Summary
Hier wird ein Protokoll zur Isolierung und Amplifikation aerober und fakultativer anaerober Maus-Bindehaut-Kommensalbakterien unter Verwendung eines einzigartigen Augenabstrichs und eines kulturbasierten Anreicherungsschritts mit anschließender Identifizierung durch mikrobiologische Methoden und MALDI-TOF-Massenspektrometrie vorgestellt.
Abstract
Die Augenoberfläche galt einst als immunprivilegiert und abiotisch, aber in letzter Zeit scheint es, dass es eine kleine, aber anhaltende kommensale Präsenz gibt. Die Identifizierung und Überwachung von Bakterienarten an der Augenschleimhaut war aufgrund ihrer geringen Häufigkeit und der begrenzten Verfügbarkeit geeigneter Methoden für das kommensale Wachstum und die Identifizierung eine Herausforderung. Es gibt zwei Standardansätze: kulturbasierte oder DNA-Sequenzierungsmethoden. Die erste Methode ist aufgrund der begrenzten rückgewinnbaren Bakterien problematisch und der zweite Ansatz identifiziert sowohl lebende als auch tote Bakterien, was zu einer abweichenden Darstellung des Augenraums führt. Wir haben eine robuste und empfindliche Methode zur Bakterienisolierung entwickelt, indem wir auf mikrobiologischen Standardkulturtechniken aufbauen. Dies ist eine auf Tupfern basierende Technik, bei der ein "im Labor" hergestellter dünner Tupfer verwendet wird, der auf die untere Bindehaut abzielt, gefolgt von einem Amplifikationsschritt für aerobe und fakultative anaerobe Gattungen. Dieses Protokoll hat es uns ermöglicht, Bindehautarten wie Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp. usw.zu isolieren und zu identifizieren. Der Ansatz eignet sich, um die kommmensale Diversität bei Mäusen unter verschiedenen Krankheitsbedingungen zu definieren.
Introduction
Ziel dieses Protokolls ist es, die spezifische Isolierung lebensfähiger und seltener aerober und fakultativer anaerober Mikroben aus der okulären Bindehaut zu verbessern, um das okuläre Mikrobiom zu charakterisieren. Umfangreiche Studien haben kommensale Schleimhautgemeinschaften auf Haut, Darm, Atemwegen und Genitaltrakt profiliert und zeigen, dass diese Gemeinschaften die Entwicklung des Immunsystems und die Reaktion beeinflussen1,2,3. Es wurde gezeigt, dass sich okuläre Kommensalgemeinschaften während bestimmter Krankheitspathologien wie der Erkrankung des trockenen Auges4, des Sjögren-Syndroms5 und des Diabetes6verändern. Die Fähigkeit, eine typische kommensale Gemeinschaft an der Augenoberfläche zu definieren, wird jedoch durch ihre relativ geringe Häufigkeit im Vergleich zu den anderenSchleimhautstellen behindert 6,7,8. Dies löst eine Kontroverse darüber aus, ob es ein residentes Augenmikrobiom gibt und ob es existiert, ob es sich vom Hautmikrobiom und folglich seiner lokalen Wirkung auf die Entwicklung und Reaktion des angeborenen Immunsystems unterscheidet. Dieses Protokoll kann helfen, diese Frage zu lösen.
Im Allgemeinen basieren Ansätze zur Definition der okulären kommensalen Nische auf Sequenzierung und kulturbasierten Techniken4,7,9. 16 S rDNA-Sequenzierung und BRISK-Analyse7 zeigen eine größere Vielfalt als kulturbasierte Techniken, sind aber nicht in der Lage, zwischen lebenden und toten Mikroben zu unterscheiden. Da die Augenoberfläche für viele Mikroben aufgrund der antimikrobiellen Eigenschaften des Tränenfilms 4 feindlichist, die eine große Anzahl von DNA-Fragmenten erzeugen, werden DNA-basierte Ansätze diese Artefakte erkennen, die die Daten zur Identifizierung toter Bakterien als ansässige Kommensale und nicht als Verunreinigungen verzerren können. Dies führt zu einer abweichenden kommensalen Identifizierung und Charakterisierung des Augenraums als höher in Mikrobenhäufigkeit und Diversität10. Dies macht es schwierig, das ansässige okuläre Mikrobiom mit DNA-basierten Methoden zu definieren. Während Standardkulturbasierte Techniken keine Kommensalen erkennen können, weil die Last zu niedrig ist11. Unsere Methode verbessert die Standardpraktiken, indem sie einen dünnen Tupfer verwendet, der auf die Bindehaut abzielen kann, wodurch eine Kontamination durch benachbarte Haut vermieden wird, sowie das Konzept, dass lebensfähige Organismen durch kurze Kultur in nährstoffreichen Medien angereichert werden können, mit dem Ziel, lebensfähige, aber nicht kultivierbare, sowie die Anreicherung seltener lebensfähiger Mikroben wiederzubeleben.
