Summary
يقدم هنا بروتوكول لعزل وتضخيم البكتيريا اللاهوائية الهوائية والكلية الملتحمة الماوس الملتحمة باستخدام مسحة عين فريدة من نوعها وخطوة إثراء قائمة على الثقافة مع تحديد لاحق من خلال الأساليب القائمة على الميكروبيولوجية وقياس الطيف الكتلي MALDI-TOF.
Abstract
كان سطح العين يعتبر ذات مرة محصنا متميزا وغير أحيائيا ، ولكن يبدو مؤخرا أن هناك وجودا صغيرا ، ولكن مستمرا. وقد كان تحديد ورصد الأنواع البكتيرية في الغشاء المخاطي العيني تحديا بسبب وفرة منخفضة وتوافر محدود من المنهجية المناسبة لنمو commensal وتحديد. هناك نهجان قياسيان: الثقافة القائمة أو أساليب تسلسل الحمض النووي. الطريقة الأولى هي إشكالية بسبب البكتيريا القابلة للاسترداد محدودة والنهج الثاني يحدد البكتيريا الحية والميتة على حد سواء مما يؤدي إلى تمثيل شاذ من الفضاء العين. طورنا طريقة قوية وحساسة للعزل البكتيري من خلال البناء على تقنيات الاستزراع الميكروبيولوجي القياسية. هذه تقنية تعتمد على المسحة ، باستخدام مسحة رقيقة مصنوعة من "المختبر" تستهدف الملتحمة السفلية ، تليها خطوة تضخيم للأجناس اللاهوائية الهوائية والكلية. وقد سمح لنا هذا البروتوكول لعزل وتحديد الأنواع الملتحمة مثل Corynebacterium spp., Coagulase المكورات العنقودية السلبية spp., العقدية spp. هذا النهج هو مناسبة لتحديد التنوع commensal في الفئران في ظل ظروف المرض المختلفة.
Introduction
الهدف من هذا البروتوكول هو تعزيز عزلة محددة من الميكروبات الهوائية والكلية غير الهوائية القابلة للحياة والنادرة من الملتحمة العينية لتوصيف الميكروبيوم العيني. وقد عرضت دراسات مستفيضة المجتمعات المخاطية كومينسال على الجلد والأمعاء والجهاز التنفسي والأعضاء التناسلية وتبين أن هذه المجتمعات تؤثر على تطور الجهاز المناعي والاستجابة1و2و3. وقد ثبت أن المجتمعات commensal العين لتغيير خلال أمراض معينة، مثل مرض جفاف العين4، متلازمةشيغرن5 ومرض السكري6. ومع ذلك ، فإن القدرة على تحديد مجتمع كومينسال سطح العين النموذجي يعوقها وفرة منخفضة نسبيا مقارنة مع غيرها من المواقع المخاطية6،7،8. وهذا يثير جدلا حول ما إذا كان هناك ميكروبيوم العين المقيم وإذا كان موجودا، ما إذا كان يختلف عن ميكروبيوم الجلد وبالتالي، تأثيره المحلي على تطوير الجهاز المناعي الفطري والاستجابة. يمكن أن يساعد هذا البروتوكول في حل هذه المسألة.
عموما، تستند النهج لتحديد مكانة commensal العين على التسلسل والتقنيات القائمة على الثقافة4،7،9. 16 S rDNA التسلسل وتحليل BRISK7 تظهر تنوعا أوسع من التقنيات القائمة على الثقافة، ولكن غير قادرين على التفريق بين الميكروبات الحية والميتة. نظرا لأن سطح العين معاد للعديد من الميكروبات بسبب خصائص الفيلم المسيل للدموع المضادة للميكروبات4 التي تولد مجموعة كبيرة من شظايا الحمض النووي ، فإن النهج القائمة على الحمض النووي ستكتشف هذه القطع الأثرية التي قد تحرف البيانات نحو تحديد البكتيريا الميتة ككومينسالات مقيمة بدلا من الملوثات. وهذا يؤدي إلى تحديد commensal شاذة وتوصيف الفضاء العين بأنها أعلى في وفرة الميكروبات والتنوع10. وهذا يجعل من الصعب تحديد الميكروبيوم العيني المقيم عن طريق الأساليب القائمة على الحمض النووي. حيث أن التقنيات المستندة إلى الثقافة القياسية غير قادر على الكشف عن commensals لأن التحميل منخفض جدا11. أسلوبنا يحسن على الممارسات القياسية باستخدام مسحة رقيقة التي يمكن أن تستهدف الملتحمة، وبالتالي تجنب التلوث من الجلد المجاور، فضلا عن مفهوم أن الكائنات الحية قابلة للحياة يمكن إثراء من قبل ثقافة قصيرة في وسائل الإعلام الغنية بالمغذيات بهدف إحياء قابلة للحياة ولكن غير قابلة للتكريس، فضلا عن إثراء للميكروبات نادرة قابلة للحياة.
