Summary
Viene presentato un metodo conveniente, veloce ed economico per misurare la proporzione di cellule della popolazione laterale nelle linee cellulari tumorali solide.
Abstract
Le cellule staminali tumorali (CSC) sono una causa importante di crescita tumorale, metastasi e recidiva. L'isolamento e l'identificazione dei CSC sono di grande importanza per la ricerca sul tumore. Attualmente, diverse tecniche sono utilizzate per l'identificazione e la purificazione dei CSC dai tessuti tumorali e dalle linee cellulari tumorali. La separazione e l'analisi delle cellule della popolazione laterale (SP) sono due dei metodi comunemente usati. I metodi si basano sulla capacità dei CSC di espellere rapidamente coloranti fluorescenti, come hoechst 33342. L'efflux del colorante è associato ai trasportatori di cassette di legame ATP (ABC) e può essere inibito dagli inibitori del trasportatore ABC. Vengono descritti i metodi per la colorazione delle cellule tumorali coltivate con Hoechst 33342 e l'analisi della proporzione delle loro cellule SP mediante citometria a flusso. Questo test è conveniente, veloce ed economico. I dati generati in questo saggio possono contribuire a una migliore comprensione dell'effetto dei geni o di altri segnali extracellulari e intracellulari sulle proprietà di staminali delle cellule tumorali.
Introduction
Le cellule staminali tumorali (CSC) sono sottoinsiemi di cellule con capacità di autorinnoto e potenziale di differenziazione multipla, che svolgono un ruolo vitale nella crescita tumorale, metastasi erecidiva 1,2. Attualmente, i CSC sono stati identificati per esistere in una varietà di tumori maligni, tra cui tumori polmonari, cerebrali, pancreas, prostata, seno e fegato3,4,5,6,7,8,9. L'identificazione dei CSC in questi tumori si basa principalmente sulla presenza di proteine marcatori superficiali, come l'alta e/o bassa espressione di CD44, CD24, CD133 e Sca-19,10, ma un marcatore unico in grado di distinguere le CSC dai non CSC non è stato segnalato finora. Attualmente, diverse tecniche sono utilizzate per identificare e purificare i CSC nei tessuti tumorali o nelle linee cellulari tumorali. Queste tecniche sono progettate in base alle proprietà specifiche dei CSC. Tra questi, i saggi e lo smistamento delle cellule della popolazione laterale (SP) sono due dei metodi comunemente usati.
Le cellule SP sono state originariamente scoperte da Goodell etal. Quando le cellule del midollo osseo del topo furono etichettate con il colorante fluorescente Hoechst 33342, un piccolo gruppo di cellule macchiate di hoechst 33342 appariva nel grafico a punti bidimensionale di un saggio di citometria a flusso. Hoechst 33342 è un colorante legante il DNA e ha almeno due modalità di legame che portano a diverse caratteristiche spettrali. Quando si visualizza l'emissione di fluorescenza a due lunghezze d'onda contemporaneamente, è possibile rivelare più popolazioni12. Nel loro saggio, l'Hoechst 33342 era eccitato a 350 nm e la fluorescenza è stata misurata utilizzando il filtro passa-banda (BP) da 450/20 nm e il filtro perimetrale long-pass (EFLP)11da 675 nm. Rispetto all'intera popolazione di cellule del midollo osseo, questo gruppo di cellule è stato arricchito con cellule staminali ematopoietiche chiamate cellule SP11. Le cellule SP sono in grado di espellere rapidamente hoechst 33342. L'efflux di questo colorante è correlato ai trasportatori di cassette di legame ATP (ABC)13, che possono essere inibiti da alcuni agenti come Fumitremorgin C14,Verapamil e Reserpine15,16. Successivamente, diverse proporzioni di cellule SP sono state rilevate in una varietà di tessuti, organi, tessuti tumorali e linee cellulari tumorali17,18,19. Queste cellule SP hanno molte caratteristiche delle cellule staminali17,19.
Questo manoscritto descrive l'etichettatura e la colorazione hoechst 33342 delle cellule tumorali coltivate e l'analisi delle cellule SP per citometria del flusso. Inoltre, vengono mostrate l'ottimizzazione della concentrazione di Hoechst 33342 e la corretta selezione del bloccante per una specifica linea cellulare tumorale utilizzando questo approccio. Infine, vengono dimostrati gli effetti della promozione della staminalità o dei segnali di inibizione sulla proporzione di SP nelle cellule tumorali. Gli esempi sperimentali dimostrano che l'analisi della SP può essere utilizzata per esplorare gli effetti di vari segnali, come l'espressione genica, piccoli inibitori, attivatori, citochine e chemiochine, sulla staminali tumorale. Rispetto ad altri metodi per l'isolamento e la purificazione dei CSC, come lo smistamento di CD44+/CD24– popolazione, analisi dell'aldeide deidrogenasi (ALDH) e test di formazione della sfera tumorale, questo metodo è più facile da manipolazione ed è conveniente.
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Protocol
1. Preparazione cellulare
- Digestione cellulare e neutralizzazione
- Seminare cellule tumorali (come le cellule MDA-MB-231) in una piastra di 6 pozzi e culturerle in un incubatore a 37 °C fornito con 5% di CO2.