Die Ergebnisse, relative Häufigkeit von okulären Kommensalen pro Augenabstrich, charakterisieren das Bindehaut-residente Mikrobiom und sind für Vergleichszwecke wichtig. Unsere Daten zeigen, dass es einen Unterschied zwischen Haut und Bindehautmikrobiota sowie eine größere Vielfalt mit zunehmendem Alter und einem geschlechtsspezifischen Unterschied in der Fülle gibt. Darüber hinaus hat dieser Ansatz reproduzierbar kommsale Unterschiede bei Knock-out-Mäusengefunden 12. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um das okuläre Mikrobiom zu beschreiben, das aufgrund von Käfigpraktiken, Geografie oder Krankheitszustand variieren kann, sowie die lokalen Auswirkungen von kommensalen Metaboliten und Produkten auf die Entwicklung und Reaktion des Immunsystems.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Verfahren mit Mäusen folgen den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee. Befolgen Sie die Laborsicherheitsrichtlinien (gemäß den Anweisungen Ihrer Abteilung für umweltbedingte Gesundheit und Sicherheit), wenn Sie mit Mikroorganismen und potenziell kontaminierten Materialien arbeiten. Verwenden Sie geeignete Abfallbehälter und Dekontaminationsverfahren, bevor Sie potenziell biologisch kontaminationsgefährdete Materialien entsorgen.
1. Vorbereitung des Augenabstrichs, Arbeitsfeld-Setup, Mausaugenabstrich und Probenanreicherung
- Sterile Augenabstriche vorbereiten
HINWEIS: Sterile Augenabstriche sind dünn beschichtete Holzzahnstocher mit einer faserdünnen Schicht Baumwolle, die im eigenen Haus hergestellt werden.- Autoklav angemessene Menge an Baumwollschlägern und Zahnstochern für die Anzahl der Mäuse, die abgetupft werden sollen.
- Kneifen Sie ein halbes Zentimeter langes Stück Baumwollschläger mit Daumen und Zeigefinger ab. Necken Sie das Schlagen, indem Sie mit Daumen und Zeigefingern an den Kanten ziehen, um eine flache, einzelne poröse Schicht zu bilden, die kurz vor dem Auseinanderfallen des Schlages stoppt (kleine Baumwollstücke, die über den gestreckten Schlag verteilt sind, sind akzeptabel).
- Schwenken Sie den Schlag um eines der scharfen Enden des Zahnstochers, indem Sie das ausgestreckte Stück leicht an der Zahnstocherspitze halten, während es verdreht wird, siehe Abbildung 1. Der "fertige" Augenabstrich wird eine sehr dünne Schicht Baumwolle über die Spitze gespannt haben, die sich etwa einen halben bis einen Zentimeter von der Spitze entfernt erstreckt.
- "Fertige" Tupfer in kleines Becherglas geben, mit der Seite nach unten abtupfen und abdecken. Autoklav.
- Einrichten des Arbeitsbereichs
- Bereiten Sie eine Anästhesie mit 2 ml Ketamin (100 mg/ml), 400 μL Xylazin (100 mg/ml) und 27,6 ml steriler Kochsalzlösung (0,9% NaCl in dH 2 O) ineinemsterilen 50 ml sterilen Zentrifugenröhrchen vor. Filter sterilisieren und aliquote Anästhesie für den sofortigen Gebrauch (kann bei 4 ° C für 1 Monat gelagert werden; immer vor gebrauchen auf Raumtemperatur ausgleichen lassen).
- Reinigen und reinigen Sie den Arbeitsbereich mit Desinfektionsmittel, um Verunreinigungen zu minimieren.
- Aliquot 0,5 ml steriles Brain Heart Infusion Media (BHI) in markierte 1,5 ml sterile Mikrozentrifugenröhrchen (1 Röhrchen pro Maus und Kontrolle); im Mikrozentrifugenge-Rack anordnen. Stellen Sie das Rack auf Eis.
- Arbeitsablauf wie folgt einrichten (von links nach rechts): Mausanästhesiestation (Käfig mit Versuchsmäusen, leerer steriler Käfig, Anästhesie bei Raumtemperatur, 25 G Nadel und 1 ml Spritze), Augenabstrichstation (aliquoteiertes BHI auf Eis, sterilisierte Augenabstriche, saubere Papierhandtücher, 70% Isopropanol-Spray) und Beschichtungsstation (Blutagarplatten bei Raumtemperatur, 10 μL Pipette) , 10 μL sterile Einwegspitzen, Biogefahren-Abfallbehälter).
- Augenabstrich
- 10 μL Anästhesie pro 1 g Mausgewichtsdosis von Ketamin bzw. Xylazin intraperitoneal an jede erwachsene Maus verabreichen und in einen autoklavierten Käfig geben. Testen Sie die Betäubung durch Zusammendrücken des Hinterfußpolsters; keine Bewegung deutet auf eine angemessene Betäubung hin.
