Summary
Presentamos un protocolo para un ensayo colorimétrico de la actividad citrato sintasa para la cuantificación de la masa mitocondrial intacta en el tejido Drosophila homogeneatos.
Abstract
Las mitocondrias desempeñan el papel más prominente en el metabolismo celular mediante la producción de ATP a través de la fosforilación oxidativa y la regulación de una variedad de procesos fisiológicos. La disfunción mitocondrial es una causa primaria de una serie de enfermedades metabólicas y neurodegenerativas. Las mitocondrias intactas son fundamentales para su correcto funcionamiento. La enzima citrato sintasa se localiza en la matriz mitocondrial y por lo tanto se puede utilizar como un marcador de enzima cuantitativa de la masa mitocondrial intacta. Dado que muchas moléculas y vías que tienen funciones importantes en las mitocondrias están altamente conservadas entre los seres humanos y Drosophila,y que una serie de potentes herramientas genéticas están disponibles en Drosophila, Drosophila sirve como un buen sistema modelo para el estudio de la función mitocondrial. Aquí, presentamos un protocolo para la medición rápida y sencilla de la actividad citrato sintasa en el tejido homogeneizado de moscas adultas sin aislar las mitocondrias. Este protocolo también es adecuado para medir la actividad de la citrato sintasa en larvas, células cultivadas y tejidos de mamíferos.
Introduction
Las mitocondrias son más conocidas como los orgánulos que producen energía en la mayoría de los organismos eucariotas, que producen la moneda energética, ATP, a través del ciclo del ácido tricarboxílico (es decir, ciclo Krebs) y fosforilación oxidativa. Mitocondrias también se encuentran para desempeñar un papel importante en una gran cantidad de otros procesos fisiológicos, tales como la regulación de la apoptosis1, Ca2 + homeostasis2,3, especies de oxidación reactiva (ROS) generación4, y retículo endoplasmático (ER)-respuesta de estrés5. La disfunción mitocondrial puede afectar a cualquier órgano del cuerpo a cualquier edad y es una causa primaria de enfermedadmeólica, relacionada con el envejecimiento6,y enfermedades neurodegenerativas7. Las mitocondrias intactas están relacionadas mecanicísticamente con la función mitocondrial. Por lo tanto, la cuantificación adecuada de la masa mitocondrial intacta es muy importante para evaluar la función mitocondrial8. Citrato sintasa, una enzima limitante de velocidad en el primer paso del ciclo de ácido tricarboxílico9, se localiza en la matriz mitocondrial dentro de las células eucariotas, y por lo tanto se puede utilizar como un marcador cuantitativo para la presencia de masa mitocondrial intacta9,10. La actividad de la citrato sintasa también se puede utilizar como factor de normalización para las proteínas mitocondriales intactas11,12.
La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, es un excelente sistema modelo para el estudio de la función mitocondrial, ya que muchas moléculas y vías que desempeñan papeles fundamentales en las mitocondrias se conservan evolutivamente desde Drosophila a los seres humanos13,14,15. Aquí, presentamos un protocolo para un método rápido y simple para la medición de la actividad citrato sintasa mediante un ensayo colorimétrico en tejido Drosophila homogeneiza16 en un formato de placa de 96 pozos. En el ensayo de actividad de citrato sintasa, citrato sintasa en el tejido drosofílico homogeneizado cataliza la reacción de oxaloacetato con acetil coenzima A (acetil CoA) para formar el citrato CoA-SH y H+. CoA-SH reacciona posteriormente con 5,5'-dithiobis-(2-ácido nitrobenzoico) (DTNB) para generar un producto de color, 2-nitro-5-tiobenzoato (TNB), que se puede medir fácilmente espectrofotométricamente a 412 nm. La actividad de la citrato sintasa puede reflejarse en la tasa de producción de color.
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Protocol
1. Ensayo de actividad de citrato colorimétrico de la síntesis para D. melanogaster16
- Recoger diez moscas adultas para cada muestra. Recoger al menos muestras triplicadas para cada genotipo.
- Preparar 500 ml de tampón de extracción en frío-hielo que contenga 20 mM de HEPES (pH a 7,2), EDTA de 1 mM y trífino X-100 del 0,1% en un tubo de ensayo de 1,5 ml para cada muestra.
- Anestetiza las moscas adultas conCO2 en una almohadilla de anestesia y aísla los tejidos deseados. Para aislar los thoraxes de mosca adultos, por ejemplo, fijar los thoraxes de mosca por un par de fórceps, y luego aislar los abdomens de la mosca cortando a lo largo del borde del tórax y el abdomen usando un par de tijeras. Recoger los thoraxes mosca para el ensayo de actividad de citrato muscular sintasa.