- Raccogli le cellule quando la loro densità raggiunge circa il 90%. Aspirare accuratamente il mezzo di coltura e lavare accuratamente le cellule 2x con 3 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
NOTA: Per esaminare gli effetti degli inibitori della via di segnalazione (ad esempio, inibitore di FRA1) o attivatori (ad esempio, attivatore STAT3) sulle caratteristiche di staminali delle cellule tumorali, le cellule tumorali vengono sementi in una piastra di 6 po po 'e pretrattate con inibitori o attivatori per un certo periodo di tempo prima del raccolto. - Aggiungere 500 μL dello 0,25% di tripsiderina-EDTA ad ogni pozzo della piastra a 6 pozzetti, posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 °C per 1-3 minuti (min) e toccare delicatamente la piastra per staccare le cellule.
NOTA: La digestione prolungata influenzerà il profilo SP a causa di cambiamenti nella vitalità cellulare. - Aggiungere 3 mL di PBS integrato con il 2% di siero bovino fetale (FBS) ad ogni pozzo della piastra a 6 pozzi per terminare la digestione e pipettare delicatamente le cellule su e giù 3-5x per disperdere i grumi cellulari.
- Aggiungere 0,5 mL di sospensione cellulare a un pozzo di una nuova piastra da 6 porri ed esaminarla al microscopio. Se si osservano grumi cellulari, passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 μM.
NOTA: questo è un passaggio facoltativo. - Trasferire le celle in un tubo di centrifuga da 15 ml. Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 min per le celle a pellet. Rimuovere il supernatante e riprenotarli in 3 mL di PBS integrati con FBS al 2%. Pipettare le celle su e giù 3-5x per mescolare accuratamente.
- Conteggio celle
- Aggiungere 50 μL della sospensione cellulare in un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml e mescolarlo con una soluzione blu trypan da 50 μL. Pipetta 10 μL della miscela per contare il numero di cellule viventi usando un metodo standard, come un emocitometro.
- Diluire le cellule in PBS integrato con FBS al 2% ad una concentrazione finale di 1 x 106 celle/mL. Aggiungere 1 ml della sospensione cellulare a una provetta rotonda in polistirolo di 5 ml e preparare due provette campione.
2. Colorazione cellulare con Hoechst 33342
- Aggiungere hoechst 33342 a un tubo per raggiungere un'adeguata concentrazione finale.
NOTA: Ad esempio, la concentrazione appropriata di Hoechst 33342 è di 3 μg/mL per le celle MDA-MB-231. - Aggiungere un bloccante (ad esempio Fumitremorgin C, Verapamil o Reserpine) ad un altro tubo ad un'adeguata concentrazione finale e incubare il tubo a 37 °C per 30 minuti prima di aggiungere la stessa concentrazione di Hoechst 33342 descritta al passaggio 2.1.
NOTA: Per le celle MDA-MB-231, il blocco appropriato è il reserpina (40 μM). La reserpina viene utilizzata come controllo di blocco per verificare l'assenza di celle nell'area SP gated. - Preparare diversi tubi contenenti celle e aggiungere Hoechst 33342 a diversi gradienti di concentrazione. Dopo un saggio di citometria del flusso, scegliere la giusta concentrazione in base al profilo e alla proporzione di SP.
NOTA: Questo è un passaggio opzionale utilizzato per definire la corretta concentrazione di Hoechst 33342. - Preparare diversi tubi contenenti celle, aggiungere il bloccante a diversi gradienti di concentrazione, incubare i tubi a 37 °C per 30 minuti, quindi aggiungere Hoechst 33342 a una concentrazione appropriata. Dopo il saggio di citometria del flusso, scegliere la giusta concentrazione in base all'assenza di cellule nell'area SP gated.
NOTA: Questo è un passaggio facoltativo utilizzato per definire la corretta concentrazione di bloccante. - Posizionare i tubi in un incubatore a 37 °C e incubarli per 60 minuti, scuotendo i tubi ogni 10 minuti.
NOTA: Scuotere accuratamente i tubi è importante per la colorazione, perché garantisce un contatto completo tra le cellule e il colorante per risultati di colorazione migliori. - Dopo l'incubazione, centrifugare le cellule a 200 x g, 4 °C per 5 minuti e aspirare attentamente il supernatante, perché le cellule formano pellet molto sciolti e instabili.
- Celle resuspend di ogni tubo in 1 ml di PBS ghiacciato integrato con FBS al 2% e pipettare le celle su e giù 3-5x per mescolare accuratamente. Aggiungere 1 μL di 1 mg/mL di propididio ioduro (PI) alla sospensione di ciascun tubo per identificare le cellule morte.
NOTA: Tutte le procedure in questo passaggio devono essere eseguite a 4 °C per inibire l'efflusso di Hoechst 33342 dalle cellule tumorali. I tubi devono essere protetti dall'esposizione diretta alla luce.
3. Analisi per citometria del flusso
NOTA: Le istruzioni per l'uso del software del citometro di flusso (vedi Tabella dei materiali) sono descritte in questa sezione e nelle figure supplementari 1-10.