النتائج، وفرة نسبية من commensals العين لكل مسحة العين، تميز الميكروبيوم المقيم الملتحمة ومهمة لأغراض المقارنة. تظهر بياناتنا أن هناك فرقا بين الجلد والميكروبات الملتحمة ، بالإضافة إلى تنوع أكبر مع زيادة العمر والفرق المحدد للجنس في الوفرة. وعلاوة على ذلك ، فقد وجد هذا النهج بشكل مستنسخ اختلافات كومينسال في الفئرانالمغلوبة 12. يمكن تطبيق هذا البروتوكول لوصف الميكروبيوم العيني الذي قد يختلف بسبب ممارسات التكتكة أو الجغرافيا أو حالة المرض ، وكذلك الآثار المحلية لمييضات ومنتجات commensal على تطوير الجهاز المناعي والاستجابة له.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تتبع جميع الإجراءات التي تشمل الفئران المبادئ التوجيهية للجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للحيوانات. اتبع إرشادات السلامة المختبرية (وفقا لتوجيهات إدارة الصحة والسلامة البيئية المؤسسية) عند العمل مع الكائنات الحية الدقيقة والمواد التي يحتمل أن تكون ملوثة. استخدام أوعية النفايات المناسبة وإجراءات إزالة التلوث قبل التخلص من المواد الملوثة المحتملة بالأخطار البيولوجية.
1. إعداد مسحة العين، إعداد حقل العمل، مسح عين الفأر وإثراء العينة
- إعداد مسحات العين العقيمة
ملاحظة: مسحات العين العقيمة هي مسواك خشبية مغلفة رقيقة مع طبقة رقيقة من الألياف من ضرب القطن ومكبرة في المنزل.- كمية مناسبة من الضرب القطن والمواساك لعدد الفئران التي سيتم مسحها.
- قرصة قبالة نصف سنتيمتر طويلة قطعة من القطن الضرب مع الإبهام والسبابة. ندف الضرب عن طريق سحب على حواف مع الإبهام وefingers لتشكيل طبقة واحدة مسطحة مسامية، ووقف فقط قبل الضرب ينهار (بت صغيرة من القطن المنتشرة في جميع أنحاء الضرب امتدت مقبولة).
- دوامة الضرب حول واحدة من النهايات الحادة للمسنك عن طريق عقد طفيفة قطعة امتدت التدريجي على طرف مسواك كما هو الملتوية، انظر الشكل 1. سيكون لمسحة العين "المكتملة" طبقة رقيقة جدا من القطن تمتد على الطرف ، وتمتد ما يقرب من نصف إلى سنتيمتر واحد بعيدا عن الطرف.
- إدراج مسحات "مكتملة" في كوب صغير، مسحة الجانب إلى أسفل وتغطية. "أوتوكلاف"
- إعداد مساحة العمل
- إعداد التخدير التي تحتوي على 2 مل من الكيتامين (100 ملغم / مل), 400 ميكرولتر من xylazine (100 ملغ / مل) و 27.6 مل من المالحة المعقمة (0.9٪ NaCl في DH2O) في أنبوب طرد مركزي معقم 50 مل معقم. تصفية تعقيم وaliquot التخدير للاستخدام الفوري (قد يتم تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة 1 شهر؛ تسمح دائما إلى equilibrate لدرجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام).
- مسح وتنظيف منطقة العمل مع مطهر للحد من التلوث.
- Aliquot 0.5 مل من وسائل الإعلام حقن القلب الدماغ العقيمة (BHI) في المسمى 1.5 مل أنابيب الطرد الدقيق المعقمة (1 أنبوب لكل فأر والتحكم)؛ ترتيب في رف الطرد المركزي الدقيق. وضع الرف على الجليد.
- إعداد تدفق العمل على النحو التالي (من اليسار إلى اليمين): محطة تخدير الماوس (قفص يحتوي على فئران تجريبية، قفص معقم فارغ، تخدير درجة حرارة الغرفة، إبرة 25 G ومحقنة 1 مل)، محطة مسح العين (aliquoted BHI على الجليد، مسحات العين المعقمة، المناشف الورقية النظيفة، رذاذ الأيزوبروبانول 70٪) ومحطة الطلاء (لوحات أجار الدم درجة حرارة الغرفة، 10 ميكرولتر ماصة ، 10 ميكرولتر نصائح التخلص منها العقيمة، حاوية النفايات الخطرة بيولوجيا).
- مسح العين
- إدارة 10 ميكرولتر من التخدير لكل 1 غرام من جرعة وزن الماوس من الكيتامين وإكسيلازين على التوالي intraperitoneally إلى كل فأر الكبار ومكان في قفص autoclaved. اختبار تخدير عن طريق الضغط على لوحة الخلفية; لا توجد حركة تشير إلى تخدير مناسب.
