Summary
כאן, דמו של העכבר נאסף. בנוכחות אנטי-מקריש טסיות היו מטוהרים על ידי המדיום iohexol באמצעות מהירות נמוכה צנטריפוגה. טסיות הדם הופעלו עם תרומבין. כדי לחקור אם הם היו מעשי האיכות של טסיות מטוהר נותחו על ידי cy, מיקרוסקופ זרימה.
Abstract
טסיות מטוהרים מדם שלם כדי ללמוד את המאפיינים הפונקציונליים שלהם, אשר צריך להיות חופשי מתאי דם אדומים (RBC), כדוריות דם לבנות (WBC), וחלבונים פלזמה. אנו מתארים כאן טיהור של טסיות מתוך דם העכבר באמצעות שלושה מקפלים יותר מעבר מדרגה בינונית ביחס לנפח דגימת דם ו צנטריפוגה ברוטור דלי מנופף ב 400 x g עבור 20 דקות ב 20 ° c. ההתאוששות/תשואה של טסיות מטוהר היו 18.2-38.5%, ואת טסיות מטוהר היו במצב מנוחה, אשר לא מכילים כל מספר משמעותי של RBC ו-WBC. טסיות מטוהרים מטופלים עם תרומבין הגיע עד 93% הפעלה, המציין את הכדאיות שלהם. אנו מאשרים כי טסיות מטוהר הם טהורים מספיק באמצעות cytometric זרימה הערכה מיקרוסקופית. טסיות אלה ניתן להשתמש עבור ביטוי גנים, הפעלה, שחרור גרגר עושה מצבור, הדבקה assays. שיטה זו ניתן להשתמש לטיהור של טסיות מדם של מינים אחרים, כמו גם.
Introduction
טסיות הם רכיב של דם המתפקד כיוזם של קרישת דם בתגובה לנזק בכלי הדם. הם מתאספים באתר של פציעה. כדי לחבר את כלי הקיבול לקיר1 טסיות הם שברי אנוקלאט של ציטופלסמה הנגזר מהקרציטים של מח העצם תחת השפעת התרובטין ולהיכנס למחזור הדם2. הם נחשבים metabolically פעילים ומסוגלים לחוש הסביבה מסחטות על ידי הפעלת מפלי איתות תאיים כי התוצאה היא התפשטות טסיות, מצבור, ו הומוסטטית היווצרות תקע1,3. מלבד הומוסטזיס/פקקת וריפוי הפצע4, טסיות לשחק תפקיד חשוב בתגובות דלקתיות מארח, אנגיוגנזה, ו גרורות3,5,6,7, שמונה.
טסיות מטוהרים מדם ללמוד תכונות ביוכימיים ופיסיולוגיים שלהם, אשר צריך להיות חופשי מרכיבי דם אחרים. מאז כדוריות הדם האדומות (rbc) וכדוריות הדם הלבנות (wbc) מכילים באופן משמעותי יותר RNA וחלבונים מאשר טסיות9,10, נוכחות של מספר קטן של תאים אלה יכול להפריע לניתוח הטרנססקריפט והפרוטאומית של RNA וחלבונים הנגזרים מטסיות הדם. מצאנו כי טסיות מטוהרים מופעל עם נוגדנים לאגד תרומבין כגון אנטי GPIIb/IIIa (ג'ון/A) ו אנטי-P-selectin ביעילות רבה יותר מאשר טסיות דם שלמות.
מאחר שטסיות הן שבירות, חשוב לטפל בדגימות במתינות ככל האפשר. אם טסיות מופעלות, הם משחררים את תוכן הגרריר שלהם ובסופו של דבר לבזות. לכן, כדי לשמור על המאפיינים הפונקציונליים של טסיות שלמות, חשוב לשמור על השקט טסיות בזמן הבידוד. פרוטוקולים מספר תיארו בידוד של טסיות מן האדם, כלב, עכברוש, והפרימטים לא אנושיים על ידי שיטות שונות1,10,11,12. חלק מהשיטות דורשות שלבים מרובים כגון אוסף של פלזמה עשיר טסיות ידי צנטריפוגה, סינון על ידי הפרדת הטור, מבחר שלילי של טסיות עם הנוגדן הספציפי RBC-ו-WBC-מצוייחים לחרוזים מגנטיים, וכן הלאה, אשר זמן רב ועלול לבזות את הטסיות ואת תוכנם.
