Summary
Um método conveniente, rápido e econômico para medir a proporção de células da população lateral em linhas de células tumorais sólidas é apresentado.
Abstract
As células-tronco cancerígenas (CSCs) são uma importante causa de crescimento tumoral, metástase e recidiva. O isolamento e identificação dos CSCs são de grande importância para a pesquisa de tumores. Atualmente, diversas técnicas são utilizadas para a identificação e purificação de CSCs a partir de tecidos tumorais e linhas de células tumorais. A separação e análise das células da população lateral (SP) são dois dos métodos comumente utilizados. Os métodos dependem da capacidade dos CSCs de expulsar rapidamente corantes fluorescentes, como hoechst 33342. O efflux do corante está associado aos transportadores de de ligação ATP (ABC) e pode ser inibido pelos inibidores do transporte ABC. Métodos para coloração de células tumorais cultivadas com Hoechst 33342 e análise da proporção de suas células de SP por citometria de fluxo são descritos. Este ensaio é conveniente, rápido e econômico. Os dados gerados neste ensaio podem contribuir para uma melhor compreensão do efeito dos genes ou outros sinais extracelulares e intracelulares nas propriedades de tronco das células tumorais.
Introduction
As células-tronco cancerígenas (CSCs) são subconjuntos de células com capacidade de autoconexão e potencial de diferenciação múltipla, que desempenham um papel vital no crescimento do tumor, metástase e recidiva1,2. Atualmente, os CSCs têm sido identificados para existir em uma variedade de tumores malignos, incluindo câncer de pulmão, cérebro, pâncreas, próstata, mama e fígado3,4,5,6,7,8,9. A identificação de CSCs nesses tumores baseia-se principalmente na presença de proteínas de marcadores superficiais, como alta e/ou baixa expressão de CD44, CD24, CD133 e Sca-19,10, mas um marcador único que pode distinguir CSCs de não-CSCs não foi relatado até agora. Atualmente, várias técnicas são utilizadas para identificar e purificar CSCs em tecido tumoral ou linhas de células tumorais. Essas técnicas são projetadas com base nas propriedades específicas dos CSCs. Entre eles, ensaios e triagem de células da população lateral (SP) são dois dos métodos comumente utilizados.
As células-tronco de SP foram originalmente descobertas por Goodell et al.11, quando caracterizaram células-tronco hematopoiéticas em células de medula óssea do rato. Quando as células de medula óssea do rato foram rotuladas com o corante fluorescente Hoechst 33342, um pequeno grupo de células mal manchadas hoechst 33342 apareceu no gráfico de pontos bidimensionais de um ensaio de citometria de fluxo. Hoechst 33342 é um corante de ligação de DNA e tem pelo menos dois modos de ligação que levam a diferentes características espectrais. Ao visualizar a emissão de fluorescência em dois comprimentos de onda ao mesmo tempo, várias populações podem ser reveladas12. Em seu ensaio, o Hoechst 33342 estava animado a 350 nm e a fluorescência foi medida usando o filtro de banda-pass (BP) de 450/20 nm e o filtro de borda de 675 nm de passagem longa (EFLP)11. Comparado com toda a população de células de medula óssea, esse grupo de células foi enriquecido com células-tronco hematopoiéticas chamadas células-tronco de SP11. As células SP são capazes de expulsar rapidamente Hoechst 33342. O efflux deste corante está relacionado aos transportadores de de ligação ATP (ABC)13, que podem ser inibidos por alguns agentes como Fumitremorgin C14, Verapamil e Reserpine15,16. Depois disso, diferentes proporções de células de SP foram detectadas em uma variedade de tecidos, órgãos, tecidos tumorais e linhas de células tumorais17,18,19. Essas células de SP têm muitas características das células-tronco17,19.
Este manuscrito descreve a rotulagem e coloração de células tumorais cultivadas hoechst 33342 e a análise de células de SP por citometria de fluxo. Além disso, a otimização da concentração de Hoechst 33342 e a seleção adequada do bloqueador para uma linha celular tumoral específica usando esta abordagem são mostradas. Finalmente, os efeitos da promoção da haste ou sinais de inibição na proporção de SP nas células tumorais são demonstrados. Os exemplos experimentais demonstram que a análise de SP pode ser usada para explorar os efeitos de vários sinais, como expressão genética, pequenos inibidores, ativadores, citocinas e quimioterapias, sobre a haste tumoral. Comparado a outros métodos de isolamento e purificação de CSCs, como a classificação de CD44+/CD24– população, análise de aldeído desidrogenase (ALDH) e ensaios de formação da esfera tumoral, este método é mais fácil de manipular e é econômico.
