Summary
Hier wordt een kritisch hindledemaat ischemie-experimentele model gepresenteerd, gevolgd door een batterij met functionele, histologische en moleculaire tests om de effectiviteit van angiogene therapieën te beoordelen.
Abstract
Kritische ledemaat ischemie (CLI) is een ernstige aandoening die een hoog risico op amputatie van de onderste ledematen met zich meebrengt. Ondanks dat revascularisatie de Gold-standaard therapie is, zijn een aanzienlijk aantal CLI-patiënten niet geschikt voor chirurgische of endovasculaire revascularisatie. Angiogene therapieën verschijnen als een optie voor deze patiënten, maar zijn momenteel nog in onderzoek. Vóór toepassing bij de mens moeten deze therapieën in diermodellen worden getest en moeten de mechanismen ervan duidelijk worden begrepen. Een diermodel van hindledemaat ischemie (HLI) is ontwikkeld door de ligatie en excisie van de distale externe iliacale en femorale slagaders en aders in muizen. Een uitgebreid panel van tests werd samengesteld om te beoordelen van de effecten van ischemie en putatieve angiogene therapieën op functionele, histologische en moleculaire niveaus. Laser Doppler werd gebruikt voor de stromingsmeting en functionele beoordeling van perfusie. Weefsel respons werd geëvalueerd door de analyse van capillaire dichtheid na kleuring met het anti-CD31 antilichaam op histologische secties van gastrocnemius-spier en door meting van de dichtheid van het onderpand vaartuig na diaphonisatie. Expressie van angiogene genen werd gekwantificeerd door RT-PCR gericht op geselecteerde angiogene factoren uitsluitend in endotheel cellen (ECs) na laser Capture micro dissectie van muizen gastrocnemius spieren. Deze methoden waren gevoelig voor het identificeren van verschillen tussen ischemische en niet-ischemische ledematen en tussen behandelde en niet-behandelde ledematen. Dit protocol biedt een reproduceerbaar model van CLI en een kader voor het testen van angiogene therapieën.
Introduction
Perifere arteriële ziekte (PAD) beïnvloedt voornamelijk de onderste ledematen. PAD wordt veroorzaakt door atherosclerose, een slagader obstructie die kan leiden tot ernstige beperking van de bloedtoevoer in de onderste ledematen1. Intermitterende intermittens is de eerste manifestatie van PAD en verwijst naar spierpijn tijdens het lopen. CLI is de meest ernstige fase van PAD, wordt gediagnosticeerd bij patiënten die ischemische rust pijn vertonen, zweren of gangreen2. Patiënten met CLI hebben een hoog risico op amputatie, vooral als onbehandeld3. De revascularisatie van de onderste ledematen (ofwel door een open operatie of een endovasculaire procedure) is momenteel de enige manier om ledematen te redden. Echter, ongeveer 30% van de CLI-patiënten zijn niet geschikt voor deze procedures, om redenen die de locatie van de laesies omvatten, het patroon van arteriële occlusie en uitgebreide comorbiditeit4,5. Daarom zijn er nieuwe therapieën nodig voor deze anders onbehandelbare patiënten, waarbij de bevordering van angiogenese de strategie is onder intenser onderzoek.
Voor het testen bij de mens moet de effectiviteit en veiligheid van nieuwe therapieën in vivo in diermodellen worden overwogen. Er zijn verschillende modellen ontwikkeld voor de studie van CLI, voornamelijk door het induceren van hindledemaat ischemie (HLI) bij muizen6,7,8,9,10. Echter, deze modellen verschillen in verschillende aspecten, met inbegrip van de aard van de slagaders die zijn geligeerd en/of uitgesneden en of de aderen en zenuwen rond worden ontleed als goed6,7,8, 9,10. Tezamen zullen deze aspecten van invloed zijn op de ernst van het ischemie-reperfusie letsel in elk dier, waardoor de resultaten moeilijk te vergelijken zijn. Daarom is het van cruciaal belang om een effectief protocol te ontwikkelen waarin de procedure voor het opwekken van ischemie en de evaluatie van verschillende doelstellingen moet worden gestandaardiseerd om te beoordelen of een bepaalde angiogene therapie effectief zal zijn. Een experimenteel protocol dat is ontworpen om al deze aspecten te dekken, zou een uitgebreid inzicht geven in de mechanismen waarmee angiogene therapieën hun effecten en een maatstaf van hun werkzaamheid bij elk van hun uitkomsten kunnen uitoefenen. Twee verschillende werken die onlangs door ons team zijn gepubliceerd, zijn een goed voorbeeld11,12, waarin verschillende benaderingen voor het opwekken van therapeutische angiogenese werden beoordeeld aan de hand van hetzelfde protocol dat met meer detail wordt beschreven in deze Protocol.
Het algemene doel van dit protocol is het beschrijven van een reproduceerbaar experimenteel model dat de effecten van CLI kan nabootsen en de experimentele basis legt voor een uitgebreide beoordeling van de functionele, histologische en moleculaire effecten van vermoedelijke angiogene Agenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dier procedures zijn in overeenstemming met richtlijn 2010/63/EU en zijn goedgekeurd door het institutioneel dierenwelzijns orgaan en gelicentieerd door DGAV, de Portugese bevoegde autoriteit voor dierenbescherming (licentienummer 023861/2013)
Let op: verschillende chemicaliën die in de protocollen worden gebruikt, zijn giftig en schadelijk. Gebruik alstublieft alle geschikte veiligheidspraktijken en persoonlijke beschermingsmiddelen (handschoenen, laboratoriumjas, lange broek en schoenen met gesloten teen)
1. het lymdklier model van de achterste ledemaat ischemie
Opmerking: alle experimenten worden uitgevoerd op 22 weken oude C57BL/6 vrouwelijke muizen.
