך על ידי ריכוז החלבון לדוגמה כדי לנרמל את הפעילות הציטראט סינתאז. הפעילות הציטראט מחושבת כ

הערה: ניתן למדוד את ריכוז החלבון לדוגמה על-ידי ערכת שיטת ריכוז חלבון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מציג דוגמה של עקומות קינטית לספיגת OD ב 412 ננומטר לאורך זמן שהושג באמצעות היישום המקביל של הפעילות הציטראט למדוד את מדידת הרקמה בבית החזה. ידוע היטב כי PGC-1α הוא וסת מאסטר של biogenesis מיטוכונדריאלי. PGC-1α שימור מבחינה פונקציונלית בין דרוזוהילה ובני אדם. דרוסופילה RNF34 (dRNF34) הוא מהווה E3 אוביקוויב ליגאז עבור drosophila ילה pgc-1α, dpgc-1, ומקדם השפלה חלבון dpgc-1¹⁷. מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים ומיטוכונדריאלי ה-DNA qPCR הראו כי הנוק למטה של dRNF34 ב Drosophila ילה שריר מגביר תוכן מיטוכונדריאלי, אשר מדוכאים על ידי הנוק-אין dPGC-1¹⁷. בהתבסס על התוצאות הללו שיערו כי הנוק של dRNF34 בשריר Drosophila ילה יהיה להגדיל את הפעילות מיטוכונדריזה של סינתסה ציטראט, אשר צריך להיות הפוך על ידי מנוק של dPGC-1. אכן, באמצעות השיטה המטרית הצביעה של פעילות ציטראט סינתז המתואר כאן, מצאנו את הנוק של dRNF34 ב Drosophila שריר גדל מיטוכונדריאני הפעילות הציטראט, אשר התהפך על ידי מנוק של dPGC-1. באופן ספציפי, בשיטה המתוארת כאן, הוקמה שיעור אנזימטי ליניארי ראשוני עבור כל שיטה (איור 1). קווי המגמה עם הנוסחאות ומקדם ההחלטיות שלהם (R²) מוצגים בגרף (איור 1). מדרונות קווי המגמה מייצגים את שיעורי התגובה המקסימלית, המקבילים לפעילות המקסימלית הציטראט הכימית של הגנוטיפים השונים. המדרונות עבור גנוטיפים שונים הם שונים (איור 1). מקדם הנחישות קרוב יותר ל-1; הנוסחאות של קווי המגמה אמינות יותר. ריכוז החלבון המנורמל המקסימלי הציטראט בפעילויות של גנוטיפים שונים חושבו מנתוני איור 1 (איור 2). את הפעילות המקסימלית ציטראט סינתאז של לטוס ת'ורקס עם שרירים ספציפיים dRNF34 למטה גדל, אשר התהפך על ידי השריר ספציפי dPGC-1 הסתרה (איור 2).

