Summary
En praktisk, rask og kostnadseffektiv metode for å måle andelen sidepopulasjonsceller i faste tumorcellelinjer presenteres.
Abstract
Kreft stamceller (CSC) er en viktig årsak til tumorvekst, metastase og tilbakefall. Isolasjon og identifisering av CSC-er har stor betydning for tumorforskning. For tiden brukes flere teknikker for identifisering og rensing av CSC fra tumorvev og tumorcellelinjer. Separasjon og analyse av sidepopulasjonsceller (SP) er to av de ofte brukte metodene. Metodene er avhengige av CSCCs evne til raskt å utvise fluorescerende fargestoffer, for eksempel Hoechst 33342. Effluksen av fargestoffet er forbundet med ATP-bindende kassett (ABC) transportører og kan hemmes av ABC-transportørhemmere. Metoder for farging av dyrkede tumorceller med Hoechst 33342 og analyse av andelen sp-celler ved strømningscytometri er beskrevet. Denne analysen er praktisk, rask og kostnadseffektiv. Data generert i denne analysen kan bidra til en bedre forståelse av effekten av gener eller andre ekstracellulære og intracellulære signaler på stamcellenes stammeegenskaper.
Introduction
Kreft stamceller (CSC) er undergrupper av celler med selvfornyelse evne og flere differensiering potensial, som spiller en viktig rolle i tumor vekst, metastase, og tilbakefall1,2. For tiden har CSC blitt identifisert til å eksistere i en rekke ondartede svulster, inkludert lunge,hjerne, bukspyttkjertel, prostata, bryst- og leverkreft3,4,5,6,7,8,9. Identifisering av CSCer i disse svulstene er hovedsakelig basert på tilstedeværelsen av overflatemarkørproteiner, for eksempel høyt og / eller lavt uttrykk for CD44, CD24, CD133 og Sca-19,10, men en unik markør som kan skille CSC-er fra ikke-CSC-er er ikke rapportert så langt. For tiden brukes flere teknikker til å identifisere og rense CSC-er i tumorvev eller tumorcellelinjer. Disse teknikkene er utformet basert på de spesifikke egenskapene til CSC-er. Blant dem er analyser og sortering av sidepopulasjonsceller (SP) to av de ofte brukte metodene.
SP-celler ble opprinnelig oppdaget av Goodell et al.11, da de karakteriserte hematopoietiske stamceller i musebenmargsceller. Da musebenmargscellene ble merket med det fluorescerende fargestoffet Hoechst 33342, oppstod en liten gruppe Hoechst 33342 svakt fargede celler i den todimensjonale prikkplottet av en strømningscytometrianalyse. Hoechst 33342 er et DNA-bindende fargestoff og har minst to bindingsmoduser som fører til forskjellige spektrale egenskaper. Når du ser på fluorescensutslipp ved to bølgelengder samtidig, kan flere populasjoner avsløres12. I analysen var Hoechst 33342 spent på 350 nm og fluorescensen ble målt ved hjelp av 450/20 nm båndpass (BP) filter og 675 nm kantfilter langpass (EFLP)11. Sammenlignet med hele populasjonen av benmargsceller, ble denne gruppen av celler beriket med hematopoietiske stamceller kalt SP-celler11. SP-celler er i stand til raskt å utvise Hoechst 33342. Effluksen av dette fargestoffet er relatert til ATP-bindende kassett (ABC) transportører13, som kan hemmes av noen midler som Fumitremorgin C14, Verapamil og Reserpine15,16. Deretter ble forskjellige proporsjoner av SP-celler oppdaget i en rekke vev, organer, tumorvev og tumorcellelinjer17,18,19. Disse SP-cellene har mange egenskaper vedstamceller 17,19.
Dette manuskriptet beskriver Hoechst 33342 merking og farging av dyrkede tumorceller og analyse av SP-celler ved strømningscytometri. Videre vises optimalisering av Hoechst 33342-konsentrasjonen og riktig blokkeringsvalg for en bestemt tumorcellelinje ved hjelp av denne tilnærmingen. Til slutt er effekten av stemnessfremming eller hemmingssignaler på andelen SP i tumorceller demonstrert. De eksperimentelle eksemplene viser at analyse av SP kan brukes til å utforske effekten av ulike signaler, for eksempel genuttrykk, små hemmere, aktivatorer, cytokiner og kjemokiner, på tumorstamme. Sammenlignet med andre metoder for isolering og rensing av CSC-er, for eksempel sortering av CD44+/ CD24- befolkning, aldehyd dehydrogenase (ALDH) analyse og tumorsfæredannelsesanalyser, er denne metoden lettere for manipulering og er kostnadseffektiv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celleforberedelse
- Celle fordøyelse og nøytralisering
- Frøsvulstceller (som MDA-MB-231 celler) i en 6 brønnplate, og kultur dem i en 37 ° C inkubator levert med 5% CO2.
- Høst celler når deres tetthet når ca 90%. Aspirer kulturmediet grundig og vask cellene 2x med 3 ml fosfatbufret saltvann (PBS).