- تعيين يد واحدة للتعامل مع الفئران المخدرة فقط واليد الأخرى للتعامل فقط مع مسحة العين والثقافة. لمسح، وإزالة الماوس تخدير تماما من القفص. مكان على رأس سطح العمل النظيف المتمركزة على جانبها مع العين اليسرى المكشوفة. رش اليدين القفاز مع isopropanol، الجافة مع منشفة ورقية نظيفة.
- Uncap المسمى على وجه التحديد أنبوب الطرد المركزي BHI الصغيرة مع وسائل الإعلام مخصصة التعامل مع اليد. ضع الأنبوب مرة أخرى في رف الطرد المركزي الصغير على الجليد. تراجع طرف القطن المغلفة من مسحة العين في BHI، سحب مسحة العين من أنبوب يحوم تلميح 2 مرات ضد الأنبوب الداخلي لإزالة السائل الزائد.
- مع يد الماوس التعامل مع، عقد بلطف الماوس من قبل scruff من الرقبة. مع جهة أخرى، ضع طرف العين مسحة ضد منطقة الملتحمة المتوسطة للعين اليسرى، انظر الشكل 2A. الاكتئاب طفيفة مقلة العين وتحريك مسحة في نافذة غسل الحركة (الشكل 2B) ذهابا وإيابا، بين الجفن السفلي والعين، 10 مرات. الحفاظ على الضغط المستمر.
- دون لمس الفراء، وإزالة بلطف غيض من مسحة، عمودي إلى حيث تم إدراجها، ووضع الجانب القطن مسحة أسفل مباشرة في أنبوب الطرد المركزي الصغيرة المسماة التي تحتوي على وسائل الإعلام BHI. تطبيق قطرة العين التشحيم إلى العين مسحة.
- أعد الفأرة إلى القفص.
- دع المسحة تقف لمدة 10 إلى 15 دقيقة على الجليد وإزالة مسحة العين باليد القفازة المعقمة عن طريق خلط الطرف في الوسائط لمدة 10 دورات. سحب مسحة عن طريق طرف دوامة ضد الجدار الداخلي للأنبوب الطرد المركزي الجزئي لمدة 5 دورات. التخلص من مسحة في حاوية الخطر البيولوجي.
- كرر الخطوات من 1.3.2 إلى 1.3.7 لكل فأر وعينات التحكم (مسحة الجلد أو الفراء). تعقيم القفازات بشكل مناسب بين كل مسحة.
- تخصيب
- إثراء العينة عن طريق احتضان الأنبوب بشكل ثابت لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية
- أثناء الحضانة، تسمية درجة حرارة غرفة واحدة Trypticase الصويا مع 5٪ لوحة أجار الدم الأغنام (صفيحة TSA) لكل فأر وتقسيمها إلى نصفين.
- بعد احتضان ثقافة مسحة العين، قم بإزالة العينات المخصبة من الحاضنة ووضعها على الجليد.
- لفترة وجيزة دوامة عينات لخلط ولوحة وفقا لتخطيطي في الشكل 3A. Aliquot 10 ميكرولتر من العينة على لوحة TSA وإمالة لوحة لتشكيل شريط، كرر 2 مرات.
- على الجانب الآخر من الخط الفاصل للوح، النقطة 10 ميكرولتر من العينة على أجار، كرر 9 مرات.
- احتضان لوحات في 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة، 2 أيام، و 4 أيام (في غرفة نظيفة تمنع لوحات أجار من التجفيف). عد المستعمرات في شرائط، لاحظ مورفولوجيا وحساب وحدات تشكيل مستعمرة (CFUs) لكل مسحة لعزل مماثلة مورفولوجيا. انظر إلى النقاط للكائنات الحية الفريدة التي لا يتم التقاطها في شرائط.
2. لوحة رئيسية، وتوصيف، وتحديد الميكروبات العين
-
لوحة رئيسية
- رسم الشبكات على الجزء الخلفي من لوحة TSA (الشكل 3B). اختيار مستعمرة مع مسواك معقمة من كل لوحة مسحة عين الماوس وشرائط مربع لوحة رئيسية (الشبكات)، تسمية الشبكة مع رقم المستعمرة ومعلومات الماوس. اختيار لوحة ثلاث مستعمرات مختلفة لكل مستعمرة متميزة شكليا.
- احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 °C. استمر في الحضانة لمدة 96 ساعة، والتحقق يوميا من ظهور عزلات جديدة.
ملاحظة: سوف تختلف السكان Commensal على أساس عمر الماوس والتغذية وحالة المرض وممارسات الكهن. ويستند عزل التوصيف على البكتيريا الهوائية والكلية اللاهوائية السائدة الموجودة في مختبرنا.
-
توصيف
- تكرار13 لوحة الميكروبات على مانيتول الملح أجار (MSA) وماكونكي (MAC) لوحات, احتضان بين عشية وضحاها في 37 °C. لاحظ النمو لكل عزل ووجود مستعمرات شمعية أو مستعمرات صفراء مع هالة على MSA.