פורד ועמיתיו תיאר לטיהור טסיות דם אנושי באמצעות iohexol בינוני11. שיטה זו משתמשת בכמות דומה של דגימת דם ובינונית במהלך הטיהור. מאז בני האדם להניב נפח גבוה יותר של דם, קל יחסית לטהר את טסיות.
Iohexol היא צפיפות אוניברסלית מעבר הדרגתי בינונית, כי הוא מסיסים באופן חופשי במים ומשמש השבר של חומצות גרעין, חלבונים, פוליסכרידים, ו נוקלאופרוטאינים13,14. יש לו אוסמאליות נמוכה והוא לא רעיל, ובכך הופך אותו למדיום אידיאלי לטיהור של תאים חיים שלמים11. זהו מדיום שאינו חלקיקי; לפיכך, ניתן לקבוע את התפלגות התאים במעבר צבע באמצעות הומוציטומטר, הזרמת cytom, או ספקטרוסקופיה. היא אינה מפריעה לרוב התגובה האנזימטית או הכימית של התאים או החלקים הסלולריים לאחר דילול.
העכבר משמש מודל חשוב בעלי חיים עבור מחלות אנושיות רבות15,16,17,18. יש כמה מאמרים שפורסמו שמתארים טיהור של טסיות העכבר19,20. עם זאת, העכבר מניב נפח קטן יחסית של דם, מה שמקשה על טיהור טסיות. אם נעשה שימוש באותו כמות קטנה של בינוני ודגימות דם, שכבת הטסיות לא יכולה להיות מופרדת בבירור משכבת ה-RBC-WBC לאחר צנטריפוגה. במאמר זה, תיארנו שיטה מהירה ופשוטה של טיהור העכבר טסיות עם שלושה קיפול מעבר מדרגה גבוהה יותר בינונית ביחס לנפח דגימת הדם ומהירות נמוכה צנטריפוגה. בנוסף, הפעלנו את טסיות הדם הטהורה עם התרומבין וחקרו את איכותם בעזרת cy, והמיקרוסקופיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
אוסף דם העכבר צריך להתבצע עם טיפול בעלי חיים מוסדיים המתאים ולהשתמש אישור הוועדה.
הערה: פרוטוקול טיהור טסיות מתואר בדיאגרמת זרימה באיור 1.
1. אוסף דם
- הוסף 25 μL של 3.2% נתרן ציטראט (pH 7.2) כאנטי מקריש ו 0.4 mM של הפרו-Pro-Arg-Pro (GPRP) בצינור פוליפרופילן.
-
לאסוף כ 200 μL של דם מ C57BL/6 העכבר באמצעות מסלולית רטרו.
הערה: ניתן לאסוף דם מכל סוג של מאמץ העכבר ללא קשר לגיל או מין.- השתמש 2 מ ל של isofלוריאן בכל סוג של תא לההרדמה העכבר.
הערה: עומק ההרדמה נבדק על ידי סימנים של נשימה מוגברת וירידה בתנועה. העכבר לא צריך להגיב על התנועה של תא ההרדמה, או להיות מטופל. אם העכבר מגיב תנועה או טיפול, אז זה דורש יותר זמן לשמור בחדר ההרדמה. - 1.2.2 פתח את העפעף הימני או השמאלי של העכבר והכנס שפופרת קפילר 7.5 ס מ (בקוטר 0.12 ס מ) לתוך מקלעת כלי הדם של העין.
- סובבו את צינור הקפילר אחד לחצי להפוך תוך הפעלת לחץ על צינור נימי לשבור את כלי הדם וליזום זרימת דם. להחזיק את החיה הפוכה מעל בקבוקון האוסף להיות מלא על ידי פעולה קפילר.
- לאחר הנפח המתאים של דם נאסף, להסיר את צינור נימי ולסגור את העין על ידי החלת לחץ קל עבור 30 s על העפעף עם גזה. לאחר הפסקת דימום, להחזיר את העכבר לכלוב שלו לפקח על דימום.
- בדוק את העיניים של טראומה 1-2 ימים לאחר דימום מסלולית רטרו. להסיר את כל העכבר מן המחקר מראה סימנים של טראומה משמעותית לעין כתוצאה של ההליך המתת חסד.
הערה: העכבר לא צריך לעבור כל סוג של טיפול אשר יכול לעכב טסיות לפחות שבועיים לפני איסוף הדם. דגימת הדם חייבת לשמש לטיהור טסיות בתוך שעה אחת של דימום העכבר.