MERK: For å undersøke effekten av signalveihemmere (f.eks. FRA1-hemmere) eller aktivatorer (f.eks. STAT3-aktivator) på stamceller, blir tumorceller sådd i en 6 brønnplate og forbehandlet med hemmere eller aktivatorer i en viss tid før høsting. - Tilsett 500 μL 0,25% trypsin-EDTA til hver brønn på 6 brønnplaten, plasser platen i en inkubator ved 37 °C i 1–3 minutter (min), og trykk forsiktig på platen for å løsne cellene.
MERK: Langvarig fordøyelse vil påvirke SP-profilen på grunn av endringer i celle levedyktighet. - Tilsett 3 ml PBS supplert med 2% foster bovint serum (FBS) til hver brønn på 6 brønnplaten for å avslutte fordøyelsen og forsiktig pipette cellene opp og ned 3-5x for å spre celleklumper.
- Tilsett 0,5 ml celleoppheng i en brønn på en ny 6 brønnplate og undersøk den under et mikroskop. Hvis celleklumper observeres, send cellesuspensjonen gjennom en 70 μM cellesil.
MERK: Dette er et valgfritt trinn. - Overfør cellene til et 15 ml sentrifugerør. Sentrifuger celler ved 200 x g i 5 min til pelletsceller. Fjern supernatanten og resuspend dem i 3 ml PBS supplert med 2% FBS. Pipette cellene opp og ned 3-5x for å blande grundig.
- Antall celler
- Tilsett 50 μL av celleopphenget i et 1,5 ml mikrosenterrør og bland det med 50 μL trypan blå oppløsning. Pipette 10 μL av blandingen for å telle antall levende celler ved hjelp av en standardmetode, for eksempel et hemocytometer.
- Fortynn cellene i PBS supplert med 2% FBS til en endelig konsentrasjon på 1 x 106 celler / ml. Tilsett 1 ml celleoppheng til et 5 ml polystyren rundt nedre reagensrør og lag to prøverør.
2. Cellefarging med Hoechst 33342
- Legg Hoechst 33342 til ett rør for å oppnå en passende sluttkonsentrasjon.
MERK: For eksempel er riktig konsentrasjon av Hoechst 33342 3 μg/ml for MDA-MB-231 celler. - Legg til en blokkering (f.eks. Fumitremorgin C, Verapamil eller Reserpine) i et annet rør til en passende sluttkonsentrasjon og inkuber røret ved 37 °C i 30 minutter før du tilsetter samme konsentrasjon av Hoechst 33342 som beskrevet i trinn 2.1.
MERK: For MDA-MB-231 celler er den aktuelle blokkeringen Reserpine (40 μM). Reserpine brukes som en blokkeringskontroll for å bekrefte fraværet av celler i det inngjerdede SP-området. - Forbered flere rør som inneholder celler og legg Hoechst 33342 til forskjellige konsentrasjonsgradienter. Etter en strømningscytometrianalyse velger du riktig konsentrasjon i henhold til profilen og andelen sp.
MERK: Dette er et valgfritt trinn som brukes til å definere riktig konsentrasjon av Hoechst 33342. - Forbered flere rør som inneholder celler, legg til blokkeringen i forskjellige konsentrasjonsgradienter, inkuber rørene ved 37 °C i 30 minutter, og tilsett deretter Hoechst 33342 i en passende konsentrasjon. Etter strømningscytometrianalysen velger du riktig konsentrasjon i henhold til fraværet av celler i det inngjerdede SP-området.
MERK: Dette er et valgfritt trinn som brukes til å definere riktig konsentrasjon av blokkering. - Plasser rørene i en 37 °C inkubator og inkuber dem i 60 min, rist rørene hvert 10.
MERK: Risting av rør grundig er viktig for farging, fordi det sikrer fullstendig kontakt mellom cellene og fargestoffet for bedre fargeresultater. - Etter inkubasjonen sentrifugerer du cellene ved 200 x g, 4 °C i 5 minutter og aspirerer supernatanten forsiktig, fordi cellene danner veldig løse og ustabile pellets.
- Resuspendceller i hvert rør i 1 ml iskald PBS supplert med 2% FBS og pipette cellene opp og ned 3-5x for å blande grundig. Tilsett 1 μL 1 mg/ml propidiumjodid (PI) i suspensjonen av hvert rør for å identifisere døde celler.
MERK: Alle prosedyrer i dette trinnet bør utføres ved 4 °C for å hemme effluksen til Hoechst 33342 fra tumorcellene. Rørene skal beskyttes mot direkte eksponering for lys.
3. Analyse ved strømningscytometri
MERK: Bruksanvisningen for flytcytometerprogramvaren (se Materialliste) er beskrevet i denne delen og Tilleggstall 1–10.
- Klikk på FOLDER-knappen i flytcytometerprogramvaren. Klikk Eksperimenter -knappen, og klikk deretter Nytt eksperiment (Tilleggsfigur 1A,B).
- Klikk OK . "Experiment_001" vises under MAPPEN (Tilleggsfigur 2A,B).
- Klikk Experiment_001-knappen for å endre mappenavnet til et bestemt navn (f.eks. Klikk Enter. Det nye navnet ("20191118-SP") vises under MAPPE (Tilleggsfigur 3A,B).
- Klikk Ny prøve-knappen for å legge til et eksemplar i den nye eksperimentmappen ("20191118-SP"). Klikk på Nytt rør-knappen for å legge til et rør til prøven. Klikk Pilspiss -knappen (Tilleggsfigur 4A-C).