- Voorbereiding van oplossingen
-
Bereiding van de anesthetische oplossing
Opmerking: deze anesthetische combinatie (Medetomidine en ketamine) biedt tot 30 min immobilisatie en een chirurgische ruit van 15 min. Het effect kan worden teruggedraaid door de toediening van atipamezol.- Met een schone, 1cc spuit, zuig 1 mL Medetomidine (1 mg/kg lichaamsgewicht) op, Elimineer luchtbellen voor nauwkeurige metingen en voeg het toe aan een 15 mL Falcon Tube.
- Met een schone, 1 cc spuit, zuig 0,75 mL ketamine (75 mg/kg lichaamsgewicht) op, Elimineer luchtbellen voor nauwkeurige metingen en voeg het toe aan een 15 mL Falcon tube met de Medetomidine.
- Voeg 8,25 mL steriele zoutoplossing (0,9% NaCl) toe om 10 mL verdovingsmiddel te verkrijgen.
- Identificeer de buis met de naam van de verbindingen, de datum gemengd en de vervaldatum.
- Bewaren in het donker bij 4 °C.
-
Bereiding van de anti-sedatieve oplossing
- Met een schone, 1 cc spuit, zuig 1 mL atipamezole (5 mg/kg lichaamsgewicht) op, Elimineer luchtbellen voor nauwkeurige metingen en voeg het toe aan een 15 mL Falcon Tube.
- Voeg toe 9 ml steriele zoutoplossing (0,9% NaCl), om 10 ml van de terugkeer te verkrijgen.
- Identificeer de buis met de naam van de verbindingen, de datum gemengd en de vervaldatum.
- Bewaren in het donker bij 4 °C.
-
Bereiding van de postoperatieve analgesie oplossing
- Met een schone, 1 cc spuit, trek 0,5 mL buprenorfine (100 μL/15-30 g lichaamsgewicht), elimineren luchtbellen voor nauwkeurige metingen, en voeg het toe aan een 15 mL Falcon buis.
- Voeg 9,5 mL steriele zoutoplossing (0,9% NaCl) toe om 10 mL analgesie te verkrijgen.
- Identificeer de buis met de naam van de verbindingen, de datum gemengd en de vervaldatum.
- Bewaren in het donker bij 4 °C.
-
Bereiding van de anesthetische oplossing
- Chirurgische inductie van hindledemaat ischemie
- Chirurgische hulpmiddelen nodig voor deze interventie: puntige Tang, veer schaar, oogheelkundige naald houder, chirurgische schaar en een naald houder. Steriliseer alle chirurgische gereedschappen in een autoclaaf voor gebruik. Gebruik wattenstaafjes voor de dissectie van onderhuids vet.
- Laad de spuit met de anesthesie oplossing voordat u de muis vasthoudt.
- Trek het dier in door kracht achter de oren op het rooster van de kooi toe te passen, zodat de muis zo veel mogelijk huid vasthoudt.
- Houd het dier gekanteld met zijn hoofd verlaagd en voer een intraperitoneale injectie van de anesthesie oplossing, waarbij de spuit in een hoek van 45 ° met het lichaam van de muis.
- Controleer voor de afwezigheid van pedaal terugtrekking reflexen, om de diepte van de anesthesie te evalueren.
- Verwijder het haar van de rechter achterledemaat met behulp van een elektrisch scheerapparaat. Gebruik een chloorhexidine desinfecterende zeep scrub voor de huid bereiding. Gebruik een schone papieren handdoek om de sud's te verwijderen. Breng een chloorhexidine chirurgische scrub aan en Bescherm het huidoppervlak met een steriele draperen voordat u de muizen naar de chirurgisch steriele Suite vervoert.
- Plaats het dier in dorsale decubitus en leg het af met de vier ledematen verdeeld en vastgezet met tape.
VOORZICHTIG: Voer de procedure uit op een verwarmde pad om de lichaamstemperatuur van het dier stabiel te houden; de chirurgische ingreep wordt uitgevoerd met behulp van een dissectie Microscoop bij een vergroting van 10x of 20x. - Breng een chloorhexidine antiseptische oplossing aan met steriel gaas om de huid bereiding te voltooien. Met behulp van een nummer 11 chirurgische scalpel Blade voeren een 1-cm huid incisie boven de dij van de rechter achterledemaat.
- Botte ontleden subcutaan vet bloot de neurovasculaire bundel. Gebruik de puntige Tang, de veer schaar en de oogheelkundige naald houder om de membraneuze Ilio-femorale schede te openen om de distale externe iliacale-en femorale vaten bloot te leggen.
- Dissect en scheid de vaten (slagader en ader) van de zenuw. Met behulp van een 7,0 niet-absorbable polypropyleen hechtmiddel ligate de distale externe iliacale slagader en ader en de distale femorale slagader en ader.
- Transect het segment van de Ilio-femorale slagader en aders tussen de distale en proximale knopen met de veer schaar.
