Summary
Se realizó la tinción inmunohistoquímica y la secuenciación del gen arn ribosómico 16S (gen 16S rRNA) con el fin de descubrir y distinguir bacterias en tejidos ováricos cancerosos y no cancerosos in situ. Las diferencias composicionales y funcionales de las bacterias se predijeron mediante el uso de BugBase y Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unbserved States (PICRUSt).
Abstract
La teoría de un tracto reproductivo superior femenino "estéril" ha estado encontrando una creciente oposición debido a los avances en la detección bacteriana. Sin embargo, aún no se ha confirmado si los ovarios contienen bacterias. Aquí, se introdujo un experimento para detectar bacterias en los tejidos ováricos. Elegimos pacientes con cáncer de ovario en el grupo de cáncer y pacientes no cancerosas en el grupo de control. La secuenciación del gen 16S rRNA se utilizó para diferenciar las bacterias en los tejidos ováricos de los grupos de cáncer y control. Además, predijimos la composición funcional de las bacterias identificadas mediante el uso de BugBase y PICRUSt. Este método también se puede utilizar en otras vísceras y tejidos, ya que se ha demostrado que muchos órganos albergan bacterias en los últimos años. La presencia de bacterias en las vísceras y los tejidos puede ayudar a los científicos a evaluar los tejidos cancerosos y normales y puede ser de ayuda en el tratamiento del cáncer.
Introduction
Recientemente, se ha publicado un número creciente de artículos que prueban la existencia de bacterias en las vísceras sólidas abdominales, como el riñón, el bazo, el hígado y el ovario1,2. Geller et al. encontraron bacterias en tumores pancreáticos, y estas bacterias eran resistentes a la gemcitabina, un fármaco quimioterapéutico2. S. Manfredo Vieira et al. concluyeron que Enterococcus gallinarum era portátil a los ganglios linfáticos, hígado y bazo, y podía conducir a la autoinmunidad3.
Dado que el cuello uterino desempeña un papel como defensor, las bacterias en el tracto reproductivo femenino superior, que contiene el útero, las trompas de Falopio y los ovarios, se han investigado mínimamente. Sin embargo, algunas nuevas teorías se han establecido en los últimos años. Las bacterias pueden tener acceso a la cavidad uterina durante el ciclo menstrual debido a cambios en las mucinas4,5. Además, Zervomanolakis et al. confirmaron que el útero, junto con las trompas de Falopio, es una bomba peristáltica controlada por el sistema endocrino de los ovarios, y esta disposición permite que las bacterias ingresen al endometrio, las trompas de Falopio y los ovarios6.
El tracto reproductivo superior ya no es un misterio gracias al desarrollo de métodos de detección bacteriana. Verstraelen et al. utilizaron un método de secuenciación de extremo pareado con código de barras para descubrir bacterias uterinas dirigiéndose a la región hipervariable V1-2 del gen 16SRNA 7. Fang et al. emplearon la secuenciación con código de barras en pacientes con pólipos endometriales y revelaron la presencia de diversas bacterias intrauterinas8. Además, mediante el uso del gen arn 16S, Miles et al. y Chen et al. encontraron bacterias en el sistema genital de mujeres que se habían sometido a salpingoooforectomía e histerectomía, respectivamente5,9.
Las bacterias en los tejidos tumorales han ganado cada vez más atención en los últimos años. Banerjee et al. descubrieron que la firma del microbioma difería entre las pacientes con cáncer de ovario y los controles10. Unnoxynatronum sibiricum se asoció con el estadio tumoral, y Methanosarcina vacuolata podría usarse para diagnosticar el cáncer de ovario11. Además del cáncer de ovario, se ha demostrado que otros cánceres, como el de estómago, pulmón, próstata, mama, cuello uterino y endometrio, están asociados con las bacterias12,13,14,15,16,17,18. Poore et al. propusieron una nueva clase de diagnósticos oncológicos basados en microbios, previendo el cribado del cáncer en etapa temprana19. En este protocolo, investigamos las diferencias entre los tejidos ováricos cancerosos y normales comparando la composición y función de las bacterias en estos dos tejidos.