- השתמש 2 מ ל של isofלוריאן בכל סוג של תא לההרדמה העכבר.
2. טיהור דם
הערה: טיהור טסיות צריך להתבצע בטמפרטורת החדר כדי למנוע השפלה שלהם. ודא כי הטמפרטורה של הריאגנטים והמכשירים הם בין 18 ל -22 ° c. כדי למנוע השפלה טסיות, ליטוף מהיר וטלטול נמרץ יש להימנע במהלך ההליך.
- הוסף 600 μL של בינוני מעבר הצבע iohexol (12% iohexol אבקה ב 0.85% נתרן כלוריד, 5 מ"מ Tricine, pH 7.2)11 לתוך שפופרת 1.5 mL.
- הוסף 200 μL של דגימת דם לאט במורד הצד של הצינור על גבי המדיום מעבר הצבע עם טיפ מנשא משעמם רחב כך דם ו iohexol בינוני לא לערבב (איור 2A).
- צנטריפוגה את המדגם המכיל צינור ב 400 x g עבור 20 דקות ב 20 ° צ' ברוטור דלי מנופף עם האצה איטית והאטה.
- לאסוף את רוב שכבת טסיות עשיר וחלק קטן של שכבת טסיות-העניים (סך 300 עד 400 μL) באמצעות טיפ מנשא משעמם רחב מבלי להטריד את שכבות RBC ו-WBC (איור 2B). העבר את דגימת הטסיות. לשפופרת חדשה
הערה: אם ספירת טסיות היא פחות בדם או נפח קטן יותר של דם משמש, שכבה עשירה טסיות ושכבה הדלה טסיות ניתן לראות כשכבה אחת. - הוסף 1 mL של PBS לדגימת טסיות, לערבב על ידי היפוך, ו צנטריפוגה ב 800 x g עבור 10 דקות ב 20 ° c ברוטור דלי מנופף. למחוק את הפתרון לחלוטין ולהוסיף 200 μL של PBS להשעות את טסיות עם ליטוף קל.
הערה: שלב זה הוא אופציונלי, כפי שהוא מסיר את מעבר הצבע ואת החלבונים פלזמה ומגביר את הרגישות של טסיות לאגוניסטים כגון תרומבין. מאחר שבצנטריפוגות שונות יש תוכניות שונות, ניתן לקבוע את ההאצה האיטית/האטה על-ידי קריאת המדריך למשתמש של הצנטריפוגה. - העברה 30 μL של מדגם זה לתוך צינור חדש כדי לספור טסיות. טסיות שנותרו ניתן להשתמש עבור ביוכימיים ופיסיולוגיים כגון הפעלה טסיות, צבירה, שחרור גרגר עושה וכו '.
- עבור החילוץ RNA או חלבון, צנטריפוגה את דגימת טסיות ב 800 x g עבור 10 דקות כדי הגלולה טסיות. להיפטר באופן מוחלט מבלי להפריע לגלולה. הוסף את הנפח הרצוי של מאגר ה-RNA או לפירוק החלבון כדי ליאוס את טסיות.
3. ספירת טסיות
- לספור את כל התאים דם ללא דילול טסיות מטוהרים (מדולל 2 כדי 5-קיפול עם PBS) באמצעות מנתח התא אוטומטי. השתמש בדוגמיות של 30 עד 50 μL לספירה.
- לחשב את המספר הכולל של טסיות באמצעות הכפלת על ידי הדגימה של המדגם.
- חשב את אחוז התשואה/שחזור של טסיות מטוהרים.
- הרוזן RBC ו WBC במדגם טסיות מטוהר (מדולל 50 כדי 100-קיפול עם PBS) עם הומוציטוטומטר ומיקרוסקופ.
4. הפעלת טסיות דם
- בצינור, להוסיף 1 כדי 2,000,000 טסיות מטוהרים בתוך עד 100 μL של מאגר כתמים (PBS עם 2% סרום שור עוברי, FBS).
- עבור מספר מרובים של דגימות, לעשות שילוב מאסטר של נוגדנים עם 1 μL (0.5 mg/mL) של הבאים: PE-Cy7 עכברוש נגד עכבר TER 119, PE עכברוש נגד עכבר CD45, עכבר FITC עכברוש נגד העכבר CD41, ועכבר APC anti-mouse/אדם CD62P (P-selectin) כדי לזהות RBC, WBC, טסיות, טסיות דם מופעלות, בהתאמה. הוסף את התמהיל הראשי לצינורות לצביעת התאים. אין להוסיף את התרומבין.