- Klikk Parametere -knappen, og definer parameterne for strømningscytometeret (Tilleggsfigur 5).
- Bruk en 610 nm dikroisk speil kortpasning (DMSP) for å skille utslippsbølgelengdene. Bruk et 450/20 nm BP-filter for å samle den blå fluorescensen og en 675 nm EFLP for å samle den røde fluorescensen.
MERK: Hoechst 33342 er spent med en UV-laser på 355 nm og PI er spent på 488 nm.
- Bruk en 610 nm dikroisk speil kortpasning (DMSP) for å skille utslippsbølgelengdene. Bruk et 450/20 nm BP-filter for å samle den blå fluorescensen og en 675 nm EFLP for å samle den røde fluorescensen.
- Kjør celleprøvene på strømningscytometeret.
MERK: SP-celler kan sorteres etter fluorescensaktivert cellesortering (FACS) under sterile forhold. Totalt skal det samles inn 100 000–500 000 celler for oppfølgingsforsøkene.- Kjør celler farget med Hoechst 33342 på strømningscytometeret.
- Plasser rør som inneholder celler farget med Hoechst 33342 på cytometeret.
- Klikk Prikktegning -knappen for å vise prikktegningen, klikk deretter X-aksen og sett den til "FSC-A"; klikk Y-aksen og sett den til "PI-A". Vis punkttegningen for fremoverspredningspulsområdet (FSC-A, X-akse satt til lineær modus) i forhold til PI-fluorescens (Y-akse satt til logaritmisk skala). Juster spenningene for å vise levende celler på høyre side og ikke-levende celler, som er sterkt farget med PI, i øvre venstre hjørne. Deretter oppretter du en polygonport for å utelate døde celler og celleavfall (Figur 1A) ved å klikke Knappen PolygonPort for å gate P1-delsettet, også kjent som FSC-A, PI-A-delsett (Tilleggs figur 6A,B).
- Klikk Prikktegning -knappen for å vise prikktegningen, klikk X-aksen og sett den til "FSC-A"; klikk Y-aksen og sett den til" FSC-W". Vis prikktegningen for FSC-A (X-akse) kontra fremoverspredningspulsbredde (FSC-W, Y-akse). Høyreklikk prikktegningen, klikk P1-knappen under Vis populasjoner-knappen. Klikk Rektangulær port for å opprette en rektangulær port for å gate P2-delsettet (også kjent som FSC-A, FSC-W-delsett). Dette vil utelate celler med store volumer (Tilleggs figur 7A-C og figur 1A).
- Klikk Prikktegning -knappen for å vise prikktegningen, klikk X-aksen og sett den til "SSC-A"; klikk Y-aksen og sett den tilSSC-W. Vis punkttegningen for sidespredningspulsområdet (SSC-A, X-aksen) kontra pulsbredden for sidespredning (SSC-W, Y-aksen). Høyreklikk prikktegningen, og klikk P2-knappen under Vis populasjoner-knappen. Klikk deretter Retangulær port for å opprette en rektangulær port for å gate P3-delsettet (også kjent som SSC-A, SSC-W-delsett). Dette vil få en cellepopulasjon med ensartet detaljnivå (Tilleggs figur 8A-C og figur 1A).
- Klikk Prikktegning -knappen for å vise prikktegningen, klikk X-aksen og sett den til "Hoechst Red-A"; klikk Y-aksen og sett den til" Hoechst Blue-A". Vis prikkplottet for Hoechst Red-A (X-akse) mot Hoechst Blue-A (Y-akse). Høyreklikk prikktegningen, klikk P3-knappen under Vis populasjoner-knappen. Klikk Knappen Polygon Gate for å opprette en polygonport for å gate P4-delsettet (også kjent som Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A-delsett). Høyreklikk prikktegningen, og klikk Knappen Vis populasjonshierarki for å vise populasjonshierarkiet.
MERK: Prikkplottet vil vise tre forskjellige populasjoner: 1) en G0-G1 fasepopulasjon nær midten av grafen; 2) en S-G2 / M fase befolkning nær øvre høyre hjørne; 3) SP. SP blir deretter inngjerdet for videre analyse (Tilleggs figur 9A-D og figur 1A). Hvis prikkplottet til Hoechst Red-A versus Hoechst Blue-A ikke viser en SP-profil som ligner den som vises i figur 1A, bør spenningene justeres til en lignende profil er sett. I mellomtiden justerer du alle portene ovenfor tilsvarende. - Når du har bestemt portområdet for SP-cellene, klikker du Hent data for å samle inn 20 000–100 000 hendelser fra hvert utvalg for å analysere prosentandelen SP-celler ( Tilleggsfigur 10).
- Kjør Hoechst 33342-fargede celler behandlet med blokkering på strømningscytometeret.
- Plasser rør som inneholder blokkering på cytometeret og kjør celler ved hjelp av de samme spenningene og portene for å kontrollere om spenningene og portene er valgt på riktig måte.
MERK: Sammenlignet med Hoechst 33342 farging alene, bør bare en svært liten andel celler, hvis noen, vises i det inngjerdede området av SP (Figur 1B). - Samle inn 20 000–100 000 hendelser fra hvert utvalg for å analysere prosentandelen SP-celler.
- Plasser rør som inneholder blokkering på cytometeret og kjør celler ved hjelp av de samme spenningene og portene for å kontrollere om spenningene og portene er valgt på riktig måte.