- Weisen Sie eine Hand zu, nur mit betäubten Mäusen umzugehen und die andere Hand, nur mit dem Augenabstrich und der Kultur umzugehen. Zum Abtupfen die vollständig betäubte Maus aus dem Käfig entfernen; auf die saubere Arbeitsfläche legen, die auf der Seite mit dem linken Auge positioniert ist. Behandschuhte Hände mit Isopropanol besprühen, mit sauberem Papiertuch trocknen.
- Uncap speziell beschriftete BHI-Mikrozentrifugenröhre mit dedizierter Medienhandhand. Legen Sie das Röhrchen wieder in das Mikrozentrifugengestell auf Eis. Tauchen Sie die mit Baumwolle beschichtete Spitze des Augenabstrichs in BHI, ziehen Sie den Augenabstrich aus dem Schlauch und schwenken Sie die Spitze 2 Mal gegen den Innenschlauch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
- Halten Sie die Maus mit der Hand vorsichtig am Hals. Legen Sie mit der anderen Hand den Augentupfer gegen die mediale Bindehautregion des linken Auges, siehe Abbildung 2A. Drücken Sie den Augapfel leicht und bewegen Sie den Tupfer in einer Fensterwaschbewegung (Abbildung 2B) zwischen Unterlid und Auge 10 Mal hin und her. Halten Sie konstanten Druck aufrecht.
- Ohne das Fell zu berühren, entfernen Sie vorsichtig die Spitze des Tupfers senkrecht zur Stelle, an der sie eingeführt wurde, und legen Sie die Wattebauschenseite direkt nach unten in ein markiertes Mikrozentrifugenröhrchen mit BHI-Medien. Tragen Sie einen schmierenden Augentropfen auf das abgetupfte Auge auf.
- Bringen Sie die Maus in den Käfig zurück.
- Lassen Sie den Tupfer 10 bis 15 minuten auf Eis stehen und entfernen Sie den Augenabstrich mit der sterilisierten behandschuhten Hand, indem Sie die Spitze für 10 Umdrehungen in das Medium mischen. Ziehen Sie den Tupfer zurück, indem Sie die Spitze für 5 Umdrehungen gegen die Innenwand des Mikrozentrifugenrohrs schwenken. Entsorgen Sie den Tupfer in einem Biohazard-Behälter.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.3.2 bis 1.3.7 für jede Maus und für Kontrollproben (Haut- oder Fellabstrich). Sterilisieren Sie die Handschuhe entsprechend zwischen jedem Tupfer.
- Anreicherung
- Anreichern der Probe durch statische Inkubation des Röhrchens für 1 h bei 37 °C
- Während der Inkubation ein Trypticase-Soja bei Raumtemperatur mit 5% Schafsblut-Agarplatte (TSA-Platte) pro Maus beschriften und in zwei Hälften teilen.
- Nach der Inkubation der Augenabstrichkultur angereicherte Proben aus dem Inkubator entfernen und auf Eis legen.
- Kurz Wirbelproben zum Mischen und Platten gemäß dem Schema in Abbildung 3A. Aliquot 10 μL der Probe auf die TSA-Platte und kippen Sie die Platte, um einen Streifen zu bilden, wiederholen Sie 2 mal.
- Auf der anderen Seite der Trennlinie der Platte, Punkt 10 μL der Probe auf Agar, wiederholen Sie 9 mal.
- Inkubieren Sie Die Platten bei 37 °C für 18 h, 2 Tage und 4 Tage (in einer sauberen Kammer, die das Trocknen von Agarplatten verhindert). Zählen Sie Kolonien in Streifen, notieren Sie die Morphologie und berechnen Sie koloniebildende Einheiten (CFUs) pro Tupfer für morphologisch ähnliche Isolate. Schauen Sie sich Punkte für einzigartige Organismen an, die nicht in Streifen gefangen sind.
2. Hauptplatte, Charakterisierung und Identifizierung von Augenmikroben
-
Masterplatte
- Zeichnen Sie Gitter auf der Rückseite einer TSA-Platte (Abbildung 3B). Wählen Sie eine Kolonie mit einem sterilen Zahnstocher von jeder Mausaugenabstrichplatte und streifen Sie das Hauptplattenquadrat (Gitter), das Etikettenraster mit kolonienummer und Mausinformationen. Wählen und tafeln Sie drei verschiedene Kolonien für jede morphologisch unterschiedliche Kolonie.
- Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 °C. Setzen Sie die Inkubation für 96 Stunden fort und überprüfen Sie täglich das Auftreten neuer Isolate.
HINWEIS: Die kommmensale Population variiert je nach Alter, Ernährung, Krankheitszustand und Käfigpraktiken der Maus. Die Isolatcharakterisierung basiert auf den vorherrschenden aeroben und fakultativen anaeroben Bakterien, die in unserem Labor gefunden werden.
-
Charakterisierung
- Duplizieren Sie13 Plattenmikroben auf Mannitol Salt Agar (MSA) und MacConkey (MAC) Platten, inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C. Beachten Sie das Wachstum für jedes Isolat und das Vorhandensein von wachsartigen Kolonien oder gelben Kolonien mit Halo auf MSA.