- בצינור אחר, להוסיף 1 עד 2,000,000 של טסיות מטוהרים בתוך עד 100 μL של מאגר הצביעת, ו 0.4 mM GPRP פפטיד. הוסף את התרומבין כדי להפעיל את טסיות ולהכתים את התאים הבאים צעד 4.2.
הערה: יש להוסיף את GPRP למדגם לפני הוספת התרומבין כדי למנוע צבירה או מבנה קריש באמצעות הפעלת טסיות דם. ריכוז התרומבין צריך להיות מותאם כדי לקבל הפעלה טובה של טסיות. לאחר הפעלת טסיות דם, ספירות האירועים ירדו במהלך הרכישה של דגימות על ידי הזרמת cy, try. - כפקד חיובי, להוסיף 1 μL של דם שלם עד 100 μL כתמים מאגר בצינור ו 0.4 mM GPRP פפטיד. הוסף את התרומבין להפעלת טסיות. כפקד שלילי, להוסיף 1 μL של דם שלם עד 100 μL של מאגר הצביעת. אין להוסיף את התרומבין בדגימת שליטה שלילית. הכתם את התאים לאחר שלב 4.2.
- עבור הזרמת cy, הפקד isotype, תווית 5 צינורות עם בלתי מוכתם, PE-Cy7, PE, FITC, ו APC. הוסף 100 μL של מאגר כתמים, 1 μL של דם, ו-1 μL של הנוגדן המתאים לצינורות המסומנים כדי להכתים את התאים.
- מודטה דגימות לכתם עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
- שטוף את הדגימות על ידי הוספת 1 mL של מאגר הצביעת לכל צינור. צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. למחוק את מאגר הצביעת בזהירות מבלי לבטל את לינה את הגלולה.
- הוסף 300 μL של צביעת מאגר לכל צינורית, ערבב במתינות והעברה לשפופרת של FACS. אחסן את הדגימות המוכתמות בחשכה עד שנותחו באמצעות ציטוטומטר זורם.
5. הזרמת Cy, ניתוח של טסיות דם
-
צור ניסוי חדש וליצור מגרשים לפנים פיזור לעומת היומן מתווה פיזור נקודה ולהקצות שערים עבור Ter119 PE-Cy7 (rbc), CD45 PE (wbc), CD41 fitc (טסיות), ו-CD62P APC (טסיות מופעל) אוכלוסיות על פי אסטרטגיית הפגישה שנבחרה ל התנסות בתוכנה הדיווה של FACS.
- פתח את הירארכיית האוכלוסיה על-ידי בחירה באפשרות הצג הירארכיית אוכלוסיה תחת הכרטיסיה אוכלוסיות . ערוך את הירארכיית האוכלוסיה על-ידי בדיקת אסטרטגיית הפעולה ושינוי הצורה כראוי לשערים.
- פתח את תצוגת הסטטיסטיקה על-ידי בחירה באפשרות ' צור תצוגת סטטיסטיקה '. עריכת תצוגת סטטיסטיקה בהתאם להעדפות המשתמש על-ידי לחיצה ימנית על תצוגת הסטטיסטיקה ובחירה באפשרות ' עריכת תצוגת סטטיסטיקה '.
- בחר צבע עבור כל שער המשפר את ההיבט החזותי של הפריסה על-ידי לחיצה כפולה על התיבה התואמת לאוכלוסיה.
- בחלון Cytometer לחץ על הכרטיסייה פרמטרים ולהתאים את המתח עבור פרמטרים כדי להמחיש את אוכלוסיית העניין על המגרשים.
- התאם מתח עבור כל אחד מהפרמטרים כך שניתן יהיה להבדיל בין האוכלוסיה השלילית לבין האוכלוסיה החיובית. לפני הקלטת הדגימות עבור פקד הפיצוי, בדוק שהפקדים החיוביים המוכתמים בודדים נמצאים בקנה מידה (ודא שהפסגות החיוביות גלויות ולא רחוק מימין).
הערה: אם הפסגות החיוביות מחוץ לסולם, יש לכוונן את המתח כדי לראות את האוכלוסיות החיוביות. - הקלט את התאים המוכתמים בצבע יחיד עבור פקדי פיצוי (בלתי מוכתם, PE-Cy7, PE, FITC ו-APC).