- Kjør celler farget med Hoechst 33342 på strømningscytometeret.
4. Dataanalyse
MERK: Instruksjoner for bruk av programvaren for strømningscytometrianalyse (se Materialliste) er beskrevet i denne delen og Supplerende figur 11–16.
- Kopier filene i fcs-format til en datamaskin, åpne flyt cytometrianalyseprogramvaren, og dra en eksempelfil til programvaren (Tilleggsfigur 11A,B).
- Gate celler og få prosentandelen av SP-celler.
- Dobbeltklikk denne eksempelfilen, klikk X-aksen og sett den til" FSC-A"; klikk Y-aksen og sett den til "PI-A". Deretter oppretter du en polygonport og klikker OK for å hente delsettet FSC-A, PI-A (Tilleggsfigur 12A-E).
- Dobbeltklikk delsettfilen FSC-A, PI-A, klikk X-aksen og sett den til" FSC-A"; klikk Y-aksen og sett den til" FSC-W". Deretter oppretter du en rektangulær port og klikker OK for å hente delsettet FSC-A, FSC-W (Tilleggsfigur 13A-E).
- Dobbeltklikk delsettfilen FSC-A, FSC-W, klikk X-aksen og sett den til" SSC-A"; klikk Y-aksen og sett den tilSSC-W. Deretter oppretter du en rektangulær port og klikker OK for å hente delsettet SSC-A, SSC-W (Tilleggsfigur 14A-E).
- Dobbeltklikk delsettfilen SSC-A, SSC-W, klikk X-aksen og sett den til" Hoechst Red-A"; klikk Y-aksen og sett den til" Hoechst Blue-A". Deretter oppretter du en polygonport og klikker OK for å hente Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A-delsettet (Tilleggsfigur 15A-E).
- Åpne Oppsettredigering ved å klikke Åpne Oppsettredigering . Dra delsettfilen SSC-A, SSC-W til Layout Editor, og klikk deretter knappen Klikk for å lagre oppsett til fil for å lagre bilderesultatene (Tilleggsfigur 16A-C).
- Lagre arbeidsområdet for å beholde gating-informasjonen når du lukker programvaren.
- Utfør t-testanalyser med statistisk analyseprogramvare for å sammenligne forskjellen mellom to grupper. Verdien P < 0,05 ble definert som statistisk signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fire eksperimentelle SP-analyser ble utført i henhold til denne metoden. I den første oppdaget vi andelen SP-celler i MDA-MB-231, som er en trippel negativ cellelinje for brystkreft, under normale forhold. Etter celletelling ble Hoechst 33342 tilsatt i ett rør som inneholder 1 x 106 celler til en endelig konsentrasjon på 3 μg / ml. Reserpin og Hoechst 33342 ble lagt til et annet rør til endelige konsentrasjoner på henholdsvis 40 μM og 3 μg/ml. PI ble lagt til begge rørene. Prikkplottet for FSC-A (X-akse) kontra PI-A (Y-akse) viste tre populasjoner: 1) en PI-positiv cellepopulasjon, som representerte de døde cellene; 2) celle rusk; og 3) hovedpopulasjonen var PI-negative celler, som ble utsatt for videre analyse (Figur 1A,B). En enkeltcellet populasjon som er inngjerdet fra prikkplottet i FSC-A (X-aksen) kontra FSC-W (Y-aksen) og prikkplottet for SSC-A (X-akse) kontra SSC-W (Y-akse) ble brukt til å analysere andelen SP-celler (Figur 1A,B). SP-cellene ble inngjerdet fra prikkplottet til Hoechst Red-A (X-aksen) mot Hoechst Blue-A (Y-aksen), og prosentandelen var omtrent 0,9 % i MDA-MB-231 celler (figur 1A). Reserpine reduserte imidlertid andelen SP-celler (figur 1B), og støttet at portmalingen for SP er riktig.
Det andre eksperimentet var å bestemme den passende farging konsentrasjonen av Hoechst 33342 i MDA-MB-435 celler. Etter celletelling ble Hoechst 33342 lagt til 1 x 106 celler, som ble suspendert i 1 ml PBS supplert med 2% FBS, til forskjellige konsentrasjonsgradienter, inkludert 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 og 4 μg / ml. Som vist i figur 2A, da konsentrasjonen av Hoechst 33342 var for lav (dvs. 0,5, 1, 1,5 μg/ml), var det vanskelig å skille SP-celler fra andre cellepopulasjoner, fordi mange celler var i svakt farget tilstand. Når konsentrasjonen av Hoechst 33342 var for høy (dvs. 2,5, 3, 3,5, 4 μg/ml), reduserte andelen SP-celler til den forsvant. Dermed var 2 μg/ml Hoechst 33342 den beste konsentrasjonen for SP-analyse i MDA-MB-435 celler. I tillegg, for å bestemme riktig blokkering for denne cellelinjen, ble Hoechst 33342 og en blokkering (Verapamil eller Reserpine) lagt til 1 x 106 celler, som ble suspendert i henholdsvis 1 ml PBS supplert med 2% FBS, til endelige konsentrasjoner på henholdsvis 2 μg / ml og 40 μM. Som vist i figur 2B,utviste ca. 0,4% av cellene fargestoffet etter Verapamil-behandling. Etter reserpinbehandling falt imidlertid forholdet til ca. 0,1 % (figur 2C). Fra dette eksperimentet ble Reserpine ansett som en mer passende blokkering for denne cellelinjen.