- Für grampositive Kokken mit dem Katalasetest13,14 testen. Legen Sie einen Tropfen von 3% Wasserstoffperoxid auf einen sauberen Glasträger. Pflücken Sie mit einem sterilen Zahnstocher die entsprechende Mikrobe von der Augenabstrichplatte. Keine Blasenbildung deutet auf Streptococcus spp.hin, leichte Blasenbildung deutet auf Corynebacterium spp. und vielleicht Aerococcus spp. hin und schnelle Blasenbildung deutet auf Staphylococcus spp. hin.
-
Identifikation: MALDI-TOF MS Analyse
HINWEIS: Die Identifizierung von Bakterien erfolgt über das MALDI-TOF und die Software-Datenbank. Dieses System verwendet matrixgestützte Laserdesorptionsionisationszeit-Flug-Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS) zur Entwicklung von Spektrenprofilen, die zur Identifizierung mit bekannten Bakterienspektren verglichen werden. E.coli, ATCC 8739, wird für die Systemkalibrierung verwendet.- Plattenbakterienisolate auf TSA-Platten mit 5% Schafsblut und inkubieren über Nacht mit 5% Kohlendioxid bei 37 °C.
- Tragen Sie mit einer 1 μL-Schleife eine dünne Schicht der reinen Bakterien auf den MALDI-TOF-Zielträger auf. 1 μL MALDI-TOF MS CHCA-Matrixlösung (alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure) wird überlagert und an der Luft trocknen gelassen, bevor der Objektträger in das MALDI-TOF-Instrument geladen wird.
- Jedes Isolat wird doppelt gesichtet.
- Berichte mit Wahrscheinlichkeitswerten von mehr als 80%, die auf einen hohen Diskriminierungswert hinweisen, werden als zuverlässige Ergebnisse akzeptiert und die bakterielle Identifizierung akzeptiert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repräsentative Ergebnisse für eine Augenabstrichplatte, die verschiedene Methoden zur Beschichtung demonstriert, sind in Abbildung 3A dargestellt, die morphologisch unterschiedliche Isolate von C57BL/6-Maus zeigt. Für jedes einzelne Isolat wurden die Kolonien im Streifen gezählt und die relative Häufigkeit, einzigartige Colony Forming Units (CFUs) pro Augenabstrich, berechnet und zu Vergleichszwecken aufgezeichnet. Für die mikrobiologische Charakterisierung wurden Bakterien aus einzelnen Mausaugenabstrichplatten ausgewählt, um eine Master-TSA-Platte zu erzeugen (erstellt durch die Auswahl morphologisch unterschiedlicher Isolate in dreifacher Ausfertigung aus jeder Mausaugenabstrichplatte). Von der Hauptplatte, am folgenden Tag oder wenn Wachstum auftritt, wurden zusätzliche Tests durchgeführt, um die Mikroben zu charakterisieren oder zu identifizieren. Die Masterplatte wurde verwendet, um genügend Inokum bereitzustellen, um die jeweiligen Isolate zu erweitern.
Die Arten wurden mit mikrobiologischen Techniken charakterisiert und dann durch MALDI-TOF MS-Analyse identifiziert. Jedes Isolat aus der Hauptplatte wurde durch Katalasetest13,14 getestet und auf selektiven Medien gezüchtet. Da die vorherrschenden Mikroben in unseren Studien Streptococcus spp., Staphylococcus spp. und Corneybacterium spp. sind, wurden Mannitol Salt Agar (MSA) und Mac Conkey Agar (MAC) als selektives Agar13verwendet. Wachstum auf Mannitol Salz Agar zeigt Staphylococcus spp13,16. Da MSA Phenolrot enthält, zeigt ein gelber Halo um die Kolonie die Mannitolfermentation und die Klassifizierung als Staphylococcus aureus an (bestätigen Sie mit alternativen Tests wie dem Coagulase-Test)13. Das Wachstum auf MacConkey-Agar weist auf gramnegative Bakterien hin, da Gallensalze und Kristallviolett in der Lage sind, die Bakterienmembran zu überschreiten und das grampositive Bakterienwachstum zu hemmen13. Wachsartiges Wachstum auf MSA zeigt die Produktion von Mykolsäure an und kann auf Organismen wie Corneybacterium spp13zurückzuführensein. Schließlich unterscheidet der Katalasetest Streptococcus spp. von Staphylococcus spp13,16, und in einigen Fällen kann ein schwach positiver Test auf Aerococcus spp15hinweisen .