- אם שערי השליטה החיוביים אינם מוגדרים כראוי, התאימו אותם על-ידי שינוי מתח.
- עבור להתנסות ≫ התקנת פיצוי ≫ חישוב פיצוי. בחר באפשרות ' החל רק ' בחלון המתקבל.
- עבור לגליון העבודה הגלובלי על-ידי לחיצה על לחצן דו-מצבי בחלק העליון, משמאל לחלון גליון העבודה.
- טען את דגימת הבקרה החיובית ורכוש מספיק תאים כדי לכוונן את הפיצוי ואת השערים.
- לטעון את המדגם שוב ולבדוק כי כל העלילה מציגה את אוכלוסיית התא צפוי בהתבסס על הנוגדן fluorochrome מוכתם. לרכוש ולהקליט 100,000 אירועים עבור דגימות דם שלמות ו 10,000 אירועים עבור טסיות מטוהרים. טען את הדגימות בזה אחר זה עד להשלמת הרכישה.
- לנתח את cy, הזרמת נתונים עם התוכנה עם מגרשים ושערים מתאימים (איור 3)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סיכום של טיהור טסיות מתואר בדיאגרמת זרימה (איור 1). השלבים כוללים אוסף של דם מהעכבר באמצעות מסלולית רטרו בנוכחות של נוגד קרישה, תוספת של דגימת דם על בינוני הדרגתי iohexol, צנטריפוגה ברוטור דלי מנופף ב 400 x g עבור 20 דקות ב 20 ° c. האיכות של טסיות מטוהר הוערך עם מיקרוסקופ וזרימה cy, לאחר להכתים עם נוגדנים לזהות כל התאים מזהם טסיות מופעל.
המדיום מעבר הדרגתי ודגימת הדם יצרה שתי שכבות נפרדות בצינור, אם הדם התווסף לאט למדיום (איור 2 א). עם זאת, אם יש עיכוב בשלב זה, רוב דגימת הדם יכול להיות מפוזר לתוך המדיום וזה עלול להיות קשה לטהר את טסיות. הטיפים הרחבים מובטחת ללא לחץ פיסי לטסיות הדם שחשוב לשמור על השלמות של טסיות ולמנוע את ההשפלה שלהם. במהלך צנטריפוגה, האצה איטית סייעה למנוע ערבוב של דגימת דם עם האטה בינונית ואיטית שסייעה לשמור על מעבר הצבע לאחר צנטריפוגה. הרובד העליון (צבע קש) הכיל את הפלזמה ולא כולל סוגים של כדוריות דם שלמות, השכבה השנייה (לבנבן) מלמעלה הכיל את החלק העליון של טסיות אשר נאסף באמצעות טיפ רחב מנשא הצינורות, השכבה השלישית (שקוף) היה מסכן טסיות שנאסף באופן חלקי בקפידה כדי למנוע שאיפה של השכבה התחתונה (אדום) RBC ו WBC (איור 2B). השכבה עשיר טסיות ושכבה דלה טסיות לא יכול להיות מופרדים אם ספירת טסיות היו נמוכות בדגימת הדם. שכבת RBC ו-WBC לא ניתן לראות כשכבות נפרדות מאז נפח הדם היה קטן. עם זאת, WBC טפסים שכבה לבנה, שנקרא מעיל באפי בין שכבה העניים טסיות ו RBC שכבה אם נפח גדול יותר של דם משמש טיהור10, 11. חשוב לבצע את כל התהליך ב -18 עד 22 ° c. גם הטמפרטורה והקירור הגבוהים יותר של הדגימות הניבו ספירות טסיות נמוכות יותר עקב השפלה.