I det tredje eksemplet ble A549-celler (humane lungeadenokarsinomceller) forbehandlet med STAT3-aktivator-Colivelin20 (100 nM) i 48 timer (h). STAT3-signalveien er viktig for å fremme stemness-egenskapene til tumorceller21. Som vist i figur 3økte andelen SP-celler ved kolivelinstimulering.
I det siste eksemplet ble T47D-celler (humane brystkreftceller) forbehandlet med 0,1 μM FRA1-hemmer-SKLB816 (også kalt 13an) i 48 h22. FRA1 er en rapportert portvakt for epitelial-mesenchymal overgang (EMT) og involvert i regulering av tumorstamme23. Som vist i figur 4, reduserte andelen SP-celler på grunn av behandling av FRA1-hemmer.
Figur 1: Gatingstrategi for MDA-MB-231-celler i SP-analyse. (A) Gating strategi for MDA-MB-231 celler, som ble farget med Hoechst 33342 (3 μg/ml) og propidiumjodid (PI, 1 μg/ml). (B) Gating strategi av MDA-MB-231 celler, som ble behandlet med Reserpine (40 μM) og farget med Hoechst 33342 (3 μg/ml) og PI (1 μg/ml). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Optimalisering av Hoechst 33342 konsentrasjon og valg av blokkering i MDA-MB-435 celler. (A) SP-analyseresultatene av MDA-MB-435 celler, som ble farget med Hoechst 33342 (Hoechst) ved forskjellige konsentrasjonsgradienter (0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4 μg/ml) sammen med PI (1 μg/ml). (B) SP-analyseresultatet av MDA-MB-435 celler, som ble behandlet med Verapamil (40 μM) og farget med Hoechst 33342 (2 μg/ml) og PI (1 μg/ml). (C) SP-analyseresultatet av MDA-MB-435 celler, som ble behandlet med Reserpine (40 μM) og farget med Hoechst 33342 (2 μg/ml) og PI (1 μg/ml). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Andelen SP-celler ble forbedret av STAT3-aktivator i A549-celler. (A) SP-analyseresultatene av A549-celler forbehandlet med STAT3-aktivator-Colivelin (100 nM) eller kjøretøyets kontroll (Ctrl)-H2O i 48 timer. A549-celler behandlet med Reserpin (45 μM) ble brukt som blokkeringskontroll. A549 celler ble farget med Hoechst 33342 (7 μg/ml) og PI (1 μg/ml). (B) De statistiske resultatene av andelen SP-celler i A549-celler behandlet med Colivelin (100 nM) og dens kjøretøykontroll. Data presenteres som middelverdi + standardfeil for gjennomsnittet (SEM), n = 3 for hver gruppe. "*" angir P < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Andelen SP-celler ble hemmet av FRA1-hemmer i T47D-celler. (A) SP-analyseresultatene av T47D-celler forbehandlet med SKLB816 (0,1 μM) eller kjøretøyets kontroll (Ctrl)-DMSO i 48 timer. T47D-celler behandlet med Reserpin (40 μM) ble brukt som blokkeringskontroll. T47D-celler ble farget med Hoechst 33342 (8 μg/ml) og PI (1 μg/ml). (B) De statistiske resultatene av andelen SP-celler i T47D-celler behandlet med SKLB816 (0,1 μM) og kjøretøyets kontroll. Data presenteres som gjennomsnitt + SEM, n = 3 for hver gruppe. "*" angir P < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Instruksjoner for trinn nummer 3.1 for flytcytometerprogramvare. (A) Klikk MAPPE -knappen. (B) Klikk Eksperimenter -knappen, og klikk deretter Nytt eksperiment . Klikk her for å laste ned denne figuren.
Supplerende figur 2: Instruksjoner for trinn nummer 3.2 for flytcytometerprogramvare. (A) Klikk OK . (B) Experiment_001 vises under MAPPE. Klikk her for å laste ned denne figuren.
Supplerende figur 3: Instruksjoner for trinn nummer 3.3 for flytcytometerprogramvare. (A) Klikk Experiment_001 -knappen for å endre navnet på Experiment_001 til et bestemt navn (for eksempel "20191118-SP"). (B) Klikk Enter . Klikk her for å laste ned denne figuren.
Supplerende figur 4: Instruksjoner for trinn nummer 3.4 for flytcytometerprogramvare. (A) Klikk Ny prøve - knappen. (B) Klikk på Nytt rør-knappen. (C) Klikk Pilspiss -knappen. Klikk her for å laste ned denne figuren.
Supplerende figur 5: Instruksjoner for strømningscytometer programvare trinn nummer 3.5. (A) Klikk Parametere -knappen for å definere parameterne. Klikk her for å laste ned denne figuren.
Supplerende figur 6: Instruksjoner for trinn nummer 3.6.1.2 for flytcytometerprogramvare. (A) Klikk Prikktegning -knappen for å vise prikktegningen, klikk X-aksen og sett den til "FSC-A"; klikk på Y-aksen og sett den til "PI-A". (B) Klikk Knappen Mangekantet port for å opprette en polygonport for å portere P1-delsettet (også kjent som FSC-A, PI-A-delsett). Klikk her for å laste ned denne figuren.