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Protocol
1. Preparação celular
- Digestão celular e neutralização
- Células tumorais de sementes (como células MDA-MB-231) em uma placa de 6 poços, e cultivadas em uma incubadora de 37 °C fornecida com 5% de CO2.
- Células de colheita quando sua densidade atinge cerca de 90%. Aspire bem o meio de cultura e lave as células 2x com 3 mL de soro fisco tamponado (PBS).
NOTA: Para examinar os efeitos dos inibidores da via de sinalização (por exemplo, inibidor FRA1) ou ativadores FRA1 (por exemplo, ativador STAT3) sobre as características de tronco das células tumorais, as células tumorais são semeadas em uma placa de 6 poços e pré-tratadas com inibidores ou ativadores por um certo período de tempo antes da colheita. - Adicione 500 μL de 0,25% trypsin-EDTA a cada poço da placa de 6 poços, coloque a placa em uma incubadora a 37 °C por 1-3 minutos (min) e bata suavemente na placa para desprender as células.
NOTA: A digestão prolongada afetará o perfil de PS devido a alterações na viabilidade celular. - Adicione 3 mL de PBS suplementado com 2% de soro bovino fetal (FBS) a cada poço da placa de 6 poços para terminar a digestão e in pipetar suavemente as células para cima e para baixo 3-5x para dispersar as aglomerados celulares.
- Adicione 0,5 mL de suspensão celular a um poço de uma nova placa de poço 6 e examine-a sob um microscópio. Se forem observadas aglomerações celulares, passe a suspensão celular através de um coador de células de 70 μM.
NOTA: Este é um passo opcional. - Transfira as células para um tubo de centrífuga de 15 mL. Células centrífugas a 200 x g por 5 min para células de pelotização. Remova o supernasce e resuspensá-los em 3 mL de PBS complementados com 2% de FBS. Pipeta as células para cima e para baixo 3-5x para misturar completamente.
- Contagem de células
- Adicione 50 μL da suspensão celular em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL e misture-o com uma solução azul trypan de 50 μL. Pipeta 10 μL da mistura para contar o número de células vivas usando um método padrão, como um hemócito.
- Diluir as células em PBS suplementadas com 2% de FBS a uma concentração final de 1 x 106 células/mL. Adicione 1 mL da suspensão celular a um tubo de teste de fundo redondo de poliestireno de 5 mL e prepare dois tubos de amostra.
2. Coloração celular com Hoechst 33342
- Adicione Hoechst 33342 a um tubo para alcançar uma concentração final apropriada.
NOTA: Por exemplo, a concentração apropriada de Hoechst 33342 é de 3 μg/mL para células MDA-MB-231. - Adicione um bloqueador (por exemplo, Fumitremorgin C, Verapamil ou Reserpine) a outro tubo a uma concentração final apropriada e incubar o tubo a 37 °C por 30 minutos antes de adicionar a mesma concentração de Hoechst 33342 como descrito na etapa 2.1.
NOTA: Para células MDA-MB-231, o bloqueador apropriado é Reserpine (40 μM). A reserpina é usada como controle de bloqueio para verificar a ausência de células na área de CONTROLADORia fechada. - Prepare vários tubos contendo células e adicione Hoechst 33342 a diferentes gradientes de concentração. Após um ensaio de citometria de fluxo, escolha a concentração adequada de acordo com o perfil e proporção de SP.
NOTA: Este é um passo opcional usado para definir a concentração adequada de Hoechst 33342. - Prepare vários tubos contendo células, adicione o bloqueador a diferentes gradientes de concentração, incuba os tubos a 37 °C por 30 minutos e adicione Hoechst 33342 a uma concentração apropriada. Após o ensaio de citometria de fluxo, escolha a concentração adequada de acordo com a ausência de células na área de SP fechada.
NOTA: Esta é uma etapa opcional usada para definir a concentração adequada do bloqueador. - Coloque os tubos em uma incubadora de 37 °C e incuba-os por 60 minutos, agitando os tubos a cada 10 minutos.
NOTA: A agitação dos tubos é importante para a coloração, pois garante o contato completo entre as células e o corante para melhores resultados de coloração. - Após a incubação, centrifugar as células a 200 x g, 4 °C por 5 min, e aspirar o supernasce cuidadosamente, pois as células formam pelotas muito soltas e instáveis.