Zur Identifizierung von Isolaten wurde eine TSA-Platte über Nacht in einer Umgebung mit 5% Kohlendioxid und 37 °C gestreift und inkubiert und MALDI-TOF MS durchgeführt. Abbildung 4 zeigt die Ergebnisse S. acidominimus (ein Mitglied von viridans Streptococcus spp. 17) und A. viridans. Oft Aerococcus spp. werden fälschlicherweise als die Viridangruppe der Streptokokken18,19, basierend auf biochemischen und phänotypischen Tests identifiziert. MALDI-TOF MS konnte die Isolate mit einem Konfidenzniveau von 99,9 ohne nicht identifizierbare Spezies identifizieren.
Geschlechtsspezifische Unterschiede können in Abbildung 5beobachtet werden, wo signifikant unterschiedliche Konzentrationen von kommensalen Organismen von männlichen und weiblichen C57BL/6-Mäusen gewonnen wurden. Die relative Häufigkeit für jedes Isolat wurde bestimmt. Streptococcus acidominimus, Aerococcus viridans und Coagulase negative Staphylococcus (ZNS) isolieren #1 und E. coli spp. wurden bei allen Mäusen gefunden, wobei die Männchen eine höhere relative Häufigkeit und größere Vielfalt zeigten.
Abbildung 1: Hauseigener Augenabstrich.
(A) Ein dünnes, etwa 1 cm langes Stück gezogener Baumwollschläger wurde zwischen dem sterilen Zahnstocherpunkt und dem Zeigefinger gehalten und der Zahnstocher wurde unter leichtem Druck auf den Zeigefinger gerollt, bis die Baumwolle vollständig auf die Zahnstocherspitze gerollt war. (B) Beispiel eines Augenabstrichs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Platzierung des Bindehautaugenabstrichs der Maus.
(A) Die BHI-Tupferspitze für nasse Augen wurde in einem Winkel von 90° in den medialen Winkel des linken Auges einer betäubten Maus eingeführt, wodurch der Augapfel gedrückt wurde. (B) Der Tupfer wurde entlang der Bindehaut bewegt, während der leichte Druck auf das Auge in einer Hin- und Herbewegung 10 Mal aufrechterhalten wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse für den Augenabstrich und die Hauptplatten.
(A) 10 μL Augenabstrich geimpft angereichertes Medium wurde auf der rechten Seite der Blutagarplatte aliquotiert und um 30 bis 60 Grad geneigt, damit das Medium Streifen bilden konnte, und auf der linken Seite der Platte wurden zehn 10 μL Punkte der Probe abgegeben. Das Foto der inkubierten Platte zeigt einzelne Kolonien und morphologische Vielfalt. (B) Eine Masterplatte von Isolaten wurde erstellt, indem eine Kolonie aus der Augenabstrichplatte gepflückt und innerhalb eines der Quadrate (Gitter) gestreift wurde. Drei morphologisch ähnliche Kolonien sind in getrennten Gittern gestreift. Jedes Gitter hat drei Streifen derselben Kolonie, die von der Mausaugenabstrichplatte gepflückt wurde. Nachdem das Wachstum auf den Platten erschien, wurde das Isolat durch selektive Beschichtung und Katalasetests charakterisiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Beispiel für MALDI-TOF MS-Ergebnisse.
Jedes Isolat wurde über Nacht auf TSA kultiviert, auf maldi-TOF MS-Dia aufgetragen und mit MALDI-TOF MS-Lösung überlagert, luftgetrocknet und doppelt gefleckt. Die Ergebnisse für Streptococcus acidominimus (A) und Aerococcus viridans (B) wurden mit einem Konfidenzwert von 99,9 positiv identifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Geschlechtsspezifisches kommusales Bindehautwachstum.
Altersangepasste C57BL6/N-Mäuse wurden für relative kommensale Diversität verglichen. Augen wurden abgetupfte und kommensale Organismen identifiziert. Die vorherrschende Art war Streptococcus acidominimus, die bei männlichen Mäusen signifikant häufiger vor vorrätig war als bei weiblichen (2-Wege-ANOVA, s<0,0001). Es wurden 5 verschiedene ZNS-Isolate identifiziert, Aerococcus viridans und E.coli. Während einige der ZNS-Isolate nicht bei allen Mäusen vorhanden waren, wurden Streptococcus acidominimus, Aerococcus viridans, ZNS-Isolat 1 und E. coli bei allen Mäusen mit unterschiedlichen Häufigkeiten gefunden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aufgrund des paucibakteriellen Zustands der Augenoberfläche hatten viele Labore Schwierigkeiten, die okulären Kommensalen7,20zuisolieren, was zu einer geringen Anzahl von Proben mit Wachstum, geringer Häufigkeit und geringer Diversitätführte 8. Diese Methode verbessert die Standardkulturpraktiken4,21 erheblich durch die Hinzufügung eines Anreicherungsschritts sowie eines neu gestalteten Augenabstrichs und der Identifizierung durch MALDI-TOF MS. Der Anreicherungsschritt adressiert eine geringe Verwertbarkeit durch Verstärkung der Bakterienlast. Der signifikante Anstieg der rückgewinnbaren Bakterien von weniger als 100 CFUs auf die relative Häufigkeit von 2.500 CFUs