- Nel software del citometro di flusso fare clic sul pulsante CARTELLA. Fare clic sul pulsante Esperimento, quindi su Nuovo esperimento ( Figura supplementare1A,B).
- Fare clic sul pulsante OK. "Experiment_001" verrà mostrato nella cartella (Figura complementare 2A,B).
- Fare clic Experiment_001 pulsante di modifica per modificare il nome della cartella in un nome specifico (ad esempio, "20191118-SP"). Fare clic su Invio. Il nuovo nome ("20191118-SP") verrà visualizzato in FOLDER (Supplementary Figure 3A,B).
- Fare clic sul pulsante Nuovo campione per aggiungere un campione alla nuova cartella dell'esperimento ("20191118-SP"). Fate clic sul pulsante Nuovo tubo (New Tube) per aggiungere un tubo al campione. Fare clic sul pulsante Freccia ( Figuracomplementare 4A-C).
- Fare clic sul pulsante Parametri e impostare i parametri del citometro di flusso (Figura complementare 5).
- Utilizzare un dmsp (Dichroic Mirror Short-Pass) a 610 nm per separare le lunghezze d'onda di emissione. Utilizzare un filtro BP da 450/20 nm per raccogliere la fluorescenza blu e un EFLP da 675 nm per raccogliere la fluorescenza rossa.
NOTA: Hoechst 33342 è eccitato con un laser UV a 355 nm e PI è eccitato a 488 nm.
- Utilizzare un dmsp (Dichroic Mirror Short-Pass) a 610 nm per separare le lunghezze d'onda di emissione. Utilizzare un filtro BP da 450/20 nm per raccogliere la fluorescenza blu e un EFLP da 675 nm per raccogliere la fluorescenza rossa.
- Eseguire i campioni di cella sul citometro di flusso.
NOTA: le cellule SP possono essere ordinate per cernita cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) in condizioni sterili. Un totale di 100.000-500.000 cellule dovrebbero essere raccolte per gli esperimenti di follow-up.- Eseguire celle macchiate con Hoechst 33342 sul citometro di flusso.
- Posizionare tubi contenenti celle macchiate con Hoechst 33342 sul citometro.
- Fate clic sul pulsante Traccia punti (Dot Plot) per visualizzare il tracciato punti, quindi fate clic sull'asse X e impostatelo su "FSC-A"; fare clic sull'asse Y e impostarlo su "PI-A". Visualizzare il tracciato di punti dell'area dell'impulso di dispersione in avanti (FSC-A, asse X impostato sulla modalità lineare) rispetto alla fluorescenza PI (asse Y impostato sulla scala logaritmica). Regolare le tensioni per mostrare le celle viventi nel lato destro e le celle non viventi, che sono brillantemente macchiate di PI, nell'angolo in alto a sinistra. Stabilire quindi un gate poligonale per escludere le celle morte e i detriti cellulari (Figura 1A) facendo clic sul pulsante Porta poligono per gateare il sottoinsieme P1, noto anche come sottoinsieme FSC-A, PI-A (Figura supplementare 6A,B).
- Fate clic sul pulsante Traccia punti (Dot Plot) per visualizzare il tracciato punti, fate clic sull'asse X e impostatelo su "FSC-A"; fare clic sull'asse Y e impostarlo su "FSC-W". Visualizzare il grafico a punti dell'asse FSC-A (asse X) rispetto alla larghezza dell'impulso di dispersione in avanti (FSC-W, asse Y). Fare clic con il pulsante destro del mouse sul tracciato punti, scegliere il pulsante P1 sotto il pulsante Mostra popolazioni. Fate clic sul pulsante Porta rettangolare (Rectangular Gate) per creare un gate rettangolare per gateare il sottoinsieme P2 (noto anche come sottoinsieme FSC-A, FSC-W). Ciò escluderà le celle con grandi volumi(figura complementare 7A-C e figura 1A).
- Fate clic sul pulsante Traccia punti (Dot Plot) per visualizzare il tracciato punti, fate clic sull'asse X e impostatelo su "SSC-A"; fare clic sull'asse Y e impostarlo su "SSC-W". Visualizzare il grafico a punti dell'area dell'impulso di dispersione laterale (SSC-A, asse X) rispetto alla larghezza dell'impulso di dispersione laterale (SSC-W, asse Y). Fare clic con il pulsante destro del mouse sul tracciato dei punti e scegliere il pulsante P2 in Mostra popolazioni. Quindi fate clic sul pulsante Porta rettangolare (Rectangular Gate) per creare un gate rettangolare per gateare il sottoinsieme P3 (noto anche come sottoinsieme SSC-A, SSC-W). Ciò otterrà una popolazione cellulare con granularità uniforme (Figura complementare 8A-C e Figura 1A).