- Células resuspend de cada tubo em 1 mL de PBS gelado suplementado com 2% de FBS e pipeta as células para cima e para baixo 3-5x para misturar completamente. Adicione 1 μL de 1 mg/mL de iodeto de propidium (PI) à suspensão de cada tubo para identificar células mortas.
NOTA: Todos os procedimentos nesta etapa devem ser realizados a 4 °C para inibir o efflux de Hoechst 33342 das células tumorais. Os tubos devem ser protegidos da exposição direta à luz.
3. Análise por citometria de fluxo
NOTA: As instruções de uso do software do citómetro de fluxo (ver Tabela de Materiais) estão descritas nesta seção e as Figuras Suplementares 1-10.
- No software do citómetro de fluxo, clique no botão FOLDER. Clique no botão Experimentar e clique em Novo Experimento (Figura Suplementar 1A,B).
- Clique no botão OK. "Experiment_001" aparecerá na PASTA (Figura Suplementar 2A,B).
- Clique no botão Experiment_001 para alterar o nome da pasta para um nome específico (por exemplo, "20191118-SP"). Clique em Enter. O novo nome ("20191118-SP") aparecerá em FOLDER (Figura Suplementar 3A,B).
- Clique no botão Novo Espécime para adicionar um espécime à nova pasta de experimento ("20191118-SP"). Clique no botão Novo tubo para adicionar um tubo à amostra. Clique no botão Arrowhead (Figura Suplementar 4A-C).
- Clique no botão Parâmetros e configure os parâmetros do citômetro de fluxo(Figura Suplementar 5).
- Use um espelho dirómico de 610 nm de passagem curta (DMSP) para separar os comprimentos de onda de emissão. Use um filtro de 450/20 nm BP para coletar a fluorescência azul e um EFLP de 675 nm para coletar a fluorescência vermelha.
NOTA: Hoechst 33342 está animado com um laser UV a 355 nm e PI está animado em 488 nm.
- Use um espelho dirómico de 610 nm de passagem curta (DMSP) para separar os comprimentos de onda de emissão. Use um filtro de 450/20 nm BP para coletar a fluorescência azul e um EFLP de 675 nm para coletar a fluorescência vermelha.
- Execute as amostras de células no citômetro de fluxo.
NOTA: As células de SP podem ser classificadas por facs (células ativadas por fluorescência) em condições estéreis. Um total de 100.000-500.000 células devem ser coletadas para os experimentos de acompanhamento.- Executar células manchadas com Hoechst 33342 no citómetro de fluxo.
- Coloque tubos contendo células manchadas com Hoechst 33342 no cítmetro.
- Clique no botão Dot Plot para exibir o gráfico de pontos e, em seguida, clique no eixo X e configure-o como " FSC-A"; clique no eixo Y e configure-o para "PI-A". Exibir o gráfico de pontos da área de pulso de dispersão dianteira (FSC-A, eixo X definido para o modo linear) versus a fluorescência PI (conjunto do eixo Y para escala logarítmica). Ajuste as tensões para mostrar as células vivas do lado direito e as células não vivas, que estão brilhantemente manchadas com PI, no canto superior esquerdo. Em seguida, estabeleça um portão de polígono para excluir células mortas e detritos celulares(Figura 1A) clicando no botão Polygon Gate para portão do subconjunto P1, também conhecido como FSC-A, subconjunto PI-A(Figura Suplementar 6A,B).
- Clique no botão Dot Plot para exibir o gráfico de pontos, clique no eixo X e configure-o como " FSC-A"; clique no eixo Y e configure-o para "FSC-W". Exibir o gráfico de pontos de FSC-A (eixo X) versus largura de pulso de dispersão para a frente (eixo FSC-W, Y). Clique com o botão direito do mouse no gráfico de pontos, clique no botão P1 sob o botão Mostrar populações. Clique no botão Portão Retangular para criar um portão retangular para fechar o subconjunto P2 (também conhecido como subconjunto FSC-A, FSC-W). Isso excluirá células com grandes volumes(Figura Suplementar 7A-C e Figura 1A).
- Clique no botão Dot Plot para exibir o gráfico de pontos, clique no eixo X e configure-o como " SSC-A"; clique no eixo Y e configure-o para "SSC-W". Exibir o gráfico de pontos da área de pulso de dispersão lateral (SSC-A, eixo X) versus largura de pulso de dispersão lateral (SSC-W, eixo Y). Clique com o botão direito do mouse no gráfico do ponto e clique no botão P2 no botão Mostrar populações. Em seguida, clique no botão Portão Retangular para criar um portão retangular para fechar o subconjunto P3 (também conhecido como subconjunto SSC-A, SSC-W). Isso obterá uma população celular com granularidade uniforme (Figura Suplementar 8A-C e Figura 1A).