- Sluit de incisie met een absorbabel hechtmiddel (bijv. 5,0 Vicryl hecht).
- Laad de spuit met de anti-sedatieve oplossing en gebruik dezelfde methode als beschreven in 1.2.3 en 1.2.4 om een intraperitoneale injectie van de anti-sedatieve oplossing uit te voeren.
- Post-operatieve monitoring
Opmerking: dieren worden elke 15-20 min zorgvuldig geobserveerd om er zeker van te zijn dat alle dieren zich goed van het anti-sedativa herstellen; verdoofd dieren worden nooit onbewaakt achtergelaten.- Evalueer het herstel van de anesthesie: 1) monitor de snelheid en diepte van de ademhaling; 2) Beoordeel dierlijke reflexen (pedaal-en ogen positie)
- Voer een subcutane injectie van de postoperatieve analgesie elke 8-12 h.
- Bewaak de dieren dagelijks na de operatie een korte beschrijving van de gezondheidstoestand van het dier en de verschijning van de operatieplaats vastleggen, zorg ervoor dat alle hechtingen gesloten zijn.
- Herhechting van de incisie, als dehiscentie optreedt. Als het niet lukt, breng dan een huidbarrière film op de incisie om te beschermen tegen urine, fecale excreties, wrijving en afschuiving van de huid en om het genezingsproces te helpen.
2. beoordeling van het angiogene effect
Opmerking: na ischemie inductie, de therapeutische agent toe te passen in de studie en de volgende procedures te bereiken. Stappen die op andere tijdstippen worden ondernomen, worden gedetailleerd beschreven in de desbetreffende sectie.
- Laser Doppler perfusie Imaging
- Verwijder het haar van beide achterpoten één dag voor de analyse met behulp van een elektrische scheerapparaat gevolgd door ontharings Cream.
- Anesthetiseer de muizen met behulp van de verdovings oplossing.
- Plaats het dier gedurende 5 minuten op een verwarmingspaneel van 37 °C om ervoor te zorgen dat de temperatuur tijdens de procedure niet zal veranderen
- Plaats het dier in rugligging met poten die in een verlengde positie zijn vastgezet. Meet de afstand tussen rechter-en linkerpoten en voeten voor elk dier, aangezien de positionering van het dier vergelijkbaar moet zijn wanneer de procedure herhaald moet worden om veranderingen in de achterledemaat perfusie na verloop van tijd te volgen.
- Begin met het verwerven van gegevens met behulp van een laser Doppler perfusie Imager.
- Nadat de overname voltooid is, herstellen van de anesthesie met de anti-sedatieve oplossing.
- Open de beeldanalyse software en teken de regio van belang (ROI) rond de ischemische hindledemaat en een vergelijkbare ROI rond de niet-ischemische hindledemaat.
- Observeer de flux waarden en bepaal de perfusie als een verhouding van de perfusie in de ischemische ledemaat tot die in de niet-ischemische ledemaat. Veranderingen in de perfusie verhouding worden gemeten in de tijd.
- Analyse van immunohistochemie en capillaire dichtheid
- Na anesthetiserende, offeren de muizen door cervicale dislocatie.
- Om de gastrocnemius spieren van beide benen te oogsten, Verwijder eerst de huid van beide achterpoten.
- Identificeer de Achilles pees en scheid de pees van het bot met behulp van een 11-bladige scalpel.
- Houd de Achilles pees vast en scheid de spieren van het scheenbeen en het kuitbeen tot aan het kniegewricht met veer schaar.
- Scheid de biceps musculus femoris van de gastrocnemius-spier.
- Gebruik veer schaar om de inserties van de gastrocnemius spieren op het kniegewricht niveau te snijden.
- Plaats de geoogste gastrocnemius-spieren in een dwarse oriëntatie op een kleine kurk schijf met behulp van 10% Tragacanth.
- Maak de specimens in vloeibaar stikstofgekoeld isopentane en bewaar ze bij-80 °C tot het snijden is.
- Snijd 7 μm delen van de spier monsters op een cryostaat en monteer op glaasjes.
Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken. - Bevestig de glaasjes in een fles met gekoeld zuiver aceton (ongeveer 50 mL) gedurende 10 min bij-20 °C.
- Voeg waterstof peroxidase 0,3% verdund in methanol (50 mL) gedurende 30 min bij kamertemperatuur.
- Was tweemaal in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (50 mL) voor een totaal van 10 min.
- Gebruik een hydrofobe pen rond de secties.
Opmerking: door het gebruik van een hydrofobe pen kan het aantal tijdens het protocol bestede oplossingen worden verminderd. Voor alle incubaties wordt per sectie 100 μL van alle oplossingen gebruikt. - Breng gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur een blokkerende oplossing van 5% konijnenserum aan in PBS.
- Inbroed de specimens gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met anti-CD31 rat monoklonaal antilichaam verdund met 1:500 in 1% boviene serumalbumine (BSA) in PBS.
- Was driemaal in PBS voor een totaal van 30 minuten.
- Voeg een secundair biotinyated Rabbit anti-rat IgG antilichaam toe bij 1:200 in 1% BSA in PBS en 5% konijnenserum gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Was in PBS en voeg het gelabelde avidin-geconjugeerde peroxidase complex gedurende 30 minuten toe bij kamertemperatuur.