- Fate clic sul pulsante Traccia punti (Dot Plot) per visualizzare il tracciato punto, fate clic sull'asse X e impostatelo su "Hoechst Red-A"; fare clic sull'asse Y e impostarlo su "Hoechst Blue-A". Visualizzate il grafico a punti di Hoechst Red-A (asse X) rispetto all'asse Hoechst Blue-A (asse Y). Fare clic con il pulsante destro del mouse sul tracciato punti, scegliere il pulsante P3 sotto il pulsante Mostra popolazioni. Fate clic sul pulsante Porta poligono (Polygon Gate) per creare un gate poligonale per gateare il sottoinsieme P4 (noto anche come sottoinsieme Rosso-A di Hoechst, Blu-A di Hoechst). Fare clic con il pulsante destro del mouse sul tracciato punti, scegliere il pulsante Mostra gerarchia di popolazione per visualizzare la gerarchia della popolazione.
NOTA: La trama dei punti mostrerà tre diverse popolazioni: 1) una popolazione di fase G0-G1 vicino al centro del grafico; 2) una popolazione di fase S-G2/M vicino all'angolo in alto a destra; 3) l'SP. L'SP viene quindi gated per ulteriori analisi(figura complementare 9A-D e figura 1A). Se il grafico a punti di Hoechst Red-A contro Hoechst Blue-A non mostra un profilo SP simile a quello mostrato nella Figura 1A, le tensioni devono essere regolate fino a quando non viene visualizzato un profilo simile. Nel frattempo, regola tutti i cancelli sopra di conseguenza. - Dopo aver determinato l'area di gate delle celle SP, fare clic su Acquisisci dati per raccogliere 20.000-100.000 eventi da ogni campione per analizzare la percentuale di celle SP (Figura complementare 10).
- Eseguire le celle macchiate di Hoechst 33342 trattate con bloccante sul citometro a flusso.
- Posizionare tubi contenenti bloccante sul citometro e far funzionare le celle utilizzando le stesse tensioni e cancelli per verificare ulteriormente se le tensioni e i cancelli sono selezionati in modo appropriato.
NOTA: Rispetto alla sola colorazione Hoechst 33342, solo una piccolissimo percentuale di cellule, se presente, dovrebbe apparire nell'area recintata dell'SP (Figura 1B). - Raccogli 20.000-100.000 eventi da ogni campione per analizzare la percentuale di celle SP.
- Posizionare tubi contenenti bloccante sul citometro e far funzionare le celle utilizzando le stesse tensioni e cancelli per verificare ulteriormente se le tensioni e i cancelli sono selezionati in modo appropriato.
- Eseguire celle macchiate con Hoechst 33342 sul citometro di flusso.
4. Analisi dei dati
NOTA: Le istruzioni per l'uso del software di analisi della citometria del flusso (vedi Tabella dei materiali)sono descritte in questa sezione e nelle figure supplementari 11-16.
- Copiare i file in formato fcs in un computer, aprire il software di analisi della citometria a flusso e trascinare un file di esempio nel software (Figura complementare 11A,B).
- Gate e ottenere la percentuale di celle SP.
- Fare doppio clic su questo filedi esempio , fare clic sull'asse X e impostarlo su "FSC-A"; fare clic sull'asse Y e impostarlo su "PI-A". Creare quindi un gate poligonale e fare clic sul pulsante OK per ottenere il sottoinsieme FSC-A, PI-A ( SupplementaryFigure 12A-E).
- Fare doppio clic sul file del sottoinsieme FSC-A, PI-A, sull'asse X e impostarlo su "FSC-A"; fare clic sull'asse Y e impostarlo su "FSC-W". Creare quindi un gate rettangolare e fare clic sul pulsante OK per ottenere il sottoinsieme FSC-A, FSC-W (Figura complementare 13A-E).
- Fare doppio clic sul file del sottoinsieme FSC-A, FSC-W, sull'asse X e impostarlo su "SSC-A"; fare clic sull'asse Y e impostarlo su "SSC-W". Creare quindi un gate rettangolare e fare clic sul pulsante OK per ottenere il sottoinsieme SSC-A, SSC-W (Figura complementare 14A-E).
- Fare doppio clic sul file del sottoinsieme SSC-A, SSC-W, sull'asse X e impostarlo su "Hoechst Red-A"; fare clic sull'asse Y e impostarlo su "Hoechst Blue-A". Creare quindi un gate poligonale e fare clic sul pulsante OK per ottenere il sottoinsieme Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A ( Figurasupplementare 15A-E).
- Aprire l'editor di layout facendo clic sul pulsante Apri editor layout. Trascinare il file del sottoinsieme SSC-A, SSC-W nell'Editor layout, quindi fare clic sul pulsante Fare clic sul pulsante Fare clic per salvare la finestra del layout in file per salvare i risultati dell'immagine ( Figura supplementare16A-C).
- Salvare l'area di lavoro per conservare le informazioni di gating durante la chiusura del software.
- Eseguire analisi t-test con software di analisi statistica per confrontare la differenza tra due gruppi. Un valore di P < 0,05 è stato definito statisticamente significativo.