- Clique no botão Dot Plot para exibir o gráfico de pontos, clique no eixo X e configure-o como " Hoechst Red-A"; clique no eixo Y e configurá-lo para "Hoechst Blue-A". Exibir o gráfico de pontos de Hoechst Red-A (eixo X) contra Hoechst Blue-A (eixo Y). Clique com o botão direito do mouse no gráfico de pontos, clique no botão P3 sob o botão Mostrar populações. Clique no botão Polygon Gate para criar um portão de polígono para fechar o subconjunto P4 (também conhecido como subconjunto Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A). Clique com o botão direito do mouse no gráfico de pontos, clique no botão Mostrar hierarquia populacional para mostrar a hierarquia populacional.
NOTA: O gráfico de pontos mostrará três populações diferentes: 1) uma população de fase G0-G1 perto do centro do gráfico; 2) uma população de fase S-G2/M perto do canto superior direito; 3) o SP. Em seguida, o SP é fechado para análise posterior (Figura Suplementar 9A-D e Figura 1A). Se o gráfico de pontos de Hoechst Red-A versus Hoechst Blue-A não mostrar um perfil de SP semelhante ao mostrado na Figura 1A,as tensões devem ser ajustadas até que um perfil semelhante seja visto. Enquanto isso, ajuste todos os portões acima de acordo. - Após determinar a região do portão das células sp, clique em Adquirir Dados para coletar 20.000-100.000 eventos de cada amostra para analisar o percentual de células de SP ( FiguraSuplementar 10).
- Execute as células manchadas de Hoechst 33342 tratadas com bloqueador no citômetro de fluxo.
- Coloque tubos contendo bloqueador no cítômetro e execute células usando as mesmas tensões e portões para verificar se as tensões e portões estão selecionados adequadamente.
NOTA: Em comparação apenas com a mancha hoechst 33342, apenas uma proporção muito pequena de células, se houver, deve aparecer na área fechada da SP (Figura 1B). - Colete 20.000-100.000 eventos de cada amostra para analisar a porcentagem de células de SP.
- Coloque tubos contendo bloqueador no cítômetro e execute células usando as mesmas tensões e portões para verificar se as tensões e portões estão selecionados adequadamente.
- Executar células manchadas com Hoechst 33342 no citómetro de fluxo.
4. Análise de dados
NOTA: As instruções para o uso do software de análise de citometria de fluxo (ver Tabela de Materiais) estão descritas nesta seção e as Figuras Suplementares 11–16.
- Copie os arquivos em formato fcs para um computador, abra o software de análise de citometria de fluxo e arraste um arquivo de amostra para o software (Figura Suplementar 11A,B).
- Células de portão e obter a porcentagem de células de SP.
- Clique duas vezes neste arquivo de amostra,clique no eixo X e configure-o como "FSC-A"; clique no eixo Y e configure-o para "PI-A". Em seguida, crie um portão de polígono e clique no botão OK para obter o subconjunto FSC-A, PI-A(Figura Suplementar 12A-E).
- Clique duas vezes no arquivo do subconjunto FSC-A, PI-A,clique no eixo X e configure-o como "FSC-A"; clique no eixo Y e configure-o para "FSC-W". Em seguida, crie um portão retangular e clique no botão OK para obter o subconjunto FSC-A, FSC-W(Figura Suplementar 13A-E).
- Clique duas vezes no arquivo do subconjunto FSC-A, FSC-W,clique no eixo X e configure-o como "SSC-A"; clique no eixo Y e configure-o para "SSC-W". Em seguida, crie um portão retangular e clique no botão OK para obter o subconjunto SSC-A, SSC-W(Figura Suplementar 14A-E).
- Clique duas vezes no arquivo subconjunto SSC-A, SSC-W,clique no eixo X e configure-o como "Hoechst Red-A"; clique no eixo Y e configurá-lo para "Hoechst Blue-A". Em seguida, crie um portão de polígono e clique no botão OK para obter o subconjunto Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A(Figura Suplementar 15A-E).
- Abra o Editor de layout clicando no botão Editor de layout aberto. Arraste o arquivo subconjunto SSC-A, SSC-W para o Editor de Layout e clique na janela Clique para salvar o botão de arquivo de layout para salvar os resultados da imagem ( FiguraSuplementar 16A-C).
- Salve o espaço de trabalho para manter as informações de gating ao fechar o software.