Se realizó tinción inmunohistoquímica y secuenciación del gen 16S rRNA para confirmar la presencia de bacterias en los ovarios. Se estudiaron las diferencias y las funciones predichas de las bacterias ováricas en los tejidos ováricos cancerosos y no cancerosos. Los resultados mostraron la existencia de bacterias en los tejidos ováricos. Anoxynatronum sibiricum y Methanosarcina vacuolata se relacionaron con el estadio y el diagnóstico de cáncer de ovario, respectivamente. Se compararon cuarenta y seis vías kegg significativamente diferentes que estaban presentes en ambos grupos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Institucional Médica del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Xi'an Jiaotong (No. XJTUIAF2018LSK-139). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes inscritos.
1. Criterios para ingresar al grupo de cáncer y al grupo de control
- Para el grupo de cáncer, inscriba a pacientes que son diagnosticadas principalmente con cáncer de ovario, y después de la laparotomía, se demuestra que tienen cáncer de ovario seroso por hallazgos patológicos.
- Para el grupo de control, inscriba a pacientes que son diagnosticadas principalmente con mioma uterino o adenomiosis uterina, sin presentar ninguna afección ovárica, y que se han sometido a histerectomía y salpingooforectomía.
NOTA: Esta norma no es definitiva. Las pacientes con enfermedades que no afectan los ovarios que se someten a histerectomía y salpingooforectomía también pueden inscribirse. - Excluir a los pacientes con uno o más de los siguientes criterios:
Mujeres embarazadas o en lactancia.
Tomar antibióticos 2 meses antes de la cirugía.
Tener fiebre o marcadores inflamatorios elevados.
Tener inflamación de cualquier tipo.
Haber sido sometido a quimioterapia neoadyuvante.
2. Recoger muestras
- Durante la cirugía, coloque los ovarios resecados en un tubo estéril y coloque el tubo en nitrógeno líquido para su transporte. Evite tocar cualquier otra cosa durante todo el procedimiento.
- Separe los ovarios en muestras de tejido de aproximadamente 1 cm de grosor con un par de nuevas pinzas estériles debajo de un gabinete de flujo laminar. Después de la separación, conservar las muestras a -80 °C.
NOTA: Todos los procedimientos para la recolección de muestras son asépticos, incluida la separación de los ovarios.
3. Secuenciar el gen 16S rRNA
- Extraer ADN.
- Agregue 1.2 ml de tampón ex inhibido en un tubo centrífugo de 2 ml. Luego, agregue 180-220 mg de muestras en el tubo. Deje que la muestra se mezcle completamente (baño de agua a 70 °C durante 5 min y luego vórtice durante 15 s).
- Centrifugar el tubo durante 1 min a 600 x g.
- Coloque 550 μL del sobrenadante en un nuevo tubo de 1,5 ml y centrífuga durante 1 min a 600 x g.
- Transfiera 400 μL del sobrenadante con 30 μL de proteinasa K a otro tubo de 1,5 ml.
- Agregue 400 μL de al tampón y use un mezclador de vórtice durante 15 s.
- Incubar a 70 °C durante 10 min.
- Añadir 400 μL de 96-100% de alcohol. Use un mezclador de vórtice durante 15 s.
- Transfiera 600 μL de mezcla a una columna de absorción y centrífuga durante 1 min a 13700 g. Cambie el tubo inferior. Repita este paso 11 veces.
- Añadir 500 μL de tampón AW1, centrifugar durante 1 min a 13.700 x g, y cambiar el tubo inferior.
- Añadir 500 μL de tampón AW2, centrifugar durante 3 min a 13.700 x g, y cambiar el tubo inferior.
- Centrífuga durante 3 min a 13.700 x g.
- Transfiera la mezcla a un nuevo tubo de 1,5 ml, agregue 200 μL de ATE tampón, incube a temperatura ambiente durante 5 min y centrífuga durante 1 min a 13.700 x g.