מצאנו 18.2 כדי 38.5% (27.1 ± 6.5%, n = 12) התאוששות/תשואה של טסיות מטוהרים. לחקור את הכדאיות שלהם, דגימות טסיות מטוהרים הופעלו עם תרומבין. ניתוח ציטומטלי זרימה של דגימות טסיות נעשו לאחר הצביעת עם סמנים עבור טסיות, טסיות מופעל, RBC, ו WBC. הדם כולו הראה אוכלוסיות נפרדות של RBC, WBC, וטסיות על לוגריתמי קדימה פיזור לעומת הצד פיזור העלילה נקודה (איור 3A), ואילו טסיות מטוהר הראו אוכלוסיה ברורה עם מספרים זניחים של rbc ו wbc (איור 3a ). כל הדם הראה RBC ו WBC לאחר להכתים אותם עם אנטי עכבר Ter119 ואנטי עכבר CD45 נוגדן (איור 3C) ואילו טסיות מטוהר הראו מספר זניח של rbc ו Wbc (איור 3c). הערכנו את דגימת טסיות הדם הטהורה במיקרוסקופ ולא ראיתי מספר משמעותי של RBC ו-WBC שלמים. לכן, אירועי RBC ו-WBC אשר הוצגו באיור 3D עשויים להיות שברי rbc ו-wbc המכילים TER119 ו CD45, בהתאמה. טסיות מטוהרים שלא טופלו עם תרומבין הראה כמעט ללא הפעלה המציינת את מצב המנוחה שלהם (איור 3E), ואילו טסיות מטוהרים שטופלו עם תרומבין הראה 71% הפעלה (עד 93% הפעלה נצפתה בדגימות מסוימות) ( איור 3F) המצביעים על יכולת הקיום שלהם. כמו כן, בוצעו הערכה מיקרוסקופית של דגימות טסיות מטוהרים שאינם מטופלים עם תרומבין שלא הראה צבירת טסיות (איור 4A), עם זאת, טסיות מטוהר יצרו אגרגטים לאחר טיפול בתרומבין (איור 4a), אשר מצביעים עוד יותר על הכדאיות שלהם. בהתבסס על סייטוטריק הזרימה ומחקרים מיקרוסקופיים, אנו אישר כי טסיות מטוהרים שלנו היו באיכות טובה.
איור 1: דיאגרמת סכמטית לטיהור של טסיות העכבר. דגימת דם מהעכבר נאספה. בנוכחות נוגד קרישה דגימת הדם מתווספת באיטיות אל המדיום המדרגתי והcentrifuged ב-400 x g במשך 20 דקות ב-20 ° c. שכבת הטסיות מועברת לשפופרת חדשה. האיכות של טסיות מטוהרים נבדק עם מיקרוסקופ וזרימה cy, לנסות. טסיות ניתן להשתמש באופן מיידי או מאוחסן ב-80 ° c. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2:. דם העכבר לפני ואחרי צנטריפוגה עם המדיום הדרגתי Iohexol. (א) iohexol וצורת דם שתי שכבות נפרדות לפני צנטריפוגה אם דגימת הדם מתווספת בזהירות. החלונית השמאלית מציגה דיאגרמה סכמטית והחלונית הימנית מציגה את התמונה בפועל. (ב) ארבע שכבות נפרדות מראות לאחר צנטריפוגה של דם שלם עם בינוני מעבר צבע. החלונית הימנית מציגה דיאגרמה סכמטית של השכבות והחלונית הימנית מציגה את התמונה בפועל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ניתוח ציטומטרי זרימה של טסיות מטוהרים. (א) דם שלם מראה RBC, wbc, ואוכלוסיות טסיות. (ב) טסיות מטוהרים מציגות מספר מינורי של אירועי rbc ו-wbc. (ג) דם שלם מראה RBC ו wbc לאחר הצביעת עם אנטי עכבר Ter119 ונגד עכבר CD45. (ד) טסיות מטוהרים להראות מספר זניח של rbc ואירועים wbc לאחר כתמים עם אנטי עכבר Ter119 ונגד עכבר CD45. (ה) טסיות מטוהרים מוכתם נגד עכבר CD41 ו נגד העכבר/אדם P-selectin להראות כמעט ללא הפעלת טסיות. (ו) טסיות מטוהרים שטופלו עם תרומבין ומוכתם עם CD41 נגד העכבר ונגד העכבר/אדם P-selectin להראות הפעלה של טסיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הערכה מיקרוסקופית של טסיות מטוהרים. (א) טסיות מטוהרים אינן מציגות צבירה כלשהי. (ב) טסיות מטוהרים שטופלו בצבירת הצגת התרומבין. שני הדמויות הן 200x הגדלה, עדשת העינית 10x ו המטרה 20x עדשה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בדרך כלל, טסיות מבודדות על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה אשר מניב פלזמה עשיר טסיות המכיל מספר משמעותי של כדוריות הדם, הפסולת התאית, וחלבונים פלזמה אשר יכול להפריע הביוכימי והפיסיולוגיים והצרכים הפיזיולוגיים טיהור נוסף21. לכן, חשוב להשתמש בשיטה מהירה ופשוטה אשר יכולה להניב טסיות טהור ללא מזהמים גדולים. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את טיהור של טסיות מ דם העכבר באמצעות בינוני מעבר הצבע עם מהירות נמוכה צנטריפוגה. הפרמטרים המשמשים פרוטוקול זה למקסם את התשואה ולמזער את ההשפלה של טסיות. בינוני וחלבונים פלזמה ניתן להסיר על ידי כולל צעד כביסה לאחר איסוף טסיות אשר יכול להגביר את הרגישות של טסיות ל אגוניסט או נוגדן. והכי חשוב, טסיות מטוהר הן במצב מנוחה, אבל הם יכולים להיות מופעלים בנוכחות אגוניסט, כגון תרומבין. מצאנו שפעילות התרומבין משתנה ממקור אחד למשנהו. לכן, ריכוז התרומבין צריך להיות מיטבי כדי לקבל הפעלה טובה של טסיות.