pro Augenabstrich für männliche Wildtyp-Mäuse deutet darauf hin, dass die Inkubation in nährstoffreichen Medienlebensfähige,aber nicht kultivierbare Bakterienwiederbelebt 22,23, wodurch die Erholung ruhender Mikroben ermöglicht wird. Jüngste kulturbasierte Anreicherungsschritte wurden in mikrobiota-molekulare Sequenzierungsstudien integriert, um die Unterscheidung zwischen Wirts- und mikrobiellen Expressionssignaturen24,25,26zu ermöglichen und seltene Gattungen zu amplifizieren. Unser Protokollanreicherungsschritt ist der erste, der auf okuläre Mikrobiomstudien angewendet wird und die Anreicherung nutzt, um lebende Mikroben auszuwählen, die Anzahl der rückgewinnbaren knappen Isolate zu erweitern und möglicherweise lebensfähige, aber nicht kultivierbare Kommensalen wiederzubeleben. Darüber hinaus ermöglicht unser hauseigener Augenabstrich ein gezieltes Abtupfen der Bindehaut und reduziert die Kontamination durch umgebende Haut / Fell aufgrund seiner geringen Größe und dünnen spitzen konischen Form. Die Wahl der Tupferschichtdicke und des Materials ist wichtig21. Dieser im Labor hergestellte Augenabstrich ist mit einer dünnen Schicht ungiftiger Baumwollschläge beschichtet, die ein Abtupfern von kommenalem Einklemmen im Tupfermaterial verhindert und Calciumalginat-Augenabstrichen vorzuziehen ist, die zytoxisch sein können27. Längsschnitttests zeigen, dass unsere Methode reproduzierbar ist; mit den dominanten Bakterien, die aus Augenabstrichen gewonnen wurden, einschließlich Streptococcus spp., Coagulase Negative Staphylococcus (ZNS) und Corynebacterium spp. Diese Ergebnisse stimmen mit veröffentlichten Ergebnissen für die dominanten fakultativen anaeroben Augengattungen7,9,20 überein,die mit kulturbasierten oder bildgebenden Methoden nachgewiesen wurden. Diese Methode hat ein breiteres Spektrum von Isolaten in der Bindehaut gefunden, einschließlich Escherichia coli und Pseudomonas spp. Darüber hinaus ermöglicht die Identifizierung durch MALDI-TOF MS eine bessere Unterscheidung zwischen Gattungen und Arten, wie der Viridans-Gruppe der Streptokokken und Aerococci spp. 19,28.
Drei Schritte sind entscheidend für die Maximierung des Ergebnisses: Herstellung von Augenabstrichen, Augenabstrichtechnik und einzigartige Isolatauswahl aus der Augenabstrichplatte. Wie bereits erwähnt, ist eine sehr dünne flache Baumwollschicht wichtig für die anfängliche Erfassung von Kommensalen von der Augenoberfläche sowie für deren anschließende Freisetzung in das Anreicherungsmedium. Dicke oder klumpige Tupfer können zur Auswahl von Verunreinigungen führen und Isolate in der Tupferspitze zurückhalten. Zweitens ist eine kontinuierliche Vertiefung des Augapfels während des Abwischens notwendig, um die Kontamination durch umliegende Oberflächen zu minimieren. Die ideale Tupftechnik beinhaltet ein normales (90 Grad) Einführen des Tupfers in das mediale untere Bindehautfornix und einen gleichmäßigen Tupferdruck in Verbindung mit einer langsamen kontinuierlichen Bewegung. Schließlich muss die Augenabstrichplatte täglich überwacht werden, um nach neu auftretenden Isolaten oder solchen, die mit einer anderen Geschwindigkeit wachsen, auszuwählen, um das repräsentative Mikrobiom vollständig zu erfassen.
Es gibt einige Protokolleinschränkungen, die mit einem klaren Verständnis der Ergebnisse oder Änderungen des Protokolls behoben werden können. Die Ergebnisse sind ein Maß für die relative lebensfähige kommensale Häufigkeit und nicht die tatsächliche konjunktivale Bakterienbelastung mit dem Ziel, die okuläre Kommensalgemeinschaft zu definieren. Die relative Häufigkeit und Diversität wurde in unseren Studien zu Vergleichszwecken bei bakterieller Keratitis sowie zur Untersuchung der angeborenen Immunantwort bei Knock-out- und Wildtyp-Mäusen verwendet12. Darüber hinaus hängt die Identifizierung durch MALDI-TOF MS von einer umfangreichen Datenbank28ab, die ein Ergebnis von "no ID" für unbekannte Isolatspektrenprofile liefert, was die Bedeutung der Verwendung einer aktuellen Datenbank unterstreicht. Schließlich erkennt dieses Protokoll nur aerobe und fakultative anaerobe Bakterien, aber sein Rahmen ist anpassungsfähig und kann darauf aufgebaut werden, um den mikrobiellen okulären Raum durch Modifikation von Anreicherungsmedien, Plattenwachstumsbedingungen und Selektionsmedium zu definieren. Durch Änderung der Hauptplatte und der Anreicherungswachstumsbedingungen auf anaerobe, dannkann ein anderer häufig isolierter okulärer Kommensal, Propionibacterium spp. oder andere Anaerobier nachgewiesen werden; obwohl wir in unseren Händen fast kein anaerobes Wachstum sahen.