Supplerende figur 7: Instruksjoner for trinn nummer 3.6.1.3 for flytcytometerprogramvare. (A) Klikk Prikktegning -knappen for å vise prikktegningen, klikk X-aksen og sett den til "FSC-A"; klikk på Y-aksen og sett den til "FSC-W". (B) Høyreklikk prikktegningen, og klikk P1-knappen under Vis populasjoner . (C) Klikk Knappen Rektangulær port for å opprette en rektangulær port for å gate P2-delsettet (også kjent som FSC-A, FSC-W-delsett). Klikk her for å laste ned denne figuren.
Supplerende figur 8: Instruksjoner for trinn nummer 3.6.1.4 for flytcytometerprogramvare. (A) Klikk Prikktegning -knappen for å vise prikktegningen, klikk X-aksen og sett den til "SSC-A"; klikk Y-aksen og sett den tilSSC-W. (B) Høyreklikk prikktegningen, og klikk P2-knappen under Vis populasjoner -knappen. (C) Klikk Re rektangulær port -knappen for å opprette en rektangulær port for å gate P3-delsettet (også kjent som SSC-A, SSC-W-delsett). Klikk her for å laste ned denne figuren.
Supplerende figur 9: Instruksjoner for trinn nummer 3.6.1.5 for flytcytometerprogramvare. (A) Klikk Prikktegning -knappen for å vise prikktegningen, klikk X-aksen og sett den til "Hoechst Red-A"; klikk Y-aksen og sett den til" Hoechst Blue-A". (B) Høyreklikk prikktegningen, og klikk P3-knappen under Vis populasjoner - knappen. (C) Klikk Knappen Mangekantet port for å opprette en polygonport for å portere P4-delsettet (også kjent som Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A-delsett). (D) Høyreklikk prikktegningen, og klikk deretter Vis populasjonshierarki for å vise populasjonshierarkiet. Klikk her for å laste ned denne figuren.
Supplerende figur 10: Instruksjoner for trinn nummer 3.6.1.6 for flytcytometerprogramvare. (A) Klikk Hent data -knappen, og samle deretter inn 20 000-100 000 hendelser fra hvert eksempel. Klikk her for å laste ned denne figuren.
Supplerende figur 11: Instruksjoner for programvare for flytcytometrianalyse trinn nummer 4.1. (A) Åpne programvaren for flytcytometrianalyse og dra en eksempelfil inn i programvaren. (B) Eksempelfilen importeres. Klikk her for å laste ned denne figuren.
Supplerende figur 12: Instruksjoner for programvarenummer for flytcytometrianalyse 4.2.1. (A) Dobbeltklikk denne eksempelfilen. (B) Klikk X-aksen og sett den til "FSC-A"; klikk Y-aksen og sett den til "PI-A". (C) Klikk knappen Opprett en polygonport for å opprette en polygonport. (D) Klikk OK for å hente delsettet FSC-A, PI-A. (E) Delsettet FSC-A, PI-A er hentet. Klikk her for å laste ned denne figuren.
Supplerende figur 13: Instruksjoner for programvarenummer for flytcytometrianalyse 4.2.2. (A) Dobbeltklikk delsettfilen FSC-A, PI-A. (B) Klikk X-aksen og sett den til "FSC-A"; klikk Y-aksen og sett den til" FSC-W". (C) Klikk knappen Opprett en rektangulær port for å opprette en rektangulær port. ( D) Klikk OK for å hente delsettet FSC-A, FSC-W. (E) Delsettet for FSC-A, FSC-W er hentet.
Supplerende figur 14: Instruksjoner for programvarenummer for flytcytometrianalyse 4.2.3. (A) Dobbeltklikk delsettfilen FSC-A, FSC-W. (B) Klikk X-aksen og sett den til" SSC-A"; klikk Y-aksen og sett den tilSSC-W. (C) Klikk knappen Opprett en rektangulær port for å opprette en rektangulær port. (D) Klikk OK for å hente delsettet SSC-A, SSC-W. (E) Delsettet SSC-A, SSC-W er hentet. Klikk her for å laste ned denne figuren.
Supplerende figur 15: Instruksjoner for programvare for flytcytometrianalyse trinn nummer 4.2.4. (A) Dobbeltklikk delsettfilen SSC-A, SSC-W. (B) Klikk X-aksen og sett den til" Hoechst Red-A"; klikk Y-aksen og sett den til" Hoechst Blue-A". (C) Klikk knappen Opprett en polygonport for å opprette en polygonport. (D) Klikk OK for å hente delsettet Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A. (E) Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A-delsettet er oppnådd. Klikk her for å laste ned denne figuren.
Supplerende figur 16: Instruksjoner for programvare for flytcytometrianalyse trinn nummer 4.2.5. (A) Klikk Åpne Oppsettredigering for å åpne redigeringsprogrammet for oppsett. (B) Dra eksempelfilen for SSC-A-, SSC-W-delsettet til Layout Editor. (C) Klikk knappen Klikk for å lagre oppsettsvinduet til filen for å lagre bilderesultatene. Klikk her for å laste ned denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er flere viktige punkter å huske på for SP-analysen. Den første er valget av en riktig blokkering, for eksempel Verapamil eller Reserpine, for hver cellelinje, fordi "gate" -plasseringen av SP-cellene bestemmes i henhold til posisjonen der et stort antall SP-celler forsvinner etter tilsetning av blokkeringen. For MDA-MB-231-cellelinjen fungerer Reserpine bra. For andre cellelinjer kan imidlertid forskjellige blokkeringer fungere bedre.