- Spoel 3 keer in PBS gedurende 5 min en voeg een diaminobenzidine (DAB) peroxidase substraat Kit toe voor nog eens 5 min.
- De secties met hematoxyline voor 10 sec. voor montage tegen vlekken.
- Meet de capillaire dichtheden met behulp van een rechtopstaande brightfield-Microscoop (d.w.z. aantal capillairen per aantal myocyten) in 2 verschillende secties van 4 afzonderlijke anatomische gebieden in elk monster.
- Contrast middel perfusie
- Anesthetiseer de muizen met behulp van de verdovings oplossing.
- Uitvoeren van een mediane laparotomie met behulp van een nummer 15 scalpel Blade.
- Bloot de abdominale aorta en de caudal vena cava, na lateraal intrekken van de dunne darm en het gebruik van veer schaar.
- Plaats 1 26-gauge katheter cranially in de abdominale aorta en een andere in de caudal Vena Cava in dezelfde richting.
- Veilige katheters op zijn plaats met behulp van een 5/0 Silk hecht aan het uitvoeren van een verblijf hecht.
- Was het vasculaire systeem met een 37 °C zoutoplossing die heparine (500 eenheden/100 mL) bevat, geduwd in de abdominale aorta met behulp van een 10 mL spuit. Ga door met een zachte perfusie totdat er een heldere oplossing wordt gezien die uit de katheter in de caudal Vena Cava komt.
Opmerking: meestal is 30 tot 40 ml van een gehepariniseerd zoutoplossing nodig om het vasculaire systeem van een volwassen rat te spoelen. - Dien een mengsel van adenosine (1 mg/L) en papaverine (4 mg/L) toe gedurende 2 min.
- Injecteer in de aorta katheter 10 mL van een mengsel van 50% bariumsulfaat en 5% gelatine.
Opmerking: de oplossing moet op 60 °C worden gehouden om verdikking te voorkomen. - Laat de muizen gedurende ten minste 4 uur bij-4 °C staan, zodat de vasculaire giet steen kan stollen.
- Verwijder de huid uit het onderste gedeelte van elke muis.
- Diaphonisatie - spalteholz techniek
- Bevestig de muizen door onderdompeling in een 10% formaldehyde oplossing voor ten minste 72 h.
- Bleek de muizen door onderdompeling in een 30% waterstofperoxide oplossing voor 24 h.
- Dehydraat de muizen met behulp van de Vries substitutie techniek. Deze methode bestaat erin de muizen in te dienen voor opeenvolgende passages (gemiddeld vier) van zuiver aceton bij-20 °C gedurende 24 uur per stuk.
- Verduidelijken van de muizen door onderdompelen in een oplossing met een mengsel van 100% Benzylbenzoaat en 100% Methylsalicylaat in een 3:5 verhouding (dit mengsel is ook bekend als Spalteholz oplossing) 13.
- Laat de muizen ondergedompeld in de Spalteholz oplossing binnen in een vacuümkamer totdat het wordt diaphanous, die meestal duurt 5 aan 7 dagen.
- Vervang de oplossing als deze donker wordt voordat het preparaat helder wordt.
- Kwantificering van onderpand vaten
- Observeer de muizen die zijn opgehangen in de Spalteholz-oplossing onder transverlichtingen met behulp van een stereotaxic Microscoop. Gebruik een microchirurgie tang om het voorzichtig te begrijpen en te verplaatsen.
- De hele ledematen fotograferen met een digitale camera die is aangesloten op de Microscoop.
- U volledige foto's van de ledematen verkrijgen door de juiste software te gebruiken.
- Voer een handmatige segmentatie van de onderpandsvaartuigen uit door ze te markeren met behulp van de juiste software.
Opmerking: zekerheden schepen worden gedefinieerd volgens de definitie van Long land, een gedefinieerde stam, Mid-zone en re-Inzender, met een diameter tussen 20 en 300 μm, met uitzondering van femorale, sapheneuze en popliteale slagaders en alle veneuze structuren. - Definieer ROIs in elke muis in dezelfde anatomische regio in de adder, rondom en onder de chirurgische occlusie.
- Kwantificeer de onderpandsvaartuig dichtheid (CVD) in equivalente ROIs overeenkomend met 20% van het totale oppervlak van de ledemaat. De CVD wordt berekend als de verhouding tussen het vasculaire gebied en de ROIs gebieden. Alle dichtheidsmetingen worden uitgevoerd met ImageJ-software.
Opmerking: de CVD-waarde van de niet-ischemische ledemaat voor elke muis wordt verondersteld te corresponderen met 100% om variaties in de anatomie, perfusie of diaphonisatie-procedures uit te sluiten. Het CVD-percentage in de ischemische ledemaat werd daarom berekend ten opzichte van de niet-ischemische. - Bepaal het percentage CVD toename als het verschil tussen het CVD-percentage tussen de ischemische en nonischemische ledematen.
- Laser Capture micro dissectie van capillairen
- Na anesthetiserende, offeren de muizen door cervicale dislocatie.
- Om de gastrocnemius spieren van beide benen te oogsten, verwijder de huid van muizen beide achterpoten.
- Identificeer de Achilles pees en scheid de pees van het bot met behulp van een 11-bladige scalpel.
- Houd de Achilles pees vast en scheid de spieren van het scheenbeen en het kuitbeen tot aan het kniegewricht met veer schaar.