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Representative Results
Secondo questo metodo sono state eseguite quattro analisi sperimentali dell'SP. Nel primo, abbiamo rilevato la proporzione di cellule SP in MDA-MB-231, che è una linea cellulare per il cancro al seno umano tripla negativa, in condizioni normali. Dopo il conteggio delle cellule, hoechst 33342 è stato aggiunto in un tubo contenente 1 x10 6 celle ad una concentrazione finale di 3 μg/mL. Reserpina e Hoechst 33342 sono stati aggiunti ad un altro tubo a concentrazioni finali rispettivamente di 40 μM e 3 μg/mL. PI è stato aggiunto a entrambi i tubi. La trama puntino dell'FSC-A (asse X) rispetto all'asse PI-A (asse Y) mostrava tre popolazioni: 1) una popolazione cellulare pi-positiva, che rappresentava le cellule morte; 2) detriti cellulari; e 3) la popolazione principale era di cellule PI-negative, che sono state sottoposte ad ulteriori analisi(figura 1A,B). Una popolazione a cella singola gated dal grafico a punti di FSC-A (asse X) rispetto a FSC-W (asse Y) e il grafico a punti di SSC-A (asse X) rispetto a SSC-W (asse Y) è stato utilizzato per analizzare la proporzione di celle SP (Figura 1A,B). Le celle SP sono state gategate dal grafico a punti di Hoechst Red-A (asse X) rispetto all'hoechst blue-A (asse Y), e la loro percentuale era di circa lo 0,9% nelle celle MDA-MB-231 (Figura 1A). Tuttavia, reserpina ha notevolmente diminuito la proporzione di celle SP (Figura 1B), supportando che la verniciatura a cancello per SP è corretta.
Il secondo esperimento fu quello di determinare l'adeguata concentrazione di colorazione della Hoechst 33342 nelle celle MDA-MB-435. Dopo il conteggio delle cellule, hoechst 33342 è stato aggiunto a 1 x10 6 celle, che sono state sospese in 1 mL di PBS integrato con 2% FBS, a diversi gradienti di concentrazione, tra cui 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 e 4 μg/mL. Come mostrato nella figura 2A, quando la concentrazione di Hoechst 33342 era troppo bassa (cioè 0,5, 1, 1,5 μg/mL), era difficile distinguere le cellule SP dalle altre popolazioni cellulari, perché molte cellule erano in uno stato debolmente macchiato. Quando la concentrazione di Hoechst 33342 era troppo alta (cioè 2,5, 3, 3,5, 4 μg/mL), la proporzione di cellule SP è diminuita fino alla sua scomparsa. Pertanto, 2 μg/mL Hoechst 33342 era la migliore concentrazione per l'analisi SP nelle celle MDA-MB-435. Inoltre, per determinare il blocco corretto per questa linea cellulare, hoechst 33342 e un bloccante (Verapamil o Reserpine) sono stati aggiunti a 1 x 106 cellule, che sono state sospese in 1 mL di PBS integrato con 2% FBS, a concentrazioni finali rispettivamente di 2 μg/mL e 40 μM. Come mostrato nella figura 2B, circa lo 0,4% delle cellule ha espulso il colorante dopo il trattamento con Verapamil. Tuttavia, dopo il trattamento con reserpina, il rapporto è sceso a circa lo 0,1%(figura 2C). Da questo esperimento, reserpina è stato considerato un blocco più appropriato per questa linea cellulare.
Nel terzo esempio, le cellule A549 (cellule adenocarcinoma polmonari umane) sono state pretrattate con attivatore STAT3-Colivelin20 (100 nM) per 48 ore (h). La via di segnalazione STAT3 è importante per promuovere le caratteristiche di staminali delle cellule tumorali21. Come mostrato nella figura 3, la percentuale di cellule SP è aumentata dopo la stimolazione colivelina.
Nell'ultimo esempio, le cellule T47D (cellule tumorali del seno umano) sono state pretrattate con inibitore fra1 da 0,1 μM-SKLB816 (chiamato anche 13an) per 48 h22. FRA1 è un gatekeeper segnalato della transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) e coinvolto nella regolazione della staminali tumorale23. Come mostrato nella figura 4, la percentuale di cellule SP è diminuita a causa del trattamento dell'inibitore di FRA1.