- لغرام cocci إيجابية، واختبار مع اختبار كاتالاز13،14. ضع قطرة من بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3٪ على شريحة زجاجية نظيفة. باستخدام مسواك معقمة ، اختر الميكروب المقابل من لوحة مسحة العين. لا يشير تشكيل فقاعة العقدية spp.، تشكيل فقاعة طفيفة يشير Corynebacterium spp. وربما Aerococcus spp. وتشكيل فقاعة سريعة يشير إلى المكورات العنقودية spp.
-
التعريف: تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد من مالدي-توف
ملاحظة: يتم إجراء التعرف البكتيري باستخدام MALDI-TOF وقاعدة بيانات البرامج. يستخدم هذا النظام الليزر بمساعدة مصفوفة تأين وقت قياس الطيف الكتلي للرحلة (MALDI-TOF MS) لتطوير ملامح الأطياف التي تتم مقارنتها بالأطياف البكتيرية المعروفة لتحديد الهوية. E.coli, ATCC 8739, يستخدم لمعايرة النظام.- يعزل بكتيرية الصفائح على لوحات TSA التي تحتوي على 5٪ من دم الأغنام وتحتضن بين عشية وضحاها مع ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية.
- باستخدام حلقة 1 ميكرولتر، وتطبيق طبقة رقيقة من البكتيريا النقية على الشريحة الهدف MALDI-TOF؛ 1 ميكرولتر من MALDI-TOF MS CHCA مصفوفة الحل (ألفا-سيانو-4-هيدروكسي سيناميك حمض) هو مضاف ويسمح للهواء الجاف تماما قبل تحميل الشريحة في صك MALDI-TOF.
- يتم رصد كل عزل في تكرار.
- يتم قبول التقارير التي تحتوي على درجات احتمالية أكبر من 80٪، والتي تشير إلى قيمة تمييز عالية، كنتائج موثوقة وتم قبول الهوية البكتيرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تظهر النتائج التمثيلية للوحة مسحة العين التي تظهر أساليب مختلفة للطلاء في الشكل 3A تظهر عزلات متنوعة شكليا من الماوس C57BL/6. لكل عزلة متميزة، تم عد المستعمرات في القطاع والوفرة النسبية، وحدات تشكيل مستعمرة فريدة من نوعها (CFUs) لكل مسحة عين، محسوبة ورسمت لأغراض المقارنة. لتوصيف الميكروبيولوجية، تم اختيار البكتيريا من لوحات مسحة عين الماوس الفردية لإنتاج لوحة TSA الرئيسية (التي تم إنشاؤها عن طريق اختيار عزل متميزة شكليا في ثلاثة نسخ من كل لوحة مسحة عين الماوس). من اللوحة الرئيسية، في اليوم التالي أو عندما يظهر النمو، تم إجراء اختبارات إضافية لتوصيف أو تحديد الميكروبات. تم استخدام اللوحة الرئيسية لتوفير ما يكفي من inoculum لتوسيع العزلات المعنية.
وتميزت هذه الأنواع باستخدام التقنيات الميكروبيولوجية ثم تم تحديدها من خلال تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد MALDI-TOF. كل عزل من لوحة رئيسية، تم اختبارها بواسطة اختبار كاتالاز13،14 ونمت على وسائل الإعلام الانتقائية. منذ الميكروبات السائدة في دراساتنا هي العقدية SPP., المكورات العنقودية SPP. وكورنيبكتريا SPP., مانيتول الملح أجار (MSA) وماك كونكي أغار (لجنة الهدنة العسكرية) واستخدمت كما أجارانتقائية 13. النمو على مانيتول الملح أجار يشير المكورات العنقودية SPP13,16. منذ MSA يحتوي على فينول الأحمر، هالة صفراء حول المستعمرة يشير المانيتول التخمير والتصنيف كما المكورات العنقودية أوريوس (تأكيد مع اختبارات بديلة مثل اختبار Coagulase)13. النمو على ماكونكي أجار يشير إلى البكتيريا السلبية غرام، منذ الأملاح الصفراوية والبنفسجي الكريستال قادرة على تجاوز الغشاء البكتيري وتمنع نمو البكتيريا إيجابية غرام13. النمو الشمعي على MSA يشير إلى إنتاج حمض الميكوليك وقد يكون بسبب كائنات مثل كورنيباكتيريوم SPP13. وأخيرا، فإن اختبار كاتالاز يميز العقدية spp. من المكورات العنقودية SPP13،16، وفي بعض الحالات ، قد يشير اختبار إيجابي ضعيف Aerococcus spp15.