NOTA: Determine el peso fresco del tejido en este paso si lo usa para normalizar la actividad de citrato sintasa. - Transfiera inmediatamente 10 thoraxes de mosca adultas a 100 ml de tampón de extracción en frío y homogeneice con un pestillo sobre hielo. Para mantener las muestras heladas, homogeneizar las muestras durante 5-10 s en hielo, luego hacer que las muestras se senten en hielo durante 5 s, y repetir hasta que todos los tejidos en el tubo se homogeneizan por completo.
NOTA: Tape el tubo, compruebe los homogeneizados para asegurarse de que no hay coágulos en los homogeneizados y que los tejidos del tubo estén completamente homogeneizados. Todos los tratamientos de muestras deben realizarse sobre hielo. - Tomar 10 ml de cada muestra homogeneizada en un tubo nuevo para la medición del contenido proteico. Mantenga las muestras para la medición de proteínas en hielo.
NOTA: Las muestras de proteínas se pueden congelar y almacenar a -80 oC para su posterior análisis. Las concentraciones de proteínas sirven como parámetro interno para la normalización de las actividades de citrato sintasa. - Añadir 400 l de tampón de extracción de hielo-frío a cada muestra restante para hacer un volumen total de 500 l. Mezclar bien pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo al menos 5 veces, evitando la formación de burbujas. Para cada reacción, añadir 1 l de lisato de célula sin diluir a 150 l de la solución de reacción recién preparada (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0,1 mM de DTNB, 0,3 mM de acetil CoA, ácido oxaloacético de 1 mM). Mezcle bien e inmediatamente pipeteando suavemente, evitando la formación de burbujas. Mida la absorbancia a 412 nm cada 10-30 s durante 4 min a 25 oC utilizando un lector de placas capaz de medir la absorbancia a 412 nm a intervalos mínimos de 10 s.
NOTA: Cambie la punta antes de pipetear un reactivo diferente y evite formar burbujas en los pozos. La mezcla incompleta de los reactivos puede causar variaciones en las mediciones. El ensayo de actividad de citrato sintasa debe realizarse a temperatura ambiente inmediatamente después de que se recojan las muestras, ya que este ensayo se utiliza para cuantificar la masa mitocondrial intacta. El búfer de reacción debe prepararse inmediatamente antes de su uso y no debe almacenarse. - Trazar datos como absorbancia de densidad óptica (Abs) (eje Y) frente al tiempo (en minutos) (eje X). A continuación, calcule la pendiente de la parte lineal de la curva, donde la tasa de reacción es
Divida el valor por la concentración de proteína de la muestra para normalizar la actividad de la citrato sintasa. La actividad citrato sintasa se calcula como
NOTA: La concentración de proteínas de la muestra se puede medir mediante un kit de ensayo de concentración de proteínas.
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Representative Results
La Figura 1 presenta un ejemplo de las curvas cinéticas para la absorbancia de la OD a 412 nm con el tiempo obtenidas utilizando el ensayo colorimétrico de actividad citrato sintasa para medir los homogeneios del tejido del tórax Drosophila de diferentes genotipos. Es bien sabido que el PGC-1 es un regulador maestro de la biogénesis mitocondrial. El PGC-1se conserva funcionalmente entre Drosophila y los humanos. Drosophila El RNF34 (dRNF34) es una ligasa de ubiquitina E3 para Drosophila PGC-1, dPGC-1, y promueve la degradación de la proteína dPGC-11. La microscopía electrónica de transmisión y el ADN mitocondrial qPCR han demostrado que el derribo de dRNF34 en el músculo Drosophila aumenta el contenido mitocondrial, que se suprime por derribo de dPGC-117. Basándonos en estos resultados, hipotetizaron que el derribo de dRNF34 en el músculo Drosophila aumentaría la actividad de la citrato mitocondrial sintasa, que debería revertirse por derribo de dPGC-1. De hecho, utilizando el ensayo colorimétrico de la actividad de citrato sintasa descrito aquí, encontramos que el derribo de dRNF34 en el músculo Drosophila aumentó la actividad de la citrato mitocondrial de la citrato sintasa, que fue invertida por derribo de dPGC-1. Específicamente utilizando el método descrito aquí, se estableció una tasa enzimática lineal inicial para cada ensayo(Figura 1). Las líneas de tendencia con sus fórmulas y coeficiente de determinación (R2) se muestran en el gráfico (Figura 1). Las pendientes de las líneas de tendencia representan las tasas máximas de reacción, que son equivalentes a las actividades máximas de citrato sintasa de los diferentes genotipos. Las pendientes para los diferentes genotipos son diferentes(Figura 1). El coeficiente de determinación es más cercano a 1; las fórmulas de las líneas de tendencia son más fiables. La concentración de proteínas normalizada máxima citrato sintasa actividades de diferentes genotipos se calculó a partir de los datos de la Figura 1 (Figura 2). Se ha aumentado la actividad máxima de citrato sintasa de los torcones de mosca con derribo de dRNF34 específico del músculo, que fue invertido por derribo de dPGC-1 específico del músculo(Figura 2).