- Scheid de biceps musculus femoris van de gastrocnemius-spier.
- Gebruik veer schaar om de inserties van de gastrocnemius spieren op het kniegewricht niveau te snijden.
- Plaats de geoogste gastrocnemius-spieren in een dwarse oriëntatie op een kleine kurk schijf met behulp van 10% Tragacanth.
- Maak de specimens in vloeibaar stikstofgekoeld isopentane en bewaar ze bij-80 °C tot het snijden is.
- Snijd op een cryostaat 12 μm delen van de spier specimens en monteer op glazen glijbanen.
Opmerking: voor RNA-bescherming Neem een voorgekookte glijbaan en raak de achterkant van de dia aan met uw vinger (handschoenen) om alleen de regio te verwarmen voor het plaatsen van de sectie. Breng de sectie over van het cryostatimes door aanraken met het verwarmde gebied en droog bij-20 °C in de cryostaat voor 2-3 min. Het protocol kan hier worden onderbroken.- Bevestig de glaasjes in een fles met gekoeld zuiver aceton (ongeveer 50 mL) gedurende 5 min bij-20 °C en lucht drogen.
- Gebruik een hydrofobe pen rond de secties.
Opmerking: het gebruik van de hydrofobe pen helpt bij het reduceren van de hoeveelheid tijdens het protocol bestede oplossingen. Voor alle incubaties wordt per sectie 100 μL van alle oplossingen gebruikt. - Rehydraat met 2 M NaCl/PBS bij 4 °C en incuberen de specimens 's nachts bij 4 °C met anti-CD31 rat monoklonaal antilichaam bij 1:500 in 2M NaCl/PBS.
- Was tweemaal in 2M NaCl/PBS voor een totaal van 6 min.
- Voeg een secundair biotinyated Rabbit anti-rat IgG antilichaam toe bij 1:200 in 2M NaCl/PBS en 5% konijnenserum gedurende 30 minuten bij 4 °C.
- Was in 2 M NaCl/PBS en voeg het gelabelde avidin-geconjugeerde peroxidase complex gedurende 30 minuten toe aan 4 °C.
- Spoel en voeg de DAB peroxidase substraat Kit toe voor 5 min.
- Dehydraat de secties in ijskoude 90% ethanol gevolgd door 100% ethanol en laat ze drogen.
- Dissect 10 000 capillairen per muizen met behulp van een laser microdissection systeem uitgerust met een gepulseerde Solid-State 355 nm laser en katapult de ontleed capillairen in een microfugebuis buis zelfklevende dop.
- RNA-extractie, cDNA-synthese, pre-amplificatie en RT-PCR
- Isoleer totaal RNA van de microdissected capillairen met behulp van een geschikte Kit, het totale RNA verkregen is tussen 1,5-3 ng/μL.
- Gebruik een cDNA-synthese Kit voor synthese en twee ronden pre-amplificatie, met behulp van de primers beschreven in tabel 1.
- Voer RT-PCR uit voor dezelfde doelen als beschreven in de vorige stap. Gebruik een programma bestaande uit een initiële denaturatiestap bij 95 °C gedurende 10 minuten, gevolgd door 50 cycli bij 95 °C gedurende 15 sec. en bij 60 °C gedurende 1 minuut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de beschreven protocol, navelstreng mesenchymale stamcellen en lage dosis ioniserende straling (ldir) werden getest als vermoedelijke angiogene therapieën 11,12. Laser Doppler perfusie lezingen werden verkregen vóór ischemie inductie en op vooraf gespecificeerde tijdspunten variërend van onmiddellijk na ischemie inductie tot 45 dagen post-ischemie. Weefsel perfusie lezingen door laser Doppler werden opgenomen als kleurgecodeerde beelden, zonder perfusie weergegeven als donkerblauw en de hoogste perfusie niveau weergegeven als rood. Zoals getoond in de figuren 2A en 3a en gekwantificeerd in figuren 2B en 3B, werd bij alle muizen een volledig verlies van de achterledematen waargenomen, onmiddellijk na de inductie van de achterste ledemaat ischemie, waardoor de reproduceerbaarheid van de techniek voor het induceren van hindledemaat ischemie. Belangrijk, de ernst van ischemie is vergelijkbaar bij alle dieren. Een ROI werd getekend rond de ischemische achterledemaat en een vergelijkbare ROI werd getekend rond de niet-ischemische achterledemaat om de kwantificering van perfusie uit te voeren. Perfusie wordt uitgedrukt als een verhouding van de perfusie in de ischemische ledemaat tot die in de niet-ischemische ledemaat. Veranderingen in de perfusie verhouding worden gemeten in de tijd.
Immunohistochemie werd uitgevoerd tussen 15 en 90-dagen post-ischemie. Diaphonisatie werd uitgevoerd tussen 19-en 90-dagen post-ischemie en capillaire micro dissectie tussen 45-en 70-dagen post-ischemie inductie ervoor te zorgen dat de verschillende Pro-angiogenic therapieën veroorzaakte een aanhoudende en langdurige proangiogenic effect.
Kwantificering van CD31-positieve capillairen in histologische secties van gastrocnemius spier beoordeeld de capillaire dichtheid en dit werd uitgedrukt als het aantal capillairen per aantal spiervezels. Zoals weergegeven in Figuur 4, was de capillaire dichtheid groter in de ischemische versus de niet-ischemische ledemaat.