ولتحديد العزلات، تم تناثر لوحة TSA واحتضانها بين عشية وضحاها في بيئة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ و37 درجة مئوية، وتم تنفيذ مرض التصلب العصبي المتعدد MALDI-TOF. الشكل 4 يظهر النتائج S. اسيدومينيموس (عضو في Viridans العقدية spp. 17)و أ. viridans. في كثير من الأحيان Aerococcus spp. يتم التعرف عليها بشكل خاطئ كمجموعة viridans من العقديات18،19، استنادا إلى الاختبارات البيوكيميائية والفنوتيكية. وتمكنت التصلب المتعدد MALDI-TOF من تحديد العزلات بمستوى ثقة قدره 99.9 مع عدم وجود أنواع غير معروفة.
ويمكن ملاحظة الاختلافات المتحيزة للجنس في الشكل 5، حيث تم استرداد مستويات مختلفة بشكل كبير من الكائنات العضوية من الفئران C57BL/6 الذكور والإناث. تم تحديد الوفرة النسبية لكل عزل. المكورات العقدية اسيدومينيموس, Aerococcus viridans وتخثر المكورات العنقودية السلبية(CNS) عزل #1 وE. القولونية spp. وجدت في جميع الفئران، مع الذكور تظهر وفرة نسبية أعلى وتنوع أكبر.
الشكل 1: مسحة العين الداخلية.
(أ)رقيقة، ما يقرب من 1 سم، وعقدت قطعة من القطن سحب الضرب بين نقطة مسواك معقمة والسبابة وتدحرجت مسواك مع الحفاظ على ضغط طفيف ضد السبابة حتى القطن تدحرجت تماما على طرف مسواك. (ب)مثال مسحة العين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الماوس الملتحمة العين مسحة التنسيب.
(أ)تم إدراج طرف مسحة العين الرطب BHI ، بزاوية 90 درجة ، في الزاوية الوسيطة للعين اليسرى لفأر مخدر ، مما يؤكب مقلة العين. (ب)تم نقل مسحة على طول الملتحمة مع الحفاظ على ضغط طفيف على العين في حركة ذهابا وإيابا، 10 مرات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: النتائج التمثيلية لمسحة العين واللوحات الرئيسية.
(A) 10 ميكرولتر من العين مسحة تلقيح وسائل الإعلام المخصب كان aliquoted على الجانب الأيمن من لوحة أجار الدم وإمالة 30 إلى 60 درجة للسماح للوسائط لتشكيل شرائط وعلى الجانب الأيسر من لوحة, تم الاستغناء عن عشر نقاط 10 ميكرولتر من العينة. تظهر صورة اللوحة المحتضنة مستعمرات فردية وتنوعا مورفولوجيا. (ب)تم إنشاء لوحة رئيسية من العزلات عن طريق اختيار مستعمرة من لوحة مسحة العين وs streaking داخل واحدة من المربعات (الشبكات). ثلاث مستعمرات متشابهة شكليا ملطخة في شبكات منفصلة. كل شبكة لديها ثلاثة خطوط من نفس المستعمرة التي تم انتقاؤها من لوحة مسحة عين الفأر. بعد ظهور النمو على اللوحات ، تميز العزل بطلاء انتقائي واختبار كاتالاز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مثال لنتائج مرض التصلب العصبي المتعدد MALDI-TOF.
تم استزراع كل عزل على TSA بين عشية وضحاها ، وتطبيقه على شريحة MALDI-TOF MS ومتراكبة بمحلول MS MALDI-TOF ، وتجفيف الهواء ورصده في تكرار. تم تحديد نتائج المكورات العقدية اسيدومينيموس (A) وerococcus viridans (B)بشكل إيجابي مع قيمة ثقة 99.9. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: النمو الملتحم المتحيز جنسيا.