Vielleicht kann dieses Framework in Verbindung mit tiefen DNA-Sequenzierungstechniken verwendet werden. Eine große Hürde bei der Mikrobenidentifizierung mittels DNA-Sequenzierung ist die Unfähigkeit, die Lebensfähigkeit zu beurteilen10. Dieses Protokoll kann eine orthogonale Methode bereitstellen, indem es Anreicherungsmedien und Beschichtungsbedingungen so modifizieren, dass sie den bevorzugten Wachstumskriterien eines Kandidatenisolats (identifiziert durch DNA-Sequenzierung) entsprechen. Dies kann zu einem wertvollen kulturbasierten Ansatz führen, um Kommensalen von lebensfähigen, aber nicht umsetzbaren Bakterien oder vorhandenen, aber wenig vorhandenen Arten zu fangen.
Die Definition der lebensfähigen okulären Kommensalgemeinschaft ist für die Untersuchung des okulären kommensalen Ausdrucksprofils unerlässlich. Breite Forschung legt nahe, dass kurzkettige Fettsäuren und mikrobielle Produkte die okuläre Immunantwort3,29,30,31,32,33modulieren und dass ihre Wirkung lokal auftritt. Dies deutet darauf hin, dass nicht nur die distale Produktion, sondern auch die lokale Produktion dieser Faktoren wichtig ist. Auch Krankheitszustände wie trockenes Auge und Diabetes verändern das Mikrobiom der Augenoberfläche4,6,33,34. Dies unterstreicht die Notwendigkeit einer Methode, die DNA-basierte Sequenzierung sowie kulturbasierte Ansätze verbindet, damit das lebensfähige okuläre Mikrobiom in Gesundheit und Krankheit besser definiert werden kann.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Kein Interessenkonflikt offenzulegen.
Acknowledgments
Die Finanzierung von P30 DK034854 unterstützte VY, LB und Studien im Massachusetts Host-Microbiome Center und die Finanzierung von NIH / NEI R01 EY022054 unterstützte MG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 to 10 µl pipet tip | USA Scientific | 1110-300 | autoclave before use |
| 0.5 to 10 µl Eppendorf pipet | Fisher Scientific | 13-690-026 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | BD309623 | 1 syringe for each eye swab group |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | autoclave before use |
| 1000 µ ml pipet tip | USA Scientific | 1111-2021 | autoclave before use |
| 200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000) | Fisher Scientific | F123602G | |
| 25 G needle | Fisher Scientific | 14-826AA | 1 needle per eye swab group |
| 3 % Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | S25359 | |
| 37 ° C Incubator | Lab equipment | ||
| 70 % Isopropanol | Fisher Scientific | PX1840-4 | |
| Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml) | Santa Cruz Animal Health | SC-362949Rx | |
| BD BBL Gram Stain kit | Fisher Scientific | B12539 | |
| Bunsen Burner | Lab equipment | ||
| Clean paper towels | Lab equipment | ||
| Cotton Batting/Sterile rolled cotton | CVS | ||
| Disposable 1 ml Pipets | Fisher Scientific | 13-711-9AM | for Gram stain and catalase tests |
| E.coli | ATTC | ATCC 8739 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for Gram stain and catalase tests |
| Ketamine (100mg/ml) | Henry Schein | 9950001 | |
| Mac Conkey Agar Plates | Fisher Scientific | 4321270 | store at 4 °C until ready to use |
| Mannitol Salt Agar | Carolina Biological Supply | 784641 | Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week |
| Mice | Jackson Labs | C57/BL6J | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | for Mannitol Salt agar plates |
| RPI Brain Heart Infusion Media | Fisher Scientific | 50-488525 | prepare according to directions and autoclave |
| SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone) | EMD/Millipore, Fisher Scientifc | SCGP00525 | to sterilize anesthesia |
| Sterile Corning Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 430829 | anesthesia preparation |
| Sterile mouse cage | Lab equipment | ||
| Tooth picks (round bamboo) | Kitchen Essentials | autoclave before use and swab preparation | |
| Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates | Fisher Scientific | 4321261 | store at 4 °C until ready to use |
| Vitek target slide | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS CHCA matrix solution | BioMerieux Inc. Durham, NC | 411071 | |
| Single use eye drops | CVS Pharmacy | Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each |
References
- Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T cell generation. Nature. 504 (7480), 451-455 (2013).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2010).
- Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).
- Graham, J. E., et al. Ocular pathogen or commensal: a PCR based study of surface bacterial flora in normal and dry eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (12), 5616-5623 (2007).