Om de dichtheid van het onderpand vaartuig te evalueren, werden muizen diaphonized en werd een equivalente ROI, overeenkomend met 20% van het ledemaat, geselecteerd voor kwantificering. De dichtheid van het onderpand vaartuig nam consequent toe in de ischemische ledemaat, zodat gegevens over behandelde en controle ledematen werden uitgedrukt als het percentage van de extra dichtheid van de bloedvat dichtheids toename in de ischemische ledemaat relatief tot de niet-ischemische ledematen (Figuur 5 ).
Expressie van Pro-angiogene genen door ECs werd geanalyseerd door kwantitatieve RT-PCR van CD31-positieve cellen. Transcripten voor Vegfr2, Vegfr1, Fgf2, Angpt2, Pdgfc, Tgfb2, hgf, en met ontmoette toonden een duidelijke variatie in expressie tussen ischemische en niet-ischemische ledematen, uitsluitend in muizen blootgesteld aan de Pro-angiogene stimulus (Figuur 6).
Figuur 1 : Schematische illustratie van de anatomie van de muis hindledemaat vasculatuur toont de ligatie plaatsen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Ldir verhoogt perfusie herstel. Na chirurgische inductie van unilaterale HLI, werden beide achterpoten van C57BL/6 muizen gebestraling of bestraald met vier dagelijkse fracties van 0,3 Gy, in opeenvolgende dagen en toegestaan om te herstellen. (A) representatieve laser Doppler-stroom beelden vóór HLI, en op dagen 0 (D0) en 15 (D15) post-HLI-inductie. B) de kwantitatieve evaluatie van de bloedstroom, uitgedrukt als een verhouding van ISC tot NISC-ledemaat, toonde een significant verbeterde bloed perfusie van de ledematen in bestraalde muizen versus Sham-bestraald, zowel op dag 15 (D15) als op 45 (D45) post-HLI. Tussen-groepswijzigingen werden beoordeeld door twee-weg herhaalde metingen ANOVA gevolgd door Bonferroni post-hoc test (n = 12 muizen per groep). Betekent ± SEM worden weergegeven. P < 0,001; NS, niet significant. HLI, hindledemaat ischemie; ISC, ischemische; NISC, niet-ischemische; Pre-HLI, vóór hindledemaat ischemie. Aangepast vanaf 11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Navelstreng mesenchymale stamcellen (UCX) Verhoog perfusie herstel. UCX of hun voertuig (als controle) werden toegediend in de ischemische gastrocnemius-spier 5 uur na HLI-inductie. A) representatieve laser Doppler-stroom beelden vóór (vóór HLI), onmiddellijk na (D0 POST-HLI) en bij 7, 14 en 21 dagen na de HLI-inductie (D7 POST-HLI, D14 POST-HLI, D21 POST-HLI). B) de kwantitatieve evaluatie van de bloedstroom, uitgedrukt als een verhouding van ISC tot NISC-ledemaat, toonde significant verbeterde bloed perfusie van ledematen in navelstreng mesenchymale stamcellen-behandelde muizen na 7, 14 en 21 dagen na HLI. (n = 16 voor elke experimentele groep; D7: t (22,69) = 4,26; P ˂ 0,001; effect grootte was 1,51 en macht 0,98; D14: t (30) = 4,7; P ˂ 0,001; effect grootte was 1,66 en macht 0,99; D21: t (30) = 7,22; P ˂ 0,001; de grootte van het effect was 2,56 en Power 0,99). HLI, hindledemaat ischemie; ISC, ischemische; NISC, niet-ischemische. Aangepast vanaf11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Ldir verhoogt de capillaire dichtheid. A) representatieve gedeelten van Sham-bestraalde en bestraalde ischemische gastrocnemius-spieren op dag 45 na HLI. Capillairen en myocyten werden geïdentificeerd door respectievelijk CD31 immunohistochemie en hematoxyline. Schaalbalk, 150 mm.B) kwantitatieve analyse toonde verhoogde capillaire dichtheid (capillairen/Myocyte) in bestraalde ischemische gastrocnemius spieren in vergelijking met Sham-bestraalde ischemische die op dag 15 en 45 post-HLI. Gemengde ANOVA gevolgd door Bonferroni post-hoc test werd uitgevoerd met een binnen-onderwerp factor van ISC en tussen-onderwerp factoren van de dag en bestraling (n = 6 muizen per groep). Individuele gegevens en middelen ± SEM worden weergegeven. P < 0,001; NS, niet significant. ISC, ischemische; NISC, niet-ischemische. Aangepast vanaf11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Ldir verhoogt de onderpand dichtheid. A) illustratieve afbeeldingen van geselecteerde Rois voorschijn-bestraalde en bestraalde muizen. ISC en NISC ledematen op dag 90 post-HLI worden getoond. Schaalbalk, 300 mm.B) de gegevens worden weergegeven als het percentage van de CVD-toename van het ISC-ledemaat relatief ten aanzien van het nisc-gehalte. Op de dagen 15 en 90 na HLI presenteerden bestraalde muizen een significant hogere CVD-stijging (%) VS. Sham-bestraalde