Figura 1: Un ejemplo de las curvas cinéticas para el ensayo colorimétrico de la actividad citrato sintasa. El tórax de mosca adulta homogeneatos de (a) 24B-Gal4>+ (b) 24B-Gal4>dRNF34RNAi(II), y (c) 24B-Gal4>dRNF34RNAi(II),dPGC-1RNAi fueron sometidos al ensayo colorimétrico de la actividad de citrato sintasa. Los ejes horizontales representan tiempos de reacción, y los ejes verticales representan absorbentes de OD a 412 nm. Se estableció una tasa enzimática lineal para cada genotipo. Las líneas de tendencia se dibujaron y las fórmulas y R2 de las líneas de tendencia se muestran en el gráfico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Las actividades máximas de citrato sintasa calculadas a partir de las curvas cinéticas y normalizadas por concentración de proteínas. La actividad de citrato sintasa máxima de los thoraxes de mosca con el derribo dRNF34 específico del músculo aumentó, que fue invertido por el derribo dPGC-1 específico del músculo. Todos los datos se representan como medias de SEM (*p < 0.01, mediante la prueba ANOVA, y la prueba de Tukey para comparaciones múltiples, n a 3, 10 thoraxes por réplica). Esta cifra se modifica de Wei et al.17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los estudios metabólicos utilizando Drosophila como modelo deben tener en cuenta los antecedentes genéticos, la dieta y el mantenimiento de las acciones de las moscas18. Para evitar los efectos de diferentes fondos genéticos en la medición de la actividad citrato sintasa, diferentes cepas de Drosophila deben ser retrocruzadas a la cepa de control durante 10 generaciones. El trasfondo genético de todas las cepas Drosophila utilizadas en nuestros experimentos es w1118,por lo que usamos w1118 como control. Generalmente, creemos que w1118 es un buen control, ya que es el trasfondo genético de la mayoría de las cepas de Drosophila y es mucho más fácil de cruzar hacia atrás que Canton-S. La dieta y el mantenimiento de las existencias deben ser exactamente los mismos para todos los grupos experimentales. En nuestros experimentos, las moscas se mantienen normalmente a 25 oC y 50-60% de humedad relativa. El paso de preparación de la muestra también debe realizarse con precaución. Las cruces configuradas para el experimento deben estar en una escala similar y adecuada. Para establecer una cruz, 3-4 moscas hembras vírgenes adultas se mantienen con 2-3 moscas adultas macho en un vial de 4 cm de diámetro, 15 cm de alto suministrado con alimentos frescos. La receta de alimentos puede variar (por ejemplo, dieta alta en grasas, dieta normal, dieta alta en azúcar), dependiendo del diseño experimental. Dos días después, la generación parental de moscas se transfiere a un nuevo vial con alimentos frescos. El cuidado de las larvas eclosionadas en los alimentos incluye agregar un poco de agua si es necesario. Cuando la generación filial de moscas comienza a eclosionar, los viales se voltean cada 24 h, las moscas del genotipo deseado se recogen en un nuevo vial para el experimento, y la fecha de eclosión de las moscas se marca en cada vial. Aproximadamente 20-30 moscas recolectadas del mismo genotipo, género y edad se mantienen en un vial con alimentos. Las moscas recogidas deben transferirse a viales frescos con alimentos apropiados cada dos días hasta que se realicen los experimentos. Para evitar el efecto de la edad en la actividad citrato sintasa, las moscas de los diferentes grupos probados deben eclosionar en el mismo día. Además, el género de las moscas debe ser igualado. Por lo general, el tamaño corporal de las hembras es mayor que el de los machos, por lo que la concentración proteica de los cuerpos femeninos es mayor que la de los cuerpos masculinos.
El ensayo de actividad de citrato sintasa también se puede utilizar para medir la actividad de la citrato sintasa en larvas. Con este fin, cada muestra puede consistir en cinco larvas vagando tercera estrella. Las terceras larvas instar se pueden distinguir por un anillo de color naranja oscuro en la punta de sus espiráculos posteriores, que carece o está débilmente presente en la segunda larva instar.