Figura 1: Strategia di Gating delle celle MDA-MB-231 nell'analisi SP. (A) Strategia di Gating delle celle MDA-MB-231, che sono state macchiate con Hoechst 33342 (3 μg/mL) e propidioidio (PI, 1 μg/mL). (B) Strategia di Gating delle cellule MDA-MB-231, che sono state trattate con reserpina (40 μM) e macchiate con Hoechst 33342 (3 μg/mL) e PI (1 μg/mL). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Ottimizzazione della concentrazione di Hoechst 33342 e selezione del bloccante nelle celle MDA-MB-435. (A) I risultati dell'analisi SP delle celle MDA-MB-435, macchiate con Hoechst 33342 (Hoechst) a diversi gradienti di concentrazione (0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4 μg/mL) insieme a PI (1 μg/mL). (B) Il risultato dell'analisi SP delle cellule MDA-MB-435, trattate con Verapamil (40 μM) e macchiate con Hoechst 33342 (2 μg/mL) e PI (1 μg/mL). (C) Il risultato dell'analisi SP delle cellule MDA-MB-435, trattate con reserpina (40 μM) e macchiate con Hoechst 33342 (2 μg/mL) e PI (1 μg/mL). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: La proporzione di cellule SP è stata migliorata dall'attivatore STAT3 nelle celle A549. (A) I risultati dell'analisi SP delle celle A549 pretrattate con attivatore STAT3-Colivelin (100 nM) o il suo controllo del veicolo (Ctrl)-H2O per 48 h. Le cellule A549 trattate con reserpina (45 μM) sono state utilizzate come controllo di blocco. Le celle A549 erano macchiate con Hoechst 33342 (7 μg/mL) e PI (1 μg/mL). (B) I risultati statistici della proporzione di cellule SP nelle celle A549 trattate con Colivelin (100 nM) e del suo controllo del veicolo. I dati sono presentati come media + errore standard della media (SEM), n = 3 per ogni gruppo. "*" indica P < 0,05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: La proporzione di cellule SP è stata inibita dall'inibitore della FRA1 nelle cellule T47D. (A) I risultati dell'analisi SP delle celle T47D pretrattate con SKLB816 (0,1 μM) o il suo controllo del veicolo (Ctrl)-DMSO per 48 h. Le cellule T47D trattate con reserpina (40 μM) sono state utilizzate come controllo di blocco. Le celle T47D erano macchiate con Hoechst 33342 (8 μg/mL) e PI (1 μg/mL). (B) I risultati statistici della proporzione di cellule SP nelle cellule T47D trattate con SKLB816 (0,1 μM) e del suo controllo del veicolo. I dati sono presentati come media + SEM, n = 3 per ogni gruppo. "*" indica P < 0,05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura complementare 1: Istruzioni per il passaggio 3.1 del software del citometro a flusso. (A) Fare clic sul pulsante FOLDER. (B) Fare clic sul pulsante Esperimento, quindi sul pulsante Nuovo esperimento. Clicca qui per scaricare questa cifra.
Figura complementare 2: Istruzioni per il passaggio 3.2 del software del citometro a flusso. (A) Fare clic sul pulsante OK. (B) Experiment_001 viene visualizzato in FOLDER. Clicca qui per scaricare questa cifra.
Figura complementare 3: Istruzioni per il passaggio 3.3 del software del citometro a flusso. (A) Fare clic sul pulsante Experiment_001 per modificare il nome di Experiment_001 in un nome specifico (ad esempio, "20191118-SP"). (B) Fare clic sul pulsante Invio. Clicca qui per scaricare questa cifra.
Figura complementare 4: Istruzioni per il passaggio 3.4 del software del citometro a flusso. (A) Fare clic sul pulsante Nuovo campione. (B) Fare clic sul pulsante Nuovo tubo. (C) Fare clic sul pulsante Freccia. Clicca qui per scaricare questa cifra.
Figura complementare 5: Istruzioni per il passaggio 3.5 del software del citometro di flusso. (A) Fare clic sul pulsante Parametri per impostare i parametri. Clicca qui per scaricare questa cifra.
Figura complementare 6: Istruzioni per il passaggio del software del citometro di flusso 3.6.1.2. (A) Fate clic sul pulsante Traccia punti (Dot Plot) per visualizzare il tracciato punti, fate clic sull'asse X e impostatelo su "FSC-A"; fare clic sull'asse Y e impostarlo su "PI-A". (B) Fare clic sul pulsante Porta poligono per creare un gate poligonale per gateare il sottoinsieme P1, noto anche come sottoinsieme FSC-A, PI-A. Clicca qui per scaricare questa cifra.
Figura complementare 7: Istruzioni per il passaggio del software del citometro a flusso 3.6.1.3. (A) Fate clic sul pulsante Traccia punti (Dot Plot) per visualizzare il plottaggio dei punti, fate clic sull'asse X e impostatelo su "FSC-A"; fare clic sull'asse Y e impostarlo su "FSC-W". (B) Fare clic con il pulsante destro del mouse sul tracciato dei punti e scegliere il pulsante P1 in Mostra popolazioni. (C) Fare clic sul pulsante Porta rettangolare per creare un gate rettangolare per gateare il sottoinsieme P2, noto anche come sottoinsieme FSC-A, FSC-W. Clicca qui per scaricare questa cifra.
Figura complementare 8: Istruzioni per il passaggio del software del citometro a flusso 3.6.1.4. (A) Fate clic sul pulsante Traccia punti (Dot Plot) per visualizzare il tracciato punti, fate clic sull'asse X e impostatelo su "SSC-A"; fare clic sull'asse Y e impostarlo su "SSC-W". (B) Fare clic con il pulsante destro del mouse sul tracciato dei punti e scegliere il pulsante P2 sotto il pulsante Mostra popolazioni. (C) Fare clic sul pulsante Porta rettangolare per creare un gate rettangolare per gateare il sottoinsieme P3 (noto anche come sottoinsieme SSC-A, SSC-W). Clicca qui per scaricare questa cifra.