איור 1: דוגמה לעקומות הקינטית של האנליזה החיפית של פעילות ציטראט וסינתאז. הבוגר לעוף בית החזה הומוטים של (a) 24B-Gal4 > + (ב) 24b-GAL4 > dRNF34RNAi (ii), ו (ג) 24b-Gal4 ≫ DRNF34RNAi (ii), Dpgc-1rnai היתה נתונה לתוך שיטת הצביעה של פעילות ציטראט וסטנדרטים. הצירים האופקיים מייצגים זמני תגובה והצירים האנכיים מייצגים ספיגת OD ב-412 ננומטר. שיעור אנזימטי ליניארי הוקם עבור כל גנוטיפ. קווי המגמה צוירו והנוסחאות ו-R² של קווי המגמה מוצגים בגרף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: הפעילות המקסימלית הציטראט והמיאותית המחושבת מהעקומות הקינטית והמנורמלות בריכוז החלבונים. את הפעילות המקסימלית ציטראט סינתאז של לטוס ת'ורקס עם שרירים ספציפיים dRNF34 למטה גדל, אשר התהפך על ידי השריר ספציפי dPGC-1 הסתרה. כל הנתונים מיוצגים כאמצעי ± SEM (*p < 0.01, על-ידי מבחן ANOVA, והבדיקה של tukey עבור השוואות מרובות, n = 3, 10 thoraxes לשכפול). דמות זו שונתה מווי ואח '^.17. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מחקרים מטבולית באמצעות Drosophila ילה כמודל חייב לקחת בחשבון את הרקע הגנטי, דיאטה, ותחזוקה של מניות של זבובים¹⁸. כדי למנוע את ההשפעות של רקעים גנטיים שונים על המדידה של פעילות ציטראט סינתז, זנים שונים של דרוסופילה צריך להיות מוצלב למתח שליטה עבור 10 דורות. הרקע הגנטי של כל הזנים Drosophila ילה בשימוש בניסויים שלנו הוא w¹¹¹⁸, אז השתמשנו w¹¹¹⁸ כפקד. באופן כללי, אנו חושבים w¹¹¹⁸ הוא שליטה טובה, כפי שהוא הרקע הגנטי עבור רוב הזנים drosophila ילה והרבה יותר קל לחצות מאשר קנטון-S. הדיאטה ותחזוקת המניה חייבים להיות זהים בדיוק עבור כל הקבוצות הנסיוניות. בניסויים שלנו, זבובים נשמרים בדרך כלל ב 25 ° c ו 50-60% לחות יחסית. יש לבצע גם את שלב ההכנה לדוגמה בזהירות. הצלבים שהוגדרו לניסוי צריכים להיות בקנה מידה דומה ומתאים. כדי להגדיר צלב, 3-4 נקבה בתולה זבובים למבוגרים מוחזקים עם 2-3 מבוגרים גברים זבובים בקוטר 4 ס"מ, 15 ס"מ בקבוקון גבוה שסופקו עם מזון טרי. מתכון מזון יכול להשתנות (למשל, דיאטה גבוהה שומן, דיאטה נורמלית, דיאטה גבוהה סוכר), בהתאם לעיצוב ניסיוני. יומיים לאחר מכן, דור הורים של זבובים מועבר בקבוקון חדש עם מזון טרי. הטיפול בזחלים שבקע במזון כולל הוספת מים במידת הצורך. כאשר דור הדורות של הזבובים מתחיל לבקוע, הבקבוקונים מתהפך כל 24 שעות, הזבובים של גנוטיפ הרצוי נאספים במבחנה חדשה לניסוי, ואת תאריך הקווקוו של הזבובים מסומן על כל בקבוקון. כ 20-30 שנאספו זבובים של אותו גנוטיפ, מין, וגיל נשמרים בבקבוקון עם אוכל. יש להעביר את הזבובים הנאספים לבקבוקונים טריים עם מזון מתאים מדי יומיים, עד לביצוע הניסויים. כדי למנוע את השפעת הגיל על פעילות ציטראט, הזבובים של הקבוצות השונות שנבדקו צריכים לבקוע באותו יום. בנוסף, יש להתאים את מין הזבובים. בדרך כלל גודל הגוף של הנקבות גדול יותר מזה של הזכרים, ולכן ריכוז החלבון של הגופים הנשיים גבוה יותר מזו של גופים זכריים.

ניתן להשתמש באפשרות למדידת הפעילות הציטראט לצורך מדידת הפעילות הציטראט בזחלים. למטרה זו, כל דוגמה יכולה להיות מורכבת מחמישה הזחלים הנודדים השלישי. הזחלים השלישי יכול להיות מובחן על ידי טבעת כתום כהה בקצה נושפות האחוריים שלהם, אשר חסר או חלש נוכח הזחלים השני.

בשלב 6, יחס הדילול של דגימות עשוי להשתנות לדגימות שונות. לדגימות שנמדדות לראשונה, יש לנסות מספר יחסי דילול לקבוע את יחס הדילול המתאים ליצירת קצב אנזימטי ליניארי באופן הפעולה. זמן המדידה הכולל של פעילות האנזים המקסימלית היוצרת שיעור אנזימטי ליניארי באופן שאינו משתנה בהתאם ליחס המצע האנזים. אם המצע הוא ממנת יתר בהשוואה לאנזים, אזי פעילות האנזים או שיעור התגובה מגיעה למקסימלית, המאפשרת הקמת שיעור אנזימטי ליניארי בתוך הצורה. ככל שהתגובה ממשיכה, כמות המצע פוחתת, ופעילות האנזים או קצב התגובה מאיטה. אם לא ניתן להתוות שיעור אנזימטי ליניארי, כלומר, המצע אינו מקבל מנת יתר בהשוואה לאנזים, מדלל עוד יותר את רקמת העור עם פתרון התגובה או מקצר את זמן המרווח לקריאות ה412 ננומטר עד לקבלת מתווה שיעור אנזימטי ליניארי וקמה. הזמן המרווח עבור הקריאה 412 ננומטר לא צריך להיות יותר מ -30 s. משך הקריאה 412 ננומטר מתבסס על קצב וזמן התגובה. קריאת ספקטרוסקופיה צריך להפסיק כאשר לא שינוי צבע נוסף הוא נצפתה לכל התגובות.