تمت مقارنة فئران C57BL6/N المتطابقة مع العمر بالتنوع النسبي. تم مسح العيون وتحديد الكائنات العضوية. وكان الأنواع الأكثر الغالبة العقدية اسيدومينيموس، الذي كان أكثر وفرة بكثير في الذكور من الفئران الإناث (2-way ANOVA ، p<0.0001). تم تحديد 5 عزلات CNS مختلفة، Aerococcus viridans وE.coli. في حين أن بعض عزلات CNS لم تكن موجودة في جميع الفئران ، تم العثور على العقدية أسودريمينيموس ، Aerococcus viridans ، CNS عزل 1 ، وE. coli في جميع الفئران مع وفرة متميزة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بسبب الحالة البكتيرية للسطح العيني ، واجهت العديد من المختبرات صعوبة في عزل commensals العين7،20، مما أدى إلى انخفاض عدد العينات مع النمو وانخفاض وفرة وانخفاض التنوع8. هذه الطريقة تحسن بشكل كبير على الممارسات التقليدية الثقافة4،21 بإضافة خطوة التخصيب ، فضلا عن مسحة العين المعاد تصميمها وتحديدها من قبل مرض التصلب العصبي المتعدد MALDI-TOF. تعالج خطوة التخصيب إمكانية الاسترداد المنخفضة عن طريق تضخيم الحمل البكتيري. الزيادة الكبيرة في البكتيريا القابلة للاسترداد من أقل من 100 CFUs إلى الوفرة النسبية من 2500 CFUs لكل مسحة عين للفئران الذكور من النوع البري تشير إلى أن الحضانة في الوسائط الغنية بالمغذيات ينشط البكتيريا القابلة للحياة ولكن غير القابلة للزراعة22،23، مما يسمح باستعادة الميكروبات الخاملة. وقد أدرجت خطوات الإثراء القائمة على الثقافة الأخيرة في دراسات التسلسل الجزيئي للكائنات الحية المجهرية لتمكين التمييز بين توقيعات التعبير المضيف والميكروبي24و25و26وتضخيم الأجناس النادرة. خطوة إثراء البروتوكول لدينا هي الأولى التي يتم تطبيقها على دراسات الميكروبيوم العيني وتستخدم الإثراء لاختيار الميكروبات الحية ، وتوسيع عدد العزلات النادرة القابلة للاسترداد وربما إحياء commensals قابلة للحياة ولكن غير قابلة للطائفة. وعلاوة على ذلك، لدينا في المنزل جعل مسحة العين يسمح مسحة المستهدفة من الملتحمة، والحد من التلوث من الجلد المحيطة / الفراء بسبب صغر حجمها ورقيقة مدبب شكل مدبب. اختيار سمك طلاء مسحة والمواد المهم21. هذا المختبر جعل مسحة العين المغلفة مع طبقة رقيقة من الضرب القطن غير السامة، والذي يمنع فخ commensal مسحة داخل المواد مسحة، فضلا عن كونها أفضل من مسحات العين الألجينات الكالسيوم التي يمكن أن تكون السيتوكسي27. تظهر الاختبارات الطولية أن طريقتنا قابلة للاستنساخ؛ مع البكتيريا المهيمنة تعافى من مسحات العين بما في ذلك المكورات العقدية spp.، Coagulase المكورات العنقودية السلبية (CNS) ، وكورينيباكتيريوم spp. تتفق هذه النتائج مع النتائج المنشورة للجينات العينية اللاهوائية الكلية المهيمنة7و9و20 التي تم اكتشافها عن طريق الأساليب القائمة على الثقافة أو التصوير. وقد وجدت هذه الطريقة مجموعة أوسع من العزلات في الملتحمة، بما في ذلك الإشريكية القولونية وSpp Pseudomonas. وعلاوة على ذلك، فإن تحديد مرض التصلب العصبي المتعدد من قبل مالدي-TOF يمكن من التمييز بشكل أفضل بين الأجناس والأنواع، مثل مجموعة viridans من العقديات وAerococci spp. 19،28.
ثلاث خطوات حاسمة في تعظيم النتيجة: تصنيع مسحة العين، وتقنية مسحة العين واختيار عزل فريدة من لوحة مسحة العين. كما هو موضح أعلاه، طبقة مسطحة رقيقة جدا من القطن مهم لالتقاط الأولي commensals من سطح العين وكذلك لإطلاقها في وقت لاحق في وسائل الإعلام الإثراء. يمكن أن تؤدي المسحات السميكة أو المتكتلة إلى اختيار الملوثات ، بالإضافة إلى الاحتفاظ بالعزلات داخل طرف المسحة. ثانيا، الاكتئاب المستمر لمقلة العين أثناء المسح ضروري لتقليل التلوث من الأسطح المحيطة. تقنية المسح المثالي ينطوي على الإدراج العادي (90 درجة) من مسحة في fornix الملتحمة أدنى وسيطة وضغط مسحة ثابتة إلى جانب حركة مستمرة بطيئة. وأخيرا، يجب مراقبة لوحة مسحة العين يوميا لتحديد لعزل تظهر حديثا أو تلك التي تنمو بمعدل مختلف من أجل التقاط الميكروبيوم ممثل تماما.
هناك بعض القيود البروتوكول التي يمكن معالجتها مع فهم واضح لنتائج أو تعديل البروتوكول. النتائج هي مقياس لوفرة commensal قابلة للحياة نسبيا، وليس العبء البكتيري الملتحمة الفعلية، وذلك بهدف تحديد المجتمع كومينسال العين. وقد استخدمت وفرة النسبية والتنوع في دراساتنا لأغراض المقارنة في التهاب القرنية البكتيرية، وكذلك، للتحقيق في الاستجابة المناعية الفطرية في الفئران ضرب المغلوب والبرية نوع12. وبالإضافة إلى ذلك، يعتمد تحديد الهوية من قبل MALDI-TOF MS على قاعدة بيانات كبيرة28،وتقديم نتيجة "لا معرف" لملامح الأطياف عزل غير معروف، وتسليط الضوء على أهمية استخدام قاعدة بيانات الحالية. وأخيرا، لا يكتشف هذا البروتوكول سوى البكتيريا اللاهوائية الهوائية والكلية، ولكن إطاره قابل للتكيف ويمكن البناء عليه للمساعدة في تحديد المساحة الميكروبية العينية عن طريق تعديل وسائط الإثراء وظروف نمو الصفائح ووسيط الاختيار. عن طريق تغيير لوحة رئيسية وظروف نمو التخصيب إلى اللاهوائية, ثم آخر commensal العين معزولة عادة, بروبونيباكتيريوم spp. أو غيرها من anaerobes, يمكن الكشف عن; على الرغم من أننا في أيدينا لم نر أي نمو لاهوائي تقريبا.