בשל נפח קטן של דם העכבר, זה לא נוח לטהר את טסיות כי טסיות יכול להיות מעורב עם RBC ו-WBC במהלך השאיפה. פתרנו את הבעיה על ידי אופטימיזציה של היחס של דגימת דם ובינוניות מעבר צבע. מצאנו כי שלושה קיפול יותר בינוני מעבר הצבע ביחס לנפח הדם יכול בבירור להפריד את שכבת טסיות מן הסרום ו RBC-WBC שכבות אשר מקלה על אוסף קל של טסיות טהור.
יש לבצע טיהור דם בטמפרטורת החדר בין 18 ל -22 ° צ' כדי למנוע את ההשפלה שלהם. זה דווח כי טסיות לבזות אם מאוחסן במקרר או טמפרטורות מעל 27 ° c11. ליטוף מהיר וטלטול נמרץ יש להימנע כדי למנוע השפלה טסיות במהלך טיהור. מאחר שלצנטריפוגות שונות יש תוכניות שונות, יש לקבוע את ההאצה/ההאטה בצורה מדעית כדי לשמור על מעבר הצבע.
אם כמה דגימות דם העכבר משמשים טיהור, הדימום צריך להיעשות בפחות 1 h וטיהור צריך להסתיים בתוך 1 h. אם דגימות דם נותרו יותר 2 h, טסיות לא יכול להיות מטוהר עקב השפלה שלהם. אם טסיות יותר נחוצים עבור כל מחקר, דם העכבר יכול להיות נאסף על ידי הליכים מסופים כגון ניקוב לב או דימום והבנה המטה הנחותים, אשר תשואה 800 כדי 1,000 דם μl, וטיהור טסיות צריך להתבצע בצינורות מרובים ו שילוב לאחר הטיהור.
לסיכום, תיארנו פרוטוקול פשוט ומהיר עבור טיהור טסיות מנפח קטן של דם העכבר. ניתן להשתמש בשיטה זו גם לטיהור טסיות ממינים אחרים. טסיות מטוהר ניתן להשתמש עבור ביטוי גנים, הפעלה ושחרור הגרריר, מצבור, והדבקה מספרת על גירוי עם אגוניסטים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים לא מצהירים. על ניגוד אינטרסים
Acknowledgments
עבודה זו היתה נתמכת על ידי סטארט-up מימון של הקרן המחקר של סינסינטי לילדים ואוניברסיטת סינסינטי מענק הפיילוט Translational M.N. אנחנו רוצים להודות הילדים סינסינטי בבית החולים מחקר זרימה Cy, ליבה על השירותים שלהם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin) | Thermoscientific | 17-0626-82 | Platelets activation marker |
| Eppendorf tube | Fisher Scientific | 14-222-166 | Tube for centifuge |
| FACS DIVA software | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FACS tube | Fisher Scientific | 352008 | Tubes for flow cytomtery |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | Ingredient for staining buffer |
| FITC rat anti-mouse CD41 | BD Biosciences | 553848 | Platelets marker |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FlowJo software | FlowJo, Inc. | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) | EMD Millipore | 03-34-0001 | Prevent platelet clot formation |
| Hematocrit Capillary tube | Fisher Scientific | 22-362566 | Blood collection capillary tube |
| Hemavet | Drew Scientific | Non-catalog item | Blood cell analyzer |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | Cell counting chamber |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Use to Anesthetize mouse |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Nycodenz (Histodenz) | Sigma-Aldrich | D2158 | Gradient medium |
| PE rat anti-mouse CD45 | BD Biosciences | 561087 | WBC marker |
| PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119 | BD Biosciences | 557853 | RBC marker |
| Pipet tips 200 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-1A | Transferring blood and platelet samples |
| Pipet tips 1000 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-2C | Transferring blood and platelet samples |
| Phosphate buffured saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14040-117 | Buffer for washing and dilution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Physiological saline |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | 02-688-26 | Anti-coagulant |
| Staining buffer | In-house | Non-catalog item | Wash and dilution buffer |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | Solvent |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Swinging bucket rotor centrifuge |
| Thrombin | Enzyme Research Laboratoty | HT 1002a | Platelet activation agonist |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | Buffer for Nycodenz medium |
References
- de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Insights into platelet-based control of coagulation. Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).
- Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E. Interpreting the developmental dance of the megakaryocyte: a review of the cellular and molecular processes mediating platelet formation. British Journal of Haematology. 165 (2), 227-236 (2014).
- Weyrich, A. S., Zimmerman, G. A. Platelets: signaling cells in the immune continuum. Trends in Immunology. 25 (9), 489-495 (2004).
- Nami, N., et al. Crosstalk between platelets and PBMC: New evidence in wound healing. Platelets. 27 (2), 143-148 (2016).
- Mancuso, M. E., Santagostino, E. Platelets: much more than bricks in a breached wall. British Journal of Haematology. 178 (2), 209-219 (2017).
- Hampton, T. Platelets' Role in Adaptive Immunity May Contribute to Sepsis and Shock. Journals of the American Medical Association. 319 (13), 1311-1312 (2018).
- Sabrkhany, S., Griffioen, A. W., Oude Egbrink, M. G. The role of blood platelets in tumor angiogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1815 (2), 189-196 (2011).
- Menter, D. G., et al. Platelet "first responders" in wound response, cancer, and metastasis. Cancer and Metastasis Reviews. 36 (2), 199-213 (2017).
- Fink, L., et al. Characterization of platelet-specific mRNA by real-time PCR after laser-assisted microdissection. Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 749-756 (2003).
- Trichler, S. A., Bulla, S. C., Thomason, J., Lunsford, K. V., Bulla, C. Ultra-pure platelet isolation from canine whole blood. BioMed Central Veterinary Research. 9, 144 (2013).
- Ford, T. C., Graham, J., Rickwood, D. A new, rapid, one-step method for the isolation of platelets from human blood. Clinica Chimica Acta. 192 (2), 115-119 (1990).
- Noisakran, S., et al. Infection of bone marrow cells by dengue virus in vivo. Experimental Hematolology. 40 (3), 250-259 (2012).
- Rickwood, D., Ford, T., Graham, J. Nycodenz: a new nonionic iodinated gradient medium. Analytical Biochemistry. 123 (1), 23-31 (1982).
- Graham, J. M., Ford, T., Rickwood, D. Isolation of the major subcellular organelles from mouse liver using Nycodenz gradients without the use of an ultracentrifuge. Analytical Biochemistry. 187 (2), 318-323 (1990).
- Milligan, G. N., et al. A lethal model of disseminated dengue virus type 1 infection in AG129 mice. Journal of General Virology. 98 (10), 2507-2519 (2017).
- Strassel, C., et al. Lentiviral gene rescue of a Bernard-Soulier mouse model to study platelet glycoprotein Ibbeta function. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (7), 1470-1479 (2016).
- Bergmeier, W., Boulaftali, Y. Adoptive transfer method to study platelet function in mouse models of disease. Thrombosis Research. 133, S3-S5 (2014).
- Bakchoul, T., et al. Recommendations for the use of the non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency mouse model in autoimmune and drug-induced thrombocytopenia: communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (5), 872-875 (2015).
- Aurbach, K., Spindler, M., Haining, E. J., Bender, M., Pleines, I. Blood collection, platelet isolation and measurement of platelet count and size in mice-a practical guide. Platelets. , 1-10 (2018).
- Jirouskova, M., Shet, A. S., Johnson, G. J. A guide to murine platelet structure, function, assays, and genetic alterations. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), 661-669 (2007).
- Birschmann, I., et al. Use of functional highly purified human platelets for the identification of new proteins of the IPP signaling pathway. Thrombosis Research. 122 (1), 59-68 (2008).