ניתן לנרמל את הפעילות הציטראט באמצעות הריכוז של חלבון המדגם, דגימת משקל טרי או מספר תאים. לדוגמה ניתן למדוד משקל טרי לפני ההומוגניזציה כמו בשלב 3. מספר התא יכול לשמש גם כדי לנרמל את הליפוסט של תאים מתורבתים, אבל התאים חייבים להיות מלאים לחלוטין. תוכן ה-DNA הוא לא אופציה טובה עבור שליטה פנימית, כמו הליך חילוץ ה-DNA עשוי להחדיר וריאציות בדגימות, במיוחד עבור דגימות המכילות כמות קטנה של דנ א.

אם לא נצפתה שינוי בצבע לאחר התגובה, ניתן לנקוט במספר שלבי פתרון בעיות:
1. בדוק את שלב ההכנה לדוגמה, הקפד לטפל בדגימות כראוי, לשמור את הדגימות על הקרח, ולהימנע מחזורי הקפאת הפשרה מרובים.
2. נסה להשתמש בריכוז חלבון גבוה יותר, משום שכמה דוגמאות עשויות להיות ביטויים נמוכים בהרבה של סטנדרטים ציטראט שאינם ניתנים לגילוי על-ידי האפשרות של הפעילות הציטראט הניתנת לשימוש.
3. שים לב כי כמה קיטים הזמינים מסחרית עבור שיטת הפעילות הציטראט והלא ניתנת לשימוש עבור Drosophila ילה, משום שערכות אלה קובעות את הפעילות המיטוכונדרילית הציטראט המבוססת על מערכת חיסונית של היונקים הציטראט והנוגדן של היונקים הציטראט שאינם מזהים את הדרוסופילה ציטראט

כמו כן, אם קיימת סתירה בין דגימות:
1. ודא שאין בועות בבארות.
2. לבחון אם זה נגרם על ידי טכניקת פיליטוף עלובה.

בניגוד למדידת פעילות ציטראט וסינתזה על ידי שיטה מטרית צביעה במיטומטר מטוהרים, אשר דורש כמעט 200 זבובים לטיהור של המיטומטר של כל גנוטיפ¹⁹, אנו מציגים פרוטוקול עבור מידה מהירה ופשוטה למדידה של פעילות ציטואז באמצעות שיטת צביעה ברקמה הומובית או בתמציות תא שלם¹⁶. עבור כל דוגמה, רק עשר זבובים בקעו באותו יום נדרשים; עבור דגימות טרילקייט של כל גנוטיפ, יש צורך ב -30 זבובים. הפרוטוקול המתואר חל לא רק על דרוזוהילה אלא גם על מערכות אחרות, כגון תאים מתורבתים ורקמות היונקים.

מלבד שיטת הפעילות הציטראט, שיטות אחרות ניתן להשתמש כדי לכמת מסה מיטוכונדריאלי. לעומת אחרים בשימוש נפוץ שיטות כמותיים של המיטורציה, כגון מדידה של תוכן ה-DNA מיטוכונדריאלי על ידי qpcr ו כימות של חלבונים מיטוכונדריאלי על ידי בלוק המערבי, אשר לזהות את כל המיטו, ללא קשר לתפקוד שלהם, הפעילות הציטראט של הפעולה לשימוש משתמשים כדי לכמת את ה בניגוד לצורך הנשימה מיטוכונדריאלי, הזקוק לטיהור מיטוכונדריאלי ולציוד התמחות מיוחד¹⁶, מאפשר לחוקרים לבצע מדידות מהירות על ידי ספקטרופוטומטר עם הכנה לדוגמה פשוטה, כגון תמצית תא שלמה או רקמת הומוגון, ואין צורך בבידוד מיטוכונדריאלי. לפיכך, שיטת הפעילות הציטראט והרב היא שיטת המדידה המהירה והחסכונית לכמת של מסה מיטוכונדריאלי שלמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אינם מצהירים על ניגודי אינטרסים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי המענקים מן הלאומי המדע הטבעי הקרן של סין (31401013 ו 31471010), ועדת המדע והטכנולוגיה של עיריית שנגחאי, שנגחאי Pujiang התוכנית (14PJ1405900), והקרן למדעי הטבע של שנגחאי (19ZR1446400).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma-Aldrich	V900477
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base)	Sigma-Aldrich	V900483
Acetyl-CoA	Sigma-Aldrich	A2181
Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB)	Sigma-Aldrich	D8130
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	V900106
Oxaloacetate	Sigma-Aldrich	O4126
Pellet pestle	Sangon	F619072
Pellet pestle motor	Tiangen	OSE-Y10
Plate reader	BioTek	Eon
Protein BCA Assay kit	Beyotime	P0010S
Scissors	WPI	14124
Triton X-100	Sangon	A110694-0100