وربما يمكن استخدام هذا الإطار بالاقتران مع تقنيات تسلسل الحمض النووي العميقة. عقبة رئيسية في تحديد الميكروبات عن طريق تسلسل الحمض النووي هو عدم القدرة على تقييم الجدوى10. قد يوفر هذا البروتوكول طريقة متعامدة عن طريق تعديل وسائط الإثراء وشروط الطلاء لمطابقة معايير النمو المفضلة لدى المرشح المعزول (المحددة بتسلسل الحمض النووي). وقد يؤدي ذلك إلى اتباع نهج قيم قائم على الثقافة لالتقاط الكومينسالات من البكتيريا القابلة للحياة ولكن غير القابلة للتعجيز أو الأنواع الحالية ولكن المنخفضة الوفرة.
تعريف المجتمع commensal العين قابلة للحياة أمر ضروري لدراسة ملامح التعبير commensal العين. تشير الأبحاث الواسعة إلى أن سلسلة قصيرة من الأحماض الدهنية والمنتجات الميكروبيةتعدل الاستجابة المناعية العينية3و29و30و31و32و33، وأن عملها يحدث محليا. وهذا يشير إلى أن الإنتاج ليس فقط بعيدا، ولكن الإنتاج المحلي لهذه العوامل مهم. أيضا، حالات المرض مثل أمراض جفاف العين والسكري تغيير الميكروبيوم سطح العين4،6،33،34. وهذا يسلط الضوء على الحاجة إلى طريقة تربط التسلسل القائم على الحمض النووي وكذلك النهج القائمة على الثقافة حتى يمكن تحديد الميكروبيوم البصري القابل للتطبيق في الصحة والمرض بشكل أفضل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا تضارب في المصالح للكشف.
Acknowledgments
دعم التمويل من P30 DK034854 VY وLB والدراسات في مركز ماساتشوستس المضيف الميكروبيوم والتمويل من NIH / NEI R01 EY022054 دعم MG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 to 10 µl pipet tip | USA Scientific | 1110-300 | autoclave before use |
| 0.5 to 10 µl Eppendorf pipet | Fisher Scientific | 13-690-026 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | BD309623 | 1 syringe for each eye swab group |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | autoclave before use |
| 1000 µ ml pipet tip | USA Scientific | 1111-2021 | autoclave before use |
| 200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000) | Fisher Scientific | F123602G | |
| 25 G needle | Fisher Scientific | 14-826AA | 1 needle per eye swab group |
| 3 % Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | S25359 | |
| 37 ° C Incubator | Lab equipment | ||
| 70 % Isopropanol | Fisher Scientific | PX1840-4 | |
| Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml) | Santa Cruz Animal Health | SC-362949Rx | |
| BD BBL Gram Stain kit | Fisher Scientific | B12539 | |
| Bunsen Burner | Lab equipment | ||
| Clean paper towels | Lab equipment | ||
| Cotton Batting/Sterile rolled cotton | CVS | ||
| Disposable 1 ml Pipets | Fisher Scientific | 13-711-9AM | for Gram stain and catalase tests |
| E.coli | ATTC | ATCC 8739 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for Gram stain and catalase tests |
| Ketamine (100mg/ml) | Henry Schein | 9950001 | |
| Mac Conkey Agar Plates | Fisher Scientific | 4321270 | store at 4 °C until ready to use |
| Mannitol Salt Agar | Carolina Biological Supply | 784641 | Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week |
| Mice | Jackson Labs | C57/BL6J | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | for Mannitol Salt agar plates |
| RPI Brain Heart Infusion Media | Fisher Scientific | 50-488525 | prepare according to directions and autoclave |
| SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone) | EMD/Millipore, Fisher Scientifc | SCGP00525 | to sterilize anesthesia |
| Sterile Corning Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 430829 | anesthesia preparation |
| Sterile mouse cage | Lab equipment | ||
| Tooth picks (round bamboo) | Kitchen Essentials | autoclave before use and swab preparation | |
| Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates | Fisher Scientific | 4321261 | store at 4 °C until ready to use |
| Vitek target slide | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS CHCA matrix solution | BioMerieux Inc. Durham, NC | 411071 | |
| Single use eye drops | CVS Pharmacy | Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each |
References
- Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T cell generation. Nature. 504 (7480), 451-455 (2013).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2010).
- Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).
- Graham, J. E., et al. Ocular pathogen or commensal: a PCR based study of surface bacterial flora in normal and dry eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (12), 5616-5623 (2007).