muizen. Twee richtingen ANOVA werd uitgevoerd gevolgd door Bonferroni post-hoc test met een tussen onderwerp factoren van de dag en bestraling (n = 6 muizen per groep). Individuele gegevens en middelen ± SEM worden weergegeven. * P < 0.05; P < 0,001; NS, niet significant. HLI, hindledemaat ischemie; ISC, ischemische; NISC, niet-ischemische. Aangepast vanaf11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6 : Ldir upregulates de uitdrukking van angiogene genen in ECs geïsoleerd van bestraalde ischemische gastrocnemius spieren. Na chirurgische inductie van unilaterale HLI, werden beide achterpoten van C57BL/6 muizen door een schijnvertoning bestraald of bestraald met vier dagelijkse fracties van 0,3 Gy, in opeenvolgende dagen en toegestaan om te herstellen. Op dag 45 na-HLI werd de expressie van Pro-angiogene factoren en hun receptoren door qRT-PCR uitsluitend geëvalueerd op ECs. Gastrocnemius spier secties werden gekleurd voor CD31. Individuele endotheliale CD31 + cellen werden gevisualiseerd, ontleed en geïsoleerd met behulp van een laser microdissection systeem. Elke staaf vertegenwoordigt de relatieve genexpressie in één dier. Witte en grijze staven vormen respectievelijk schijn-bestraalde en bestraalde muizen. Waarden zijn genormaliseerd naar 18S om relatieve uitdrukkings niveaus te verkrijgen. Resultaten uitgedrukt als LOG2 fold veranderingen tussen ischemische en niet-ischemische monsters toonde de relatieve overvloed van de transcripten in bestraalde muizen; daarentegen wordt een down-regulatie waargenomen bij muizen die zijn bestraald. Aangepast vanaf11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Vegfr1_f (5 '-TTGAGGAGCTTTCACCGAACTCCA-3 '); |
| Vegfr1_r (5 '-TATCTTCATGGAGGCCTTGGGCTT-3 '); |
| Vegfr2_f (5 '-AGGCCCATTGAGTCCAACTACACA-3 '); |
| Vegfr2_r (5 '-AGACCATGTGGCTCTGTTTCTCCA-3 '); |
| Pdgf-c_f (5 '-ATGCCACAAGTCACAGAAACCACG-3 '); |
| Pdgf-c_r (5 '-AAGGCAGTCACAGCATTGTTGAGC-3 '); |
| Met_f (5 '-ACGTTGAAATGCACAGTTGGTCCC-3 '); |
| Met_r (5 '-TTGCGTCGTCTCTCGACTGTTTGA-3 '); |
| Fgf2_f (5 '-ACTCCAGTTGGTATGTGGCACTGA-3 '); |
| Fgf2_r (5 '-AACAGTATGGCCTTCTGTCCAGGT-3 '); |
| Tgfb2_f (5 '-GCTTTGGATGCGGCCTATTGCTTT-3 '); |
| Tgfb2_r (5 '-CTCCAGCACAGAAGTTGGCATTGT-3 '); |
| Ang2_f (5 '-ATCCAACACCGAAGATGGCAGT-3 '); |
| Ang2_r (5 '-AACTCATTGCCCAGCCAGTACTCT-3 '); |
| Hgf_f (5 '-GCATTCAAGGCCAAGGAGAAGGTT-3 '); |
| Hgf_r (5 '-TCATGCTTGTGAGGGTACTGCGAA-3 '); |
| 18s_f (5 '-GCCCTATCAACTTTCGATTGGTAGT-3 '); |
| 18s_r (5 '-CCGGAATCGAACCCTGATT-3 '). |
Tabel 1: primers gebruikt voor de studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Murine-modellen van CLI bestonden voornamelijk uit ligatie van de femorale slagader die net de oorzaak was van de profunda musculus femoris 4,5,6,7,8,9. Dit heeft aangetoond dat het grootste deel van de onderpand circulatie intact blijft, wat de bloedtoevoer naar de ledemaat herstelt binnen 7 dagen 9. Verwijdering van het onderpand bed kan worden bereikt door excisie van de femorale slagader. Echter, tot een derde van de oorspronkelijke bloedstroom kan worden hersteld zodra 7 dagen na de ingreep, gezien het feit dat de meeste zekerheden vaten voortvloeien uit de interne iliacale slagader 7. Lejay et al heeft opeenvolgende ligaties voorgesteld met een tweede ligatie die wordt uitgevoerd op de gemeenschappelijke iliacale slagader, waardoor de neven perfusie van de interne iliacale slagader 4effectief wordt verminderd. Kritische stappen binnen dit protocol omvatten niet alleen de identificatie van de externe iliacale slagader net boven het inguinale ligament, maar ook de ligatie en excisie van de DISTAAL externe iliacale en femorale slagaders en aders, die een dubbel doel dienen: verhoging van de ernst van ischemie evenals ter verbetering van de technische reproduceerbaarheid van het model, als blootstelling van de dijbeen slagader alleen vaak resulteert in scheuren van de ader.
Een beperking van deze techniek is de acute onderbreking van de bloedtoevoer naar de ledemaat, die verschilt van het langdurige proces in verband met de opbouw van atherosclerotische plaque die leidt tot arteriële stenose en occlusie. Nog steeds, vermindering van de bloedtoevoer was goed na 2 weken, het vastgestelde tijdpunt voor de diagnose van chronische ischemie. Ook, collateralisatie werd verhoogd met de ischemische belediging alleen, die bootst het proces van onderpand vorming waargenomen in chronisch ischemische ledematen.
