Aquí, se presenta un modelo experimental crítico de isquemia de la extremidad posterior seguido de una batería de pruebas funcionales, histológicas y moleculares para evaluar la eficacia de las terapias angiogénicas.
Artículo de método
Aquí, se presenta un modelo experimental crítico de isquemia de la extremidad posterior seguido de una batería de pruebas funcionales, histológicas y moleculares para evaluar la eficacia de las terapias angiogénicas.
La isquemia crítica de las extremidades (CLI) es una afección grave que implica un alto riesgo de amputación de las extremidades inferiores. A pesar de que la revascularización es la terapia estándar de oro, un número considerable de pacientes con CLI no son adecuados para la revascularización quirúrgica o endovascular. Las terapias angiogénicas están emergiendo como una opción para estos pacientes, pero actualmente todavía están bajo investigación. Antes de su aplicación en humanos, estas terapias deben probarse en modelos animales y sus mecanismos deben entenderse claramente. Un modelo animal de isquemia de la extremidad posterior (HLI) se ha desarrollado por la ligadura y la escisión de las arterias y venas externas lílicas y femorales en ratones. Se reunió un panel completo de pruebas para evaluar los efectos de la isquemia y las terapias angiogénicas putativas a nivel funcional, histológico y molecular. Laser Doppler se utilizó para la medición de flujo y la evaluación funcional de la perfusión. La respuesta del tejido se evaluó mediante el análisis de la densidad capilar después de la tinción con el anticuerpo anti-CD31 en secciones histológicas del músculo gastrocnemius y mediante la medición de la densidad colateral del vaso después de la diofonización. La expresión de genes angiogénicos se cuantificó mediante RT-PCR dirigido a factores angiogénicos seleccionados exclusivamente en células endoteliales (CE) después de la microdisección de captura láser de los músculos gastrocnemius ratones. Estos métodos fueron sensibles a la hora de identificar las diferencias entre las extremidades isquémicas y no isquémicas y entre las extremidades tratadas y no tratadas. Este protocolo proporciona un modelo reproducible de CLI y un marco para probar terapias angiogénicas.
La enfermedad arterial periférica (PAD) afecta predominantemente a las extremidades inferiores. La PAD es causada por la aterosclerosis, una obstrucción arterial que puede causar una restricción grave al flujo sanguíneo en las extremidades inferiores1. La claudicación intermitente es la primera manifestación de la PAD y se refiere al dolor muscular al caminar. La CLI es la etapa más grave de la PAD, siendo diagnosticada enpacientes que muestran dolor isquémico de reposo, úlceras o gangrena 2. Los pacientes con CLI tienen un alto riesgo de amputación, especialmente si no se tratan3. La revasculariz....
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Todos los procedimientos animales se ajustan a la Directiva 2010/63/UE y han sido aprobados por el Organismo Institucional de Bienestar Animal y autorizados por DGAV, la autoridad competente portuguesa para la protección animal (número de licencia 023861/2013)
ADVERTENCIA: Varios de los productos químicos utilizados en los protocolos son tóxicos y dañinos. Utilice todas las prácticas de seguridad apropiadas y equipo de protección personal (guantes, abrigo de laboratorio, pantalones de longitud completa y zapatos de punta cerrada)
1. El modelo murino de la isquemia de las extremidades posteriores
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Utilizando el protocolo descrito, las células madre mesenquimales del cordón umbilical y la radiación ionizante de dosis baja (LDIR) se probaron como terapias angiogénicas putativas 11,12. Las lecturas de perfusión doppler láser se obtuvieron antes de la inducción de la isquemia y en los plazos especificados previamente que van desde inmediatamente después de la inducción de la isquemia hasta 45 días después de la isquemia. Las lecturas de perfusión de tejido por.......
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Los modelos murinos de CLI han consistido principalmente en la ligadura de la arteria femoral sólo distal al origen de la profunda femoris 4,5,6,7,8,9. Esto ha demostrado dejar intacta la mayor parte de la circulación colateral, que restaura el flujo sanguíneo a la extremidad dentro de los 7 días 9. La.......
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Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecemos a José Rino y a Tonia Carvalho, jefes del Centro de Bioimagen y del Laboratorio de Histología y Patología Comparada del Instituto de Medicina Molecular Joao Lobo Antunes, respectivamente. También agradecemos a Vyacheslav Sushchyk del Departamento de Anatomía de la Escuela de Medicina Nova/Faculdade de Ciencias Médicas, Universidade Nova de Lisboa.
Referencia de financiación: proyecto financiado por UID/IC/0306/2016 Fundación para la Ciencia y una Tecnología. Paula de Oliveira cuenta con el apoyo de una beca (SFRH/BD/80483/2011) de la Fundación para la Ciencia y la Tecnología.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 7500 Instrumento de biosistemas | aplicados | ||
| Reactivo de acetona | Mer | 1000141000 | ; Precaución - altamente inflamable |
| Adenosina | Valdepharm | Reactivo | |
| Atipamezol | OrionReactivo Pharma | ||
| Sulfato de bario (Micropaque) | Guebert | 8671404 (ref. Infarmed) | Reactivo |
| Buprenorfina | RichterReactivo Pharma | ||
| Carl Zeiss Opmi-1 FC Microscopio quirúrgico | Carl Zeiss Microscopía, Alemania | Instrumento | |
| ADNc RT2 PreAMP Kit de síntesis de ADNc | Qiagen | Reactivo | |
| 7335730 Criostato Leica CM | Leica Microsystems | 3050S | Instrumento |
| DAB kit de sustrato de peroxidasa | DAKO; Vector Laboratories | K3468 | Reactivo |
| peroxidasa de hidrógeno | Merk | 1072090250 | reactivo; Precaución |
| bolígrafo hidrofóbico | Dako | 411121 | Reactivo; Precaución - tóxico |
| Ketamidor | Richterpharma | CN:580393,7 630/01/12 Dfvf | Reactivo |
| Láser Doppler generador de imágenes de perfusión moorLDI2-HIR | MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, Reino Unido | 5710 | Instrumento |
| Leica DM2500 microscopio de campo claro | vertical Leica Microsystems | Instrument | |
| Medetor | Virbac | 037/01/07RFVPT | Reactivo |
| metanol | VWR | UN1230 | Reactivo; Precaución: reactivo de |
| Papaverine | Labesfal | ||
| Pentano Isso | Merk | 1060561000 | reactivo; Precaución - altamente inflamable |
| Power SYBR® Green | Applied Biosystems | 4309155 | Reactivo |
| anti-ratón CD31 Reactivo | 550274 Pharmingen | ||
| RNeasy Micro kit Qiagen | 74004 | Reactivo | |
| Surgic-Pro 6.0 | Medtronic (Coviden) | VP733X | Sutura |
| VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidasa, IgG de rata) | Kit Vectastain ABC; Vector Laboratories | PK-4004 | Reactivo |
| Vicryl5.0/ Vicryl 6.0 | Medtronic (Covidien) | UL202/ UL101 | Sutura |
| Zeiss PALM Sistema de microdisección láser MicroBeam | Carl Zeiss Microscopy, Alemania | 1023290916 | Instrumento |
| Microscopio estereotámico | Carl Zeiss Microscopía, Alemania | Instrumento | |
| Cámara digital | Linux | instrumento |
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