En el paso 6, las relaciones de dilución de las muestras pueden variar para diferentes muestras. Para las muestras que se miden por primera vez, se deben probar varias relaciones de dilución para determinar una relación de dilución adecuada para establecer una tasa de enzimmática lineal en el ensayo. El tiempo de medición total para la actividad enzimática máxima que establece una tasa enzimática lineal en el ensayo varía en función de la relación enzima-sustrato. Si el sustrato es extremadamente sobredosis en comparación con la enzima, entonces la actividad enzimática o la tasa de reacción alcanza el máximo, lo que permite el establecimiento de una tasa de enzimmática lineal en el ensayo. A medida que la reacción continúa, la cantidad del sustrato disminuye, y la actividad enzimática o la tasa de reacción se ralentiza. Si no se puede trazar una tasa enzimática lineal, lo que significa que el sustrato no se sobredosifica en comparación con la enzima, diluir aún más el tejido homogeneizado con solución de reacción o acortar el tiempo de intervalo para las lecturas de 412 nm hasta que se Establecido. El tiempo de intervalo para la lectura de 412 nm no debe ser superior a 30 s. La duración de la lectura de 412 nm se basa en la velocidad de reacción y el tiempo. La lectura del espectrofotómetro debe detenerse cuando no se observe ningún cambio de color adicional para todas las reacciones.
La actividad de la citrato sintasa puede normalizarse por la concentración de proteína de la muestra, el peso fresco de la muestra o el número de células. El peso fresco de la muestra se puede medir antes de homogeneizar como en el paso 3. El número de celda también se puede utilizar para normalizar el lisado de las células cultivadas, pero las células deben estar completamente lysed. El contenido de ADN no es una buena opción para un control interno, ya que el procedimiento de extracción de ADN puede introducir variaciones en las muestras, particularmente para muestras que contienen una pequeña cantidad de ADN.
Si no se observa ningún cambio de color después de la reacción, se pueden tomar varios pasos de solución de problemas diferentes:
1. Compruebe el paso de preparación de la muestra, asegurándose de manipular las muestras correctamente, mantener las muestras en hielo y evitar múltiples ciclos de congelación.congelación.
2. Trate de utilizar una mayor concentración de proteínas, porque algunas muestras podrían tener niveles de expresión mucho más bajos de citrato sintasa que son indetectables por el ensayo de actividad de citrato sintasa.
3. Tenga en cuenta que algunos kits disponibles comercialmente para el ensayo de actividad de citrato sintasa no se pueden utilizar para Drosophila, ya que estos kits determinan la actividad de citrato mitocondrial sintasa basada en la inmunocaptura de citrato de mamíferos sintasa y el anticuerpo de citrato sintasa de mamíferos puede no reconocer la drosophila citrate sintasa.
Del mismo modo, si hay una discrepancia entre las muestras:
1. Asegúrese de que no haya burbujas en los pozos.
2. Examine si esto es causado por una mala técnica de pipeteo.
A diferencia de medir la actividad citrato sintasa mediante un ensayo colorimétrico en mitocondrias purificadas, que requiere casi 200 moscas para la purificación de las mitocondrias de cada genotipo19,presentamos un protocolo para un ensayo rápido y sencillo para la medición de la actividad citrato sintasa por un método colorimétrico en el homogeneato tisular o en extractos de células enteras16. Para cada muestra, sólo se necesitan diez moscas eclosionadas el mismo día; para las muestras triplicadas de cada genotipo, se necesitan 30 moscas. El protocolo descrito es aplicable no sólo a Drosophila, sino también a otros sistemas, como células cultivadas y tejidos de mamíferos.
Además del ensayo de actividad de citrato sintasa, se pueden utilizar otros métodos para cuantificar la masa mitocondrial. En comparación con otros métodos cuantitativos comúnmente utilizados de las mitocondrias, como la medición del contenido de ADN mitocondrial por qPCR y la cuantificación de proteínas mitocondriales por la hincha occidental, que detectan todas las mitocondrias independientemente de su función, el ensayo de actividad citrato sintasa se utiliza para cuantificar la presencia de masa mitocondrial intacta. A diferencia del ensayo de respiración mitocondrial, que necesita purificación mitocondrial y equipo de ensayo especializado16, el ensayo de actividad de citrato sintasa permite a los investigadores realizar mediciones rápidas mediante espectrofotometría con una preparación de muestra simple, como extracto de células enteras o homogeneidad tisular, y sin necesidad de aislamiento mitocondrial. Por lo tanto, el ensayo de actividad de citrato sintasa es un ensayo rápido y económico para la cuantificación de la masa mitocondrial intacta.
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Disclosures
Los autores no declaran conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31401013 y 31471010), la Comisión de Ciencia y Tecnología del Municipio de Shanghái, el Programa Pujiang de Shanghái (14PJ1405900), y la Fundación de Ciencias Naturales de Shanghái (19ZR1446400).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Pellet pestle | Sangon | F619072 | |
| Pellet pestle motor | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Plate reader | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Assay kit | Beyotime | P0010S | |
| Scissors | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
References
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