- Realizar análises de teste t com software de análise estatística para comparar a diferença entre dois grupos. Foi definido um valor de P < 0,05 como estatisticamente significante.
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Representative Results
Foram realizadas quatro análises experimentais de SP de acordo com esse método. No primeiro, detectamos a proporção de células de SP no MDA-MB-231, que é uma linha tripla negativa de células cancerígenas de mama humana, em condições normais. Após a contagem celular, Hoechst 33342 foi adicionado em um tubo contendo 1 x 106 células a uma concentração final de 3 μg/mL. Reserpine e Hoechst 33342 foram adicionados a outro tubo para concentrações finais de 40 μM e 3 μg/mL, respectivamente. Pi foi adicionado a ambos os tubos. O gráfico de pontos do FSC-A (eixo X) versus PI-A (eixo Y) mostrou três populações: 1) uma população celular pi-positiva, que representava as células mortas; 2) detritos celulares; e 3) a população principal foram as células PI-negativas, que foram submetidas a análises posteriores(Figura 1A,B). Uma população unicelular fechada a partir do gráfico de pontos fsc-A (eixo X) versus FSC-W (eixo Y) e o gráfico de pontos de SSC-A (eixo X) versus SSC-W (eixo Y) foi utilizado para analisar a proporção de células de SP(Figura 1A,B). As células sp foram fechadas a partir do gráfico de pontos de Hoechst Red-A (eixo X) versus Hoechst Blue-A (eixo Y), e sua porcentagem foi de cerca de 0,9% em células MDA-MB-231(Figura 1A). No entanto, a Reserpine diminuiu consideravelmente a proporção de células de SP (Figura 1B),sustentando que a pintura do portão para SP está correta.
O segundo experimento foi determinar a concentração de coloração adequada de Hoechst 33342 em células MDA-MB-435. Após a contagem celular, hoechst 33342 foi adicionado a 1 x 106 células, que foram suspensas em 1 mL de PBS complementadas com 2% de FBS, a diferentes gradientes de concentração, incluindo 0,5, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 e 4 μg/mL. Como mostrado na Figura 2A, quando a concentração de Hoechst 33342 era muito baixa (ou seja, 0,5, 1, 1,5 μg/mL), era difícil distinguir células de SP de outras populações celulares, porque muitas células estavam em um estado mal manchado. Quando a concentração de Hoechst 33342 era muito alta (ou seja, 2,5, 3, 3,5, 4 μg/mL), a proporção de células de SP diminuiu até desaparecer. Assim, 2 μg/mL Hoechst 33342 foi a melhor concentração para análise de PS em células MDA-MB-435. Além disso, para determinar o bloqueador adequado para esta linha celular, hoechst 33342 e um bloqueador (Verapamil ou Reserpine) foram adicionados a 1 x 106 células, que foram suspensas em 1 mL de PBS complementadas com 2% de FBS, para concentrações finais de 2 μg/mL e 40 μM, respectivamente. Como mostrado na Figura 2B,cerca de 0,4% das células expulsaram o corante após o tratamento de Verapamil. No entanto, após o tratamento reserpine, a proporção caiu para cerca de 0,1%(Figura 2C). A partir deste experimento, Reserpine foi considerado um bloqueador mais apropriado para esta linha celular.
No terceiro exemplo, as células A549 (células de adenocarcinoma pulmonar humano) foram pré-tratadas com ativador STAT3-Colivelin20 (100 nM) por 48 horas (h). A via de sinalização STAT3 é importante para promover as características de tronco das célulastumorais 21. Como mostrado na Figura 3,a proporção de células de SP aumentou após a estimulação de Colivelina.
No último exemplo, as células T47D (células cancerígenas de mama humana) foram pré-tratadas com 0,1 μM INibidor FRA1-SKLB816 (também chamado de 13an) por 48 h22. FRA1 é um gatekeeper relatado de transição epitelial-mesenquimal (EMT) e envolvido na regulação da haste tumoral23. Como mostrado na Figura 4,a proporção de células de SP diminuiu devido ao tratamento do inibidor FRA1.