Figura complementare 9: Istruzioni per il passaggio del software del citometro a flusso 3.6.1.5. (A) Fate clic sul pulsante Traccia punti (Dot Plot) per visualizzare il tracciato punti, fate clic sull'asse X e impostatelo su "Hoechst Red-A"; fare clic sull'asse Y e impostarlo su "Hoechst Blue-A". (B) Fare clic con il pulsante destro del mouse sul tracciato dei punti e scegliere il pulsante P3 sotto il pulsante Mostra popolazioni. (C) Fate clic sul pulsante Porta poligono (Polygon Gate) per creare un gate poligonale per gateare il sottoinsieme P4 (noto anche come sottoinsieme Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A). (D) Fare clic con il pulsante destro del mouse sul tracciato punti, quindi scegliere il pulsante Mostra gerarchia di popolazione per visualizzare la gerarchia di popolazione. Clicca qui per scaricare questa cifra.
Figura complementare 10: Istruzioni per il passaggio del software del citometro a flusso 3.6.1.6. (A) Fare clic sul pulsante Acquisisci dati, quindi raccogliere 20.000-100.000 eventi da ogni esempio. Clicca qui per scaricare questa cifra.
Figura complementare 11: Istruzioni per il passaggio 4.1 del software di analisi della citometria a flusso. (A) Aprire il software di analisi della citometria di flusso e trascinare un file di esempio nel software. (B) Il file di esempio viene importato. Clicca qui per scaricare questa cifra.
Figura complementare 12: Istruzioni per il passaggio 4.2.1 del software di analisi della citometria a flusso. (A) Fare doppio clic su questo file di esempio. (B) Fare clic sull'asse X e impostarlo su "FSC-A"; fare clic sull'asse Y e impostarlo su "PI-A". (C) Fare clic sul pulsante Crea un gate poligonale per creare un gate poligonale. (D) Fare clic sul pulsante OK per ottenere il sottoinsieme FSC-A, PI-A. (E) Si ottiene il sottoinsieme FSC-A, PI-A. Clicca qui per scaricare questa cifra.
Figura complementare 13: Istruzioni per il passaggio del software di analisi della citometria a flusso numero 4.2.2. (A) Fare doppio clic sul file del sottoinsieme FSC-A, PI-A. (B) Fare clic sull'asse X e impostarlo su "FSC-A"; fare clic sull'asse Y e impostarlo su "FSC-W". (C) Fare clic sul pulsante Crea un gate rettangolare per creare un gate rettangolare. ( D) Fare clic sul pulsante OK per ottenere il sottoinsieme FSC-A, FSC-W. (E) Il sottoinsieme FSC-A, FSC-W è ottenuto. Fare clic qui per scaricare questa figura.
Figura complementare 14: Istruzioni per il passaggio 4.2.3 del software di analisi della citometria a flusso. (A) Fare doppio clic sul file del sottoinsieme FSC-A, FSC-W. (B) Fare clic sull'asse X e impostarlo su "SSC-A"; fare clic sull'asse Y e impostarlo su "SSC-W". (C) Fare clic sul pulsante Crea un gate rettangolare per creare un gate rettangolare. (D) Fare clic sul pulsante OK per ottenere il sottoinsieme SSC-A, SSC-W. (E) Si ottiene il sottoinsieme SSC-A, SSC-W. Clicca qui per scaricare questa cifra.
Figura complementare 15: Istruzioni per il passaggio 4.2.4 del software di analisi della citometria a flusso. (A) Fare doppio clic sul file del sottoinsieme SSC-A, SSC-W. (B) Fare clic sull'asse X e impostarlo su "Hoechst Red-A"; fare clic sull'asse Y e impostarlo su "Hoechst Blue-A". (C) Fare clic sul pulsante Crea un gate poligonale per creare un gate poligonale. (D) Fare clic sul pulsante OK per ottenere il sottoinsieme Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A. (E) Si ottiene il sottoinsieme Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A. Clicca qui per scaricare questa cifra.
Figura complementare 16: Istruzioni per il passaggio del software di analisi della citometria a flusso numero 4.2.5. (A) Fare clic sul pulsante Apri editor layout per aprire l'editor di layout. (B) Trascinare il file di esempio del sottoinsieme SSC-A, SSC-W nell'editor di layout. (C) Fare clic sul pulsante Fare clic sul pulsante Salva finestra layout in file per salvare i risultati dell'immagine. Clicca qui per scaricare questa cifra.
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Discussion
Ci sono diversi punti chiave da tenere a mente per il test SP. Il primo è la selezione di un blocco adeguato, come Verapamil o Reserpine, per ogni linea cellulare, perché la posizione "gate" delle celle SP è determinata in base alla posizione in cui un gran numero di cellule SP scompaiono dopo l'aggiunta del blocco. Per la linea di celle MDA-MB-231, Reserpine funziona bene. Tuttavia, per altre linee di celle, i blocchi diversi potrebbero funzionare meglio.
Il secondo è la concentrazione di Hoechst 33342. La percentuale di cellule SP è aumentata con la diminuzione della concentrazione di colorazione della Hoechst 33342, come hanno mostrato i dati rappresentativi. Questo fenomeno può essere spiegato dalla cinetica di assorbimento del colorante24. Le variazioni della concentrazione del colorante influiscono sull'arricchimento della Hoechst 33342 nelle cellule. Pertanto, la concentrazione di colorazione hoechst 33342 è strettamente correlata ai risultati del saggio SP. Inoltre, l'assorbimento e l'espulsione della Hoechst 33342 variano tra i tipi di cellule. Pertanto, è necessario esplorare concentrazioni adeguate di Hoechst 33342 per diverse linee cellulari prima dell'analisi SP.