Den andre er konsentrasjonen av Hoechst 33342. Andelen SP-celler økte etter hvert som fargekonsentrasjonen av Hoechst 33342 gikk ned, slik de representative dataene viste. Dette fenomenet kan forklares av fargeopptak kinetikk24. Endringer i fargekonsentrasjon påvirker berikelse av Hoechst 33342 i celler. Derfor er Hoechst 33342 fargekonsentrasjon nært knyttet til resultatene av SP-analyse. Videre varierer opptak og utvisning av Hoechst 33342 mellom celletyper. Dermed må riktige konsentrasjoner av Hoechst 33342 utforskes for forskjellige cellelinjer før SP-analysen.
Den tredje er en god variasjonskoeffisient (CV) av strømningscytometeret, som også er kritisk for SP-analysen25. UV-laserkraft er et viktig kriterium for bedre CV12. Denne protokollen bruker et kommersielt strømningscytometer (se Materialliste) til å utføre SP-analysen. I dette cuvette-flow-cell instrumentet brukte vi UV-laseren med en effekt på 15 mW for å få de beste CV-ene. Generelt gir en relativt høy UV-lasereffekt de optimale CV-ene. 50–100 mW gir for eksempel det optimale Hoechst-signalet på jet-in-air-instrumenter12. Noen lasere gir lavere UV-strøm, noe som kan redusere CV-er. I disse tilfellene er god laserjustering kritisk.
Den siste er påvirkning av andre faktorer under eksperimentet. Cellestatus, temperatur, fargingstid, drift av strømningscytometri og andre faktorer kan også påvirke andelen og kvaliteten på SP-analysen. Endringer i celle levedyktighet under utarbeidelsen av cellesuspensjoner vil for eksempel påvirke forholdet mellom SP-celler. Derfor må de beste eksperimentelle forholdene utforskes før du utfører SP-analyse. Tatt i betraktning de ovennevnte faktorene, kan SP-forholdet til samme cellelinje målt ved forskjellige laboratorier være forskjellig. For eksempel ble andelen MDA-MB-231-celler og A549-celler rapportert å være ~0,1%–4,8%26,27,28,29 og ~ 0,8%-18%30,31,32,33,34.
Forskere kan endre denne analysen for forskjellige applikasjoner, for eksempel studiet av andre tumorcellelinjer, eller primære pasientavledede tumorceller. Hvis protokollen ikke fungerer bra for cellene som testes, kan forskerne bruke MDA-MB-231 celler som positiv kontroll og flekke cellene etter de gitte spesifikasjonene. Fordi denne protokollen er svært følsom for konsentrasjonen av Hoechst 33342, fargingstemperatur og tid etc., bør forskerne sjekke alle disse forholdene nøye. Prosentandelen SP i mange typer menneskelige tumorcellelinjer er relativt lav (~ 0%-37%)19,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Hvis en for høy eller lav prosentandel av SP observeres, kan det skyldes upassende konsentrasjoner av Hoechst 33342 eller blokkering som brukes. Hvis problemet ser ut til å være relatert til strømningscytometeret, bør teknisk støtte oppnås.
Selv om bruken av SP til å analysere og skille CSCer er svært effektiv, har den fortsatt visse begrensninger. Den første er dens høye følsomhet for fargingsforhold12. Mange faktorer, for eksempel konsentrasjonen av Hoechst 33342, cellestatus, temperatur, tidspunkt for farging, drift av strømningscytometri og blokkeringsvalget, kan påvirke kvaliteten på SP-analysen. Den andre er den cytotoksiske effekten av Hoechst 33342. Hoechst 33342 er et DNA-bindende fargestoff, men er giftig for celler når det når høye konsentrasjoner og reduserer dermed celleaktiviteten37.
Oppsummert er SP-analyse en av de mest brukte metodene de siste årene for å identifisere og rense CSC-er i tumorcellelinjer. Selv om metoden har noen begrensninger, er det i fravær av spesifikke CSCer overflatemarkører fortsatt en metode for praktisk, rask og kostnadseffektiv berikelse av CSC-er. Denne metoden er gunstig for å studere de biologiske funksjonene til CSC og for identifisering av spesifikke overflatemarkører. Videre, ved å oppdage effekten av ulike signaler på SP-forholdet mellom tumorceller, kan det gi ledetråder til den regulatoriske effekten av disse signalveiene på CSC-funksjoner, og lette oppdagelsen av nye mekanismer, som til slutt kan lede målrettet terapi av svulster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Natural Science Foundation of China 81572599, 81773124 og 81972787; Tianjin bys naturvitenskapelige stiftelse (Kina) 19JCYBJC27300; Tianjin People's Hospital &Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Grunnleggende forskningsmidler for de sentrale universitetene, Nankai University 63191153.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 well cell culture plate | CORNING | 3516 | 9.5 cm2 (approx.) |
| Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
| Flow cytometer software | BD Biosciences | FACSDiva | |
| Flow cytometry analysis software | BD Biosciences | FlowJo | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
| Polystyrene round bottom test tube | CORNING | 352054 | 12 x 75 mm, 5 mL |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide |
| Reserpine | Sigma-Aldrich | 83580 | (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester |
| SKLB816 | Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino] -2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride |
References
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
- Batlle, E., Clevers, H.
- Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death & Differentiation. 15 (3), 504-514 (2008).
- Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathologica. 50 (4), 357-368 (2012).
- Bailey, J. M., et al. DCLK1 marks a morphologically distinct subpopulation of cells with stem cell properties in preinvasive pancreatic cancer. Gastroenterology. 146 (1), 245-256 (2014).
- Hurt, E. M., Kawasaki, B. T., Klarmann, G. J., Thomas, S. B., Farrar, W. L. CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis. British Journal of Cancer. 98 (4), 756-765 (2008).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
- Schulenburg, A., et al. Cancer stem cells in basic science and in translational oncology: can we translate into clinical application. Journal of Hematology & Oncolcology. 8, 16 (2015).
- Park, J. W., Park, J. M., Park, D. M., Kim, D. Y., Kim, H. K. Stem Cells Antigen-1 Enriches for a Cancer Stem Cell-Like Subpopulation in Mouse Gastric Cancer. Stem Cells. 34 (5), 1177-1187 (2016).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Goodell, M. A. Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP). Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9 Unit9 18 (2005).
- Begicevic, R. R., Falasca, M. ABC Transporters in Cancer Stem Cells: Beyond Chemoresistance. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).
- Rabindran, S. K., Ross, D. D., Doyle, L. A., Yang, W., Greenberger, L. M. Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein. Cancer Research. 60 (1), 47-50 (2000).
- Takara, K., et al. Differential effects of calcium antagonists on ABCG2/BCRP-mediated drug resistance and transport in SN-38-resistant HeLa cells. Molecular Medicine Reports. 5 (3), 603-609 (2012).
- Matsson, P., Pedersen, J. M., Norinder, U., Bergstrom, C. A., Artursson, P. Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs. Pharmaceutical Research. 26 (8), 1816-1831 (2009).
- Challen, G. A., Little, M. H. A side order of stem cells: the SP phenotype. Stem Cells. 24 (1), 3-12 (2006).
- Wu, C., Alman, B. A. Side population cells in human cancers. Cancer Letters. 268 (1), 1-9 (2008).
- Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. Cancer Research. 65 (14), 6207-6219 (2005).
- Yamada, M., et al. Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer's disease. Neuropsychopharmacology. 33 (8), 2020-2032 (2008).
- Marotta, L. L., et al. The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors. Journal of Clinical Investigation. 121 (7), 2723-2735 (2011).
- Zhang, C. H., et al. From Lead to Drug Candidate: Optimization of 3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine Derivatives as Agents for the Treatment of Triple Negative Breast Cancer. Journal of Medicnal Chemistry. 59 (21), 9788-9805 (2016).
- Tam, W. L., et al. Protein kinase C alpha is a central signaling node and therapeutic target for breast cancer stem cells. Cancer Cell. 24 (3), 347-364 (2013).
- Ibrahim, S. F., Diercks, A. H., Petersen, T. W., van den Engh, G. Kinetic analyses as a critical parameter in defining the side population (SP) phenotype. Experimental Cell Research. 313 (9), 1921-1926 (2007).
- Petriz, J. Flow cytometry of the side population (SP). Current Protocol in Cytometry. , Chapter 9 Unit 9 23 (2013).
- Hiraga, T., Ito, S., Nakamura, H. Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential. Oncology Reports. 25 (1), 289-296 (2011).
- Shen, W., et al. ICAM3 mediates inflammatory signaling to promote cancer cell stemness. Cancer Letters. 422, 29-43 (2018).
- Koh, S. Y., Moon, J. Y., Unno, T., Cho, S. K. Baicalein Suppresses Stem Cell-Like Characteristics in Radio- and Chemoresistant MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through Up-Regulation of IFIT2. Nutrients. 11 (3), 624 (2019).
- Lee, H., Park, S., Kim, J. B., Kim, J., Kim, H. Entrapped doxorubicin nanoparticles for the treatment of metastatic anoikis-resistant cancer cells. Cancer Letters. 332 (1), 110-119 (2013).
- Ota, M., et al. ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells. Cancer Science. 107 (4), 433-443 (2016).
- Wei, H., et al. The mechanisms for lung cancer risk of PM2.5 : Induction of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell properties in human non-small cell lung cancer cells. Environmental Toxicology. 32 (11), 2341-2351 (2017).
- Prasanphanich, A. F., White, D. E., Gran, M. A., Kemp, M. L. Kinetic Modeling of ABCG2 Transporter Heterogeneity: A Quantitative, Single-Cell Analysis of the Side Population Assay. PLoS Computational Biology. 12 (11), 1005188 (2016).
- Han, H., et al. An endogenous inhibitor of angiogenesis inversely correlates with side population phenotype and function in human lung cancer cells. Oncogene. 33 (9), 1198-1206 (2014).
- Loebinger, M. R., Sage, E. K., Davies, D., Janes, S. M. TRAIL-expressing mesenchymal stem cells kill the putative cancer stem cell population. British Journal of Cancer. 103 (11), 1692-1697 (2010).
- Chiba, T., et al. Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties. Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).