Figura 1: Estratégia de gating das células MDA-MB-231 na análise de SP. (A) Estratégia de gating de células MDA-MB-231, que foram manchadas com Hoechst 33342 (3 μg/mL) e iodeto de propídio (PI, 1 μg/mL). (B) Estratégia de gating de células MDA-MB-231, que foram tratadas com Reserpina (40 μM) e manchadas com Hoechst 33342 (3 μg/mL) e PI (1 μg/mL). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Otimização da concentração de Hoechst 33342 e seleção de bloqueador em células MDA-MB-435. (A) Os resultados da análise de SP das células MDA-MB-435, que foram manchadas com Hoechst 33342 (Hoechst) em diferentes gradientes de concentração (0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4 μg/mL) juntamente com PI (1 μg/mL). (B) O resultado da análise de SP das células MDA-MB-435, que foram tratadas com Verapamil (40 μM) e manchadas com Hoechst 33342 (2 μg/mL) e PI (1 μg/mL). (C) O resultado da análise de SP das células MDA-MB-435, que foram tratadas com Reserpina (40 μM) e manchadas com Hoechst 33342 (2 μg/mL) e PI (1 μg/mL). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: A proporção de células de SP foi reforçada pelo ativador STAT3 em células A549. (A) Os resultados da análise de PS das células A549 pré-tratadas com o ativador STAT3-Colivelin (100 nM) ou seu controle de veículo (Ctrl)-H2O por 48 h. As células A549 tratadas com Reserpina (45 μM) foram utilizadas como controle de bloqueio. As células A549 foram manchadas com Hoechst 33342 (7 μg/mL) e PI (1 μg/mL). (B) Os resultados estatísticos da proporção de células de SP em células A549 tratadas com Colivelina (100 nM) e seu controle veicular. Os dados são apresentados como média + erro padrão da média (SEM), n = 3 para cada grupo. "*" indica P < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: A proporção de células de SP foi inibida pelo inibidor FRA1 em células T47D. (A) Os resultados da análise de PS das células T47D pré-tratadas com SKLB816 (0,1 μM) ou seu controle de veículo (Ctrl)-DMSO por 48 h. Células T47D tratadas com Reserpina (40 μM) foram utilizadas como controle de bloqueio. As células T47D foram manchadas com Hoechst 33342 (8 μg/mL) e PI (1 μg/mL). (B) Os resultados estatísticos da proporção de células de SP em células T47D tratadas com SKLB816 (0,1 μM) e seu controle veicular. Os dados são apresentados como média + SEM, n = 3 para cada grupo. "*" indica P < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Instruções para o software do ciclotômetro de fluxo número 3.1. (A) Clique no botão FOLDER. (B) Clique no botão Experimentar e clique no botão Novo Experimento. Clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 2: Instruções para o software do ciclotômetro de fluxo número 3.2. (A) Clique no botão OK. (B) Experiment_001 aparece em FOLDER. Clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 3: Instruções para o software do ciclotômetro de fluxo número 3.3. (A) Clique no botão Experiment_001 para alterar o nome de Experiment_001 para um nome específico (por exemplo, "20191118-SP"). (B) Clique no botão Entrar. Clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 4: Instruções para o software do ciclotômetro de fluxo número 3.4. (A) Clique no botão Novo Espécime. (B) Clique no botão Novo Tubo. (C) Clique no botão Arrowhead. Clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 5: Instruções para o software do ciclotômetro de fluxo número 3.5. (A) Clique no botão Parâmetros para configurar os parâmetros. Clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 6: Instruções para o software do ciclotômetro de fluxo número 3.6.1.2. (A) Clique no botão Dot Plot para exibir o gráfico de pontos, clique no eixo X e configure-o como "FSC-A"; clique no eixo Y e configure-o como "PI-A". (B) Clique no botão Polygon Gate para criar um portão de polígono para portar o subconjunto P1 (também conhecido como subconjunto FSC-A, PI-A). Clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 7: Instruções para o software do ciclotômetro de fluxo número 3.6.1.3. (A) Clique no botão Dot Plot para exibir o gráfico de pontos, clique no eixo X e configure-o como "FSC-A"; clique no eixo Y e configure-o como "FSC-W". (B) Clique com o botão direito do mouse no gráfico de pontos e clique no botão P1 no botão Mostrar populações. (C) Clique no botão Portão Retangular para criar um portão retangular para portar o subconjunto P2 (também conhecido como subconjunto FSC-A, FSC-W). Clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 8: Instruções para o software do ciclotômetro de fluxo número 3.6.1.4. (A) Clique no botão Dot Plot para exibir o gráfico de pontos, clique no eixo X e configure-o como "SSC-A"; clique no eixo Y e configure-o para "SSC-W". (B) Clique com o botão direito do mouse no gráfico do ponto e clique no botão P2 sob o botão Mostrar Populações . (C) Clique no botão Portão Retangular para criar um portão retangular para fechar o subconjunto