Il terzo è un buon coefficiente di variazione (CV) del citometro di flusso, che è anche critico per l'analisi SP25. La potenza laser UV è un criterio importante per cv migliori12. Questo protocollo utilizza un citometro a flusso commerciale (vedere Tabella dei materiali) per eseguire il test SP. In questo strumento a celle a flusso di cuvette, abbiamo utilizzato il laser UV con una potenza di 15 mW per ottenere i migliori CV. In generale, una potenza laser UV relativamente elevata fornisce i CV ottimali. Ad esempio, 50-100 mW forniscono il segnale Hoechst ottimale sugli strumenti a getto d'aria12. Alcuni laser forniscono una minore potenza UV, che può ridurre i CV. In questi casi, un buon allineamento laser è fondamentale.
L'ultimo è l'influenza di altri fattori durante l'esperimento. Lo stato cellulare, la temperatura, il tempo di colorazione, il funzionamento della citometria del flusso e altri fattori possono anche influenzare la proporzione e la qualità del saggio SP. Ad esempio, i cambiamenti nella vitalità cellulare durante la preparazione delle sospensioni cellulari influenzeranno il rapporto tra cellule SP. Pertanto, è necessario esplorare le migliori condizioni sperimentali prima di eseguire l'analisi SP. Considerando i fattori di cui sopra, il rapporto SP della stessa linea cellulare misurata da laboratori diversi può essere diverso. Ad esempio, le proporzioni delle celle MDA-MB-231 e A549 sono state riportate rispettivamente come ~0,1%-4,8%26,27,28,29 e ~0,8%-18%30,31,32,33,34.
I ricercatori possono modificare questo saggio per diverse applicazioni, come lo studio di altre linee cellulari tumorali o cellule tumorali primarie derivate dal paziente. Se il protocollo non funziona bene per le cellule in fase di test, i ricercatori possono utilizzare le cellule MDA-MB-231 come controllo positivo e macchiare le cellule seguendo le specifiche date. Poiché questo protocollo è molto sensibile alla concentrazione di Hoechst 33342, alla temperatura di colorazione e al tempo, ecc., i ricercatori dovrebbero controllare attentamente tutte queste condizioni. La percentuale di SP in molti tipi di linee cellulari tumorali umane è relativamente bassa (~ 0%-37%)19,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Se si osserva una percentuale eccessivamente alta o bassa di SP, ciò può essere dovuto a concentrazioni inappropriate di Hoechst 33342 o bloccante utilizzato. Se il problema sembra essere correlato al citometro di flusso, è necessario ottenere un supporto tecnico.
Sebbene l'uso di SP per analizzare e separare i CSC sia altamente efficiente, ha ancora alcune limitazioni. Il primo è la sua elevata sensibilità alle condizioni di colorazione12. Molti fattori, come la concentrazione di Hoechst 33342, lo stato cellulare, la temperatura, il tempo di colorazione, il funzionamento della citometria del flusso e la selezione del bloccante, possono influire sulla qualità dell'analisi SP. Il secondo è l'effetto citotossico di Hoechst 33342. Hoechst 33342 è un colorante legante il DNA, ma è tossico per le cellule quando raggiunge alte concentrazioni e quindi riduce l'attività cellulare37.
In sintesi, l'analisi SP è uno dei metodi più comunemente utilizzati negli ultimi anni per identificare e purificare i CSC nelle linee cellulari tumorali. Sebbene il metodo abbia alcune limitazioni, in assenza di specifici marcatori di superficie CSC, è ancora un metodo per un arricchimento conveniente, rapido ed economico dei CSC. Questo metodo è utile per lo studio delle funzioni biologiche dei CSC e per l'identificazione di marcatori superficiali specifici. Inoltre, rilevando gli effetti di vari segnali sul rapporto SP delle cellule tumorali, può fornire indizi sull'effetto regolatore di queste vie di segnale sulle caratteristiche dei CSC e facilitare la scoperta di nuovi meccanismi, che possono in ultima analisi guidare la terapia mirata dei tumori.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dalla Natural Science Foundation of China 81572599, 81773124 e 81972787; Fondazione di Scienze Naturali della Città di Tianjin (Cina) 19JCYBJC27300; Tianjin People's Hospital & Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Fondi di ricerca fondamentali per le università centrali, l'Università di Nankai 63191153.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 well cell culture plate | CORNING | 3516 | 9.5 cm2 (approx.) |
| Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
| Flow cytometer software | BD Biosciences | FACSDiva | |
| Flow cytometry analysis software | BD Biosciences | FlowJo | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
| Polystyrene round bottom test tube | CORNING | 352054 | 12 x 75 mm, 5 mL |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide |
| Reserpine | Sigma-Aldrich | 83580 | (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester |
| SKLB816 | Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino] -2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride |
References
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