- Wang, C., et al. Sjögren-Like Lacrimal Keratoconjunctivitis in Germ-Free Mice. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 565-584 (2018).
- Ham, B., Hwang, H. B., Jung, S. H., Chang, S., Kang, K. D., Kwon, M. J. Distribution and diversity of ocular microbial communities in diabetic patients compared with healthy subjects. Current Eye Research. 43 (3), 314-324 (2018).
- Doan, T., et al. Paucibacterial microbiome and resident DNA virome of the healthy conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (13), 5116-5126 (2016).
- Kugadas, A., Gadjeva, M. Impact of microbiome on ocular health. Ocular Surface. 14 (3), 342-349 (2016).
- Dong, Q., et al. Diversity of bacteria at healthy human conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 5408-5413 (2011).
- Zegans, M. E., Van Gelder, R. N. Considerations in understanding the ocular surface microbiome. American Journal of Opthalmology. 158 (3), 420-422 (2014).
- Fleiszig, S. M., Efron, N. Microbial flora in eyes of current and former contact lens wearers. Journal of Clinical Microbiology. 30 (5), 1156-1161 (1992).
- Lu, X., et al. Neutrophil L-Plastin Controls Ocular Paucibacteriality and Susceptibility to Keratitis. Frontiers in Immunology. 11, 547 (2020).
- Johnson, T. R., Case, C. L. Laboratory Experiments in Microbiology. , Pearson Benjamin Cummings Pubs. San Francisco, CA. (2010).
- Reiner, K.
- UK SMI. Standards for Microbiology Investigation. UK SMI. , Gov.UK. (2014).
- Sharp, S. E., Searcy, C. Comparison of mannitol salt agar and blood agar plates for identification and susceptibility testing of Staphylococcus aureus in specimens from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 44 (12), 4545-4546 (2006).
- Siegman-Igra, Y., Azmon, Y., Schwartz, D. Milleri group streptococcus--a stepchild in the viridans family. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 31 (9), 2453-2459 (2012).
- Mohan, B., Zaman, K., Anand, N., Taneja, N. Aerococcus Viridans: A Rare Pathogen Causing Urinary Tract Infection. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 11 (1), 1-3 (2017).
- Senneby, E., Nilson, B., Petersson, A. C., Rasmussen, M. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry is a sensitive and specific method for identification of aerococci. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1303-1304 (2013).
- Wan, S. J., et al. IL-1R and MyD88 contribute to the absence of a bacterial microbiome on the healthy murine cornea. Frontiers in Microbiology. 9, 1117 (2018).
- Ozkan, J., et al. Temporal Stability and Composition of the Ocular Surface Microbiome. Scientific Reports. 7 (1), 9880 (2017).
- Oliver, J. M. The viable but non-culturable state in bacteria. Journal of Microbiology. 43 (1), 93-100 (2005).
- Epstein, S. S.
- Whelan, F. J., et al. Culture-enriched metagenomic sequencing enables in-depth profiling of the cystic fibrosis lung microbiota. Nature Microbiology. 5 (2), 379-390 (2020).
- Raymond, F., et al. Culture-enriched human gut microbiomes reveal core and accessory resistance genes. Microbiome. 7, 56 (2019).
- Peto, L., et al. Selective culture enrichment and sequencing of feces to enhance detection of antimicrobial resistance genes in third-generation cephalosporin resistant Enterobacteriaceae. PLoS One. 14 (11), 0222831 (2019).
- Lauer, B. A., Masters, H. B. Toxic effect of calcium alginate swabs on Neisseria gonorrhoeae. Journal of Clinical Microbiology. 26 (1), 54-56 (1988).
- Dubois, D., et al. Performances of the Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for rapid identification of bacteria in routine clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 50 (8), 2568-2576 (2012).
- Kawakita, T., et al. double-blind study of the safety and Efficacy of 1%D-3-Hydroxybutyrate eye drops for Dry Eye Disease. Scientific Reports. 6, 20855 (2016).
- Lee, H. S., Hattori, T., Stevenson, W., Cahuhan, S. K., Dana, R. Expression of toll-like receptor 4 contributes to corneal inflammation in experimental dry eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (9), 5632-5640 (2012).
- Simmons, K. T., Xiao, Y., Pflugfelder, S. C., de Paiva, C. S. Inflammatory response to lipopolysaccharide on the ocular surface in a murine dry eye model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (6), 2444-2450 (2016).
- Miller, D., Ioviano, A. The role of microbial flora on the ocular surface. Current Opinion in Allergy and Immunology. 9 (5), 466-470 (2009).
- Nayyar, A., Gindina, S., Barron, A., Hu, Y., Danias, J. Do epigenetic changes caused by commensal microbiota contribute to development of ocular disease? A review of evidence. Human Genomics. 14 (1), 11 (2020).
- Stevenson, W., et al. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).