P3 (também conhecido como subconjunto SSC-A, SSC-W). Clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 9: Instruções para o software do ciclotômetro de fluxo número 3.6.1.5. (A) Clique no botão Dot Plot para exibir o gráfico de pontos, clique no eixo X e configure-o como "Hoechst Red-A"; clique no eixo Y e configurá-lo para "Hoechst Blue-A". (B) Clique com o botão direito do mouse no gráfico do ponto e clique no botão P3 sob o botão Mostrar populações. (C) Clique no botão Polygon Gate para criar um portão de polígono para fechar o subconjunto P4 (também conhecido como subconjunto Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A). (D) Clique com o botão direito do mouse no gráfico de pontos e clique no botão Mostrar hierarquia populacional para mostrar a hierarquia populacional. Clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 10: Instruções para o software do ciclotômetro de fluxo número 3.6.1.6. (A) Clique no botão Adquirir dados e colete 20.000-100.000 eventos de cada amostra. Clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 11: Instruções para análise de citometria de fluxo etapa número 4.1. (A) Abra o software de análise de citometria de fluxo e arraste um arquivo de amostra para o software. (B) O arquivo amostral é importado. Clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 12: Instruções para análise de citometria de fluxo etapa número 4.2.1. (A) Clique duas vezes neste arquivo de amostra. (B) Clique no eixo X e configure-o como "FSC-A"; clique no eixo Y e configure-o para "PI-A". (C) Clique no botão Criar um botão de portão de polígono para criar um portão de polígono. (D) Clique no botão OK para obter o subconjunto FSC-A, PI-A. (E) O subconjunto FSC-A, PI-A é obtido. Clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 13: Instruções para análise de citometria de fluxo etapa número 4.2.2. (A) Clique duas vezes no arquivo do subconjunto FSC-A, PI-A. (B) Clique no eixo X e configure-o como "FSC-A"; clique no eixo Y e configure-o para "FSC-W". (C) Clique no Botão Criar um portão retangular para criar um portão retangular. (D) Clique no botão OK para obter o subconjunto FSC-A, FSC-W. (E) O subconjunto FSC-A, FSC-W é obtido. Clique aqui para baixar esta figura.
Figura suplementar 14: Instruções para análise de citometria de fluxo etapa número 4.2.3. (A) Clique duas vezes no arquivo do subconjunto FSC-A, FSC-W. (B) Clique no eixo X e configure-o como "SSC-A"; clique no eixo Y e configure-o para "SSC-W". (C) Clique no Botão Criar um botão de portão retangular para criar um portão retangular. (D) Clique no botão OK para obter o subconjunto SSC-A, SSC-W. (E) O subconjunto SSC-A, SSC-W é obtido. Clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 15: Instruções para análise de citometria de fluxo etapa número 4.2.4. (A) Clique duas vezes no arquivo subconjunto SSC-A, SSC-W. (B) Clique no eixo X e configure-o como "Hoechst Red-A"; clique no eixo Y e configurá-lo para "Hoechst Blue-A". (C) Clique no botão Criar um botão de portão de polígono para criar um portão de polígono. (D) Clique no botão OK para obter o subconjunto Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A. (E) O subconjunto Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A é obtido. Clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 16: Instruções para análise de citometria de fluxo etapa número 4.2.5. (A) Clique no botão Abrir layout editor para abrir o editor de layout. (B) Arraste o arquivo de amostra de subconjunto SSC-A, SSC-W para o Editor de Layout. (C) Clique na janela Clique para salvar o botão de arquivo de layout para salvar os resultados da imagem. Clique aqui para baixar este número.
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Discussion
Existem vários pontos-chave a serem mente para o ensaio de SP. A primeira é a seleção de um bloqueador adequado, como Verapamil ou Reserpine, para cada linha celular, pois a localização do "portão" das células sp é determinada de acordo com a posição em que um grande número de células de SP desaparece após a adição do bloqueador. Para a linha de células MDA-MB-231, a Reserpine funciona bem. No entanto, para outras linhas de celular, diferentes bloqueadores podem funcionar melhor.
A segunda é a concentração de Hoechst 33342. O percentual de células de SP aumentou à medida que a concentração de manchas de Hoechst 33342 diminuiu, como mostraram os dados representativos. Este fenômeno pode ser explicado pela cinética de absorção decorantes 24. Mudanças na concentração de corante afetam o enriquecimento de Hoechst 33342 nas células. Portanto, a concentração de manchas hoechst 33342 está intimamente relacionada com os resultados do ensaio de SP. Além disso, a absorção e expulsão do Hoechst 33342 variam entre os tipos de células. Assim, as concentrações adequadas de Hoechst 33342 precisam ser exploradas para diferentes linhas celulares antes da análise de SP.