Neovascularisatie van ischemische ledematen omvat een complex samenspel van biologische gebeurtenissen, namelijk angiogenese en arteriogenese. Dit protocol omvat een verscheidenheid aan assays die de interferentie van putatieve angiogene therapieën op angiogene kiemen (capillaire dichtheid) en de ontwikkeling van het onderpand vaartuig (arteriogenese), het belangrijkste mechanisme in humane tolerantie aan de onderste ledematen ischemie. Tegelijkertijd wordt laser Doppler gebruikt voor het onthullen van de functie van deze nieuwe of vergrote vaten, en voor de eerste keer dat de laser microdissectie van capillairen wordt gebruikt om ECs te verzamelen die de moleculaire mechanismen onthult die functioneel herstel ten grondslag liggen. Dit protocol levert een reproduceerbaar diermodel dat de effecten van CLI kan nabootsen als een test norm wanneer de dieren worden behandeld met mogelijke angiogene therapieën die in de toekomst in een klinische context kunnen worden toegepast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We bedanken José Rino en Tânia Carvalho, de hoofden van de Bioimaging Facility en het laboratorium voor histologie en vergelijkende pathologie van het Instituto de Medicina moleculaire João Lobo Antunes. We danken ook Vyacheslav Sushchyk van het departement anatomie van Nova Medical School/Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Nova de Lisboa.
Financierings Referentie: project gefinancierd door UID/IC/0306/2016 Fundação para a Ciência e a tecnologia. Paula de Oliveira wordt ondersteund door een Fellowship (SFRH/BD/80483/2011) van Fundação para a Ciência e Tecnologia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7500 Fast Real-Time PCR | Applied Biosystems | Instrument | |
| Acetone | Merk | 1000141000 | Reagent; Caution - highly flammable |
| Adenosine | Valdepharm | Reagent | |
| Atipamezole | OrionPharma | Reagent | |
| Barium sulphate (Micropaque) | Guebert | 8671404 (ref. Infarmed) | Reagent |
| Buprenorphine | RichterPharma | Reagent | |
| Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit | Qiagen | 7335730 | Reagent |
| Cryostat Leica CM | Leica Microsystems | 3050S | Instrument |
| DAB peroxidase substrate kit | DAKO;Vector Laboratories | K3468 | Reagent |
| hydrogen peroxidase | Merk | 1072090250 | Reagent; Caution - nocif |
| hydrophobic pen | Dako | 411121 | Reagent; Caution - toxic |
| Ketamidor | Richterpharma | CN:580393,7 630/01/12 Dfvf | Reagent |
| Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR | MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK | 5710 | Instrument |
| Leica DM2500 upright brightfield microscope | Leica Microsystems | Instrument | |
| Medetor | Virbac | 037/01/07RFVPT | Reagent |
| methanol | VWR | UN1230 | Reagent; Caution - toxic and highly flammable |
| Papaverine | Labesfal | Reagent | |
| Pentano Isso | Merk | 1060561000 | Reagent; Caution - highly flammable |
| Power SYBR® Green | Applied Biosystems | 4309155 | Reagent |
| Purified rat anti-mouse CD31 | Pharmingen | 550274 | Reagent |
| RNeasy Micro kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Surgic-Pro 6.0 | Medtronic (Coviden) | VP733X | Suture |
| VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG) | Vectastain ABC kit; Vector Laboratories | PK-4004 | Reagent |
| Vicryl5.0/ Vicryl 6.0 | Medtronic (Covidien) | UL202/ UL101 | Suture |
| Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System | Carl Zeiss Microscopy, Germany | 1023290916 | Instrument |
| Stereotaxic microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| Digital camera | Linux | Instrument |
References
- Becker, F., et al. Chapter I: Definitions, epidemiology, clinical presentation and prognosis. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 Suppl 2, S4-S12 (2011).
- Fowkes, F. G., et al. Peripheral artery disease: epidemiology and global perspectives. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 156-170 (2017).
- Abu Dabrh, A. M., et al. The natural history of untreated severe or critical limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 62 (6), 1642-1651 (2015).
- Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).
- Sprengers, R. W., Lips, D. J., Moll, F. L., Verhaar, M. C. Progenitor cell therapy in patients with critical limb ischemia without surgical options. Annals of Surgery. 247 (3), 411-420 (2008).
- Lotfi, S., et al. Towards a more relevant hind limb model of muscle ischaemia. Atherosclerosis. 227 (1), 1-8 (2013).
- Masaki, I., et al. Angiogenic gene therapy for experimental critical limb ischemia: acceleration of limb loss by overexpression of vascular endothelial growth factor 165 but not of fibroblast growth factor-2. Circulation Research. 90 (9), 966-973 (2002).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Brevetti, L. S., et al. Exercise-induced hyperemia unmasks regional blood flow deficit in experimental hindlimb ischemia. Journal of Surgical Research. 98 (1), 21-26 (2001).
- Ministro, A., et al. Low-dose ionizing radiation induces therapeutic neovascularization in a pre-clinical model of hindlimb ischemia. Cardiovascular Research. 113 (7), 783-794 (2017).
- Pereira, A. R., et al. Therapeutic angiogenesis induced by human umbilical cord tissue-derived mesenchymal stromal cells in a murine model of hindlimb ischemia. Stem Cell Research Therapy. 7 (1), 145 (2016).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