- Wang, C., et al. Sjögren-Like Lacrimal Keratoconjunctivitis in Germ-Free Mice. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 565-584 (2018).
- Ham, B., Hwang, H. B., Jung, S. H., Chang, S., Kang, K. D., Kwon, M. J. Distribution and diversity of ocular microbial communities in diabetic patients compared with healthy subjects. Current Eye Research. 43 (3), 314-324 (2018).
- Doan, T., et al. Paucibacterial microbiome and resident DNA virome of the healthy conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (13), 5116-5126 (2016).
- Kugadas, A., Gadjeva, M. Impact of microbiome on ocular health. Ocular Surface. 14 (3), 342-349 (2016).
- Dong, Q., et al. Diversity of bacteria at healthy human conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 5408-5413 (2011).
- Zegans, M. E., Van Gelder, R. N. Considerations in understanding the ocular surface microbiome. American Journal of Opthalmology. 158 (3), 420-422 (2014).
- Fleiszig, S. M., Efron, N. Microbial flora in eyes of current and former contact lens wearers. Journal of Clinical Microbiology. 30 (5), 1156-1161 (1992).
- Lu, X., et al. Neutrophil L-Plastin Controls Ocular Paucibacteriality and Susceptibility to Keratitis. Frontiers in Immunology. 11, 547 (2020).
- Johnson, T. R., Case, C. L. Laboratory Experiments in Microbiology. , Pearson Benjamin Cummings Pubs. San Francisco, CA. (2010).
- Reiner, K. Catalase Test Protocol. American Society for Microbiology. , (2010).
- UK SMI. Standards for Microbiology Investigation. UK SMI. , Gov.UK. (2014).
- Sharp, S. E., Searcy, C. Comparison of mannitol salt agar and blood agar plates for identification and susceptibility testing of Staphylococcus aureus in specimens from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 44 (12), 4545-4546 (2006).
- Siegman-Igra, Y., Azmon, Y., Schwartz, D. Milleri group streptococcus--a stepchild in the viridans family. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 31 (9), 2453-2459 (2012).
- Mohan, B., Zaman, K., Anand, N., Taneja, N. Aerococcus Viridans: A Rare Pathogen Causing Urinary Tract Infection. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 11 (1), 1-3 (2017).
- Senneby, E., Nilson, B., Petersson, A. C., Rasmussen, M. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry is a sensitive and specific method for identification of aerococci. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1303-1304 (2013).
- Wan, S. J., et al. IL-1R and MyD88 contribute to the absence of a bacterial microbiome on the healthy murine cornea. Frontiers in Microbiology. 9, 1117 (2018).
- Ozkan, J., et al. Temporal Stability and Composition of the Ocular Surface Microbiome. Scientific Reports. 7 (1), 9880 (2017).
- Oliver, J. M. The viable but non-culturable state in bacteria. Journal of Microbiology. 43 (1), 93-100 (2005).
- Epstein, S. S. The phenomenon of microbial uncultivability. Current Opinion in Microbiology. 16 (5), 636-642 (2013).
- Whelan, F. J., et al. Culture-enriched metagenomic sequencing enables in-depth profiling of the cystic fibrosis lung microbiota. Nature Microbiology. 5 (2), 379-390 (2020).
- Raymond, F., et al. Culture-enriched human gut microbiomes reveal core and accessory resistance genes. Microbiome. 7, 56 (2019).
- Peto, L., et al. Selective culture enrichment and sequencing of feces to enhance detection of antimicrobial resistance genes in third-generation cephalosporin resistant Enterobacteriaceae. PLoS One. 14 (11), 0222831 (2019).
- Lauer, B. A., Masters, H. B. Toxic effect of calcium alginate swabs on Neisseria gonorrhoeae. Journal of Clinical Microbiology. 26 (1), 54-56 (1988).
- Dubois, D., et al. Performances of the Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for rapid identification of bacteria in routine clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 50 (8), 2568-2576 (2012).
- Kawakita, T., et al. double-blind study of the safety and Efficacy of 1%D-3-Hydroxybutyrate eye drops for Dry Eye Disease. Scientific Reports. 6, 20855 (2016).
- Lee, H. S., Hattori, T., Stevenson, W., Cahuhan, S. K., Dana, R. Expression of toll-like receptor 4 contributes to corneal inflammation in experimental dry eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (9), 5632-5640 (2012).
- Simmons, K. T., Xiao, Y., Pflugfelder, S. C., de Paiva, C. S. Inflammatory response to lipopolysaccharide on the ocular surface in a murine dry eye model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (6), 2444-2450 (2016).
- Miller, D., Ioviano, A. The role of microbial flora on the ocular surface. Current Opinion in Allergy and Immunology. 9 (5), 466-470 (2009).
- Nayyar, A., Gindina, S., Barron, A., Hu, Y., Danias, J. Do epigenetic changes caused by commensal microbiota contribute to development of ocular disease? A review of evidence. Human Genomics. 14 (1), 11 (2020).
- Stevenson, W., et al. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).