O terceiro é um bom coeficiente de variação (CV) do citómetro de fluxo, que também é fundamental para a análise de SP25. A potência laser UV é um critério importante para melhores CVs12. Este protocolo utiliza um citômetro de fluxo comercial (ver Tabela de Materiais) para realizar o ensaio de PS. Neste instrumento cuvette-flow-cell, usamos o laser UV com um poder de 15 mW para obter os melhores CVs. Em geral, uma potência a laser UV relativamente alta fornece os CVs ideais. Por exemplo, 50-100 mW fornecem o sinal Hoechst ideal nos instrumentos jet-in-air12. Alguns lasers fornecem menor potência UV, o que pode reduzir os CVs. Nestes casos, um bom alinhamento a laser é fundamental.
A última é a influência de outros fatores durante o experimento. O estado celular, temperatura, tempo de coloração, operação da citometria de fluxo e outros fatores também podem afetar a proporção e a qualidade do ensaio de SP. Por exemplo, mudanças na viabilidade celular durante a preparação de suspensões celulares afetarão a razão das células de SP. Portanto, as melhores condições experimentais precisam ser exploradas antes de realizar a análise de SP. Considerando os fatores acima, a razão de SP da mesma linha celular medida por diferentes laboratórios pode ser diferente. Por exemplo, as proporções de células MDA-MB-231 e células A549 foram relatadas como ~0,1%-4,8%26,27,28,29 e ~0,8%-18% 30,31,32,33,34, respectivamente.
Os pesquisadores podem modificar esse ensaio para diferentes aplicações, como o estudo de outras linhas de células tumorais, ou células tumorais derivadas do paciente primário. Se o protocolo não funcionar bem para as células que estão sendo testadas, os pesquisadores podem usar células MDA-MB-231 como controle positivo e manchar as células seguindo as especificações dadas. Como este protocolo é muito sensível à concentração de Hoechst 33342, temperatura e tempo de coloração etc., os pesquisadores devem verificar todas essas condições de perto. O percentual de SP em muitos tipos de linhas de células tumorais humanas é relativamente baixo (~ 0%-37%)19,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Se observar um percentual excessivamente alto ou baixo de PS, pode ser devido a concentrações inadequadas de Hoechst 33342 ou bloqueador utilizado. Se o problema parece estar relacionado ao citómetro de fluxo, deve-se obter suporte técnico.
Embora o uso de SP para analisar e separar CSCs seja altamente eficiente, ele ainda tem certas limitações. A primeira é sua alta sensibilidade às condições de coloração12. Muitos fatores, como a concentração de Hoechst 33342, estado celular, temperatura, tempo de coloração, operação de citometria de fluxo e seleção de bloqueadores, podem afetar a qualidade da análise de SP. O segundo é o efeito citotóxico de Hoechst 33342. Hoechst 33342 é um corante de ligação de DNA, mas é tóxico para as células quando atinge altas concentrações e, portanto, reduz a atividade celular37.
Em resumo, a análise de SP é um dos métodos mais utilizados nos últimos anos para identificar e purificar CSCs em linhas de células tumorais. Embora o método tenha algumas limitações, na ausência de marcadores de superfície CSCs específicos, ainda é um método para o enriquecimento conveniente, rápido e econômico dos CSCs. Este método é benéfico para o estudo das funções biológicas dos CSCs e para a identificação de marcadores de superfície específicos. Além disso, ao detectar os efeitos de vários sinais na razão de SP das células tumorais, ele pode fornecer pistas para o efeito regulatório dessas vias de sinal sobre os recursos dos CSCs, e facilitar a descoberta de novos mecanismos, que podem, em última instância, orientar a terapia-alvo dos tumores.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Fundação de Ciências Naturais da China 81572599, 81773124 e 81972787; Fundação de Ciência Natural da Cidade de Tianjin (China) 19JCYBJC27300; Tianjin People's Hospital & Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Fundos de Pesquisa Fundamentais para as Universidades Centrais, 63191153 da Universidade de Nankai.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 well cell culture plate | CORNING | 3516 | 9.5 cm2 (approx.) |
| Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
| Flow cytometer software | BD Biosciences | FACSDiva | |
| Flow cytometry analysis software | BD Biosciences | FlowJo | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
| Polystyrene round bottom test tube | CORNING | 352054 | 12 x 75 mm, 5 mL |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide |
| Reserpine | Sigma-Aldrich | 83580 | (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester |
| SKLB816 | Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino] -2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride |
References
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