- Pruebas de calidad. Use electroforesis en gel de sefarosa al 1% para probar la calidad. Añadir 400 ng de muestra, 120 V, 30 mins. Resultado ideal: Concentración de ADN: ≥ 10 ng/μL, pureza de ADN: A260/A280 = 1.8-2.0, ADN bruto: ≥ 300 ng.
- Preparar las librerías utilizando un kit de secuenciación metagenómica 16S según el protocolo del fabricante.
- Realizar PCR. Brevemente, cada reacción de PCR de 25 μL contiene 12,5 ng de ADN de muestra como entrada, 12,5 μL de 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix y 5 μL de cada imprimación a 1 μM.
- Realizar PCR utilizando el siguiente protocolo: una etapa inicial de desnaturalización realizada a 95°C durante 3 min seguida de 25 ciclos de desnaturalización (95°C, 30 s), recocido (55°C, 30 s) y extensión (72°C, 30 s), y un alargamiento final de 5 min a 72°C.
- Limpie el producto de PCR de la mezcla de reacción con perlas magnéticas utilizando las instrucciones del fabricante.
- Repita los pasos 3.3.1 y 3.3.2.
- Pruebas de calidad. Consulte el paso 3.2.
- Repita el paso 3.3.3.
- Pruebas de calidad. Use electroforesis en gel de sefarosa al 1% para probar la impureza, un espectrofotómetro para probar la pureza, un fluorómetro para probar la concentración y un kit de ensayo de ARN para probar la integridad. Siga el protocolo del fabricante. Normalizar y agrupar las bibliotecas; luego secuencia (configuración de lectura de extremo pareado de 2 x 300 pb) utilizando celdas de flujo estándar V3 de ciclo de 600, produciendo aproximadamente 100,000 lecturas de base de extremo pareado 2 x 300.
NOTA: Las secuencias de imprimación de longitud completa: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de amplicón 16S: 5' TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGA GACAG-[CCTACGGGNGGCWGCAG] y 16S Amplicon PCR Reverse primer: 5' GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GACTACHVGGGTATCTAATCC].
4. Analizar los datos de secuenciación del gen 16S rRNA
- Filtre las lecturas en bruto de cada muestra en función de la calidad de secuenciación con el paquete de software QIIME 2-20180220.
- Copie tres archivos en el directorio: emp-paired-end-sequences_01
un archivo forward.fastq.gz que contiene las lecturas de la secuencia de avance,
un archivo reverse.fastq.gz que contiene la secuencia inversa lee,
Un archivo Barcodes.fastq.gz que contiene el código de barras asociado lee - Ejecutar
importación de herramientas qiime \
--escriba EMPPairedEndSequences \
--input-path emp-paired-end-sequences_01 \--output-path emp-paired-end-sequences_02.qza
- Copie tres archivos en el directorio: emp-paired-end-sequences_01
- Retire las secuencias de imprimación y adaptador.
qiime cutadapt recortado pareado \
--i-demultiplexed-sequences demultiplexed-seqs_02.qza \
--p-front-f GCTACGGGGGG \
--p-front-r GCTACGGGGGG \
--p-tasa de error 0 \
--quality-cutoff 25 \
--o-trimmed-sequences trimmed-seqs_03.qza \
--detallado - Lecturas de secuencia acortadas en las que ambas cualidades de extremo pareado son inferiores a 25. Ver arriba --quality-cutoff 25
- Analice los datos de secuenciación.
- Reúna secuencias para formar unidades taxonómicas operativas (OTU) con un límite de similitud del 97%.
qiime vsearch dereplicate-sequences \
--i-sequences trimmed-seqs_03.qza \
--o-dereplicated-table table_04.qza \
--o-dereplicated-sequences rep-seqs_04.qza
qiime vsearch cluster-features-closed-reference \
--i-table table_04.qza \
--i-sequences rep-seqs_04.qza \
--i-reference-sequences 97_otus.qza \
--p-perc-identity 0,97 \
--o-clustered-table table-cr-97.qza \
--o-clustered-sequences rep-seqs-cr-97.qza \
--o-unmatched-sequences unmatched-cr-97.qza - Para las OTU, calcule la abundancia relativa en cada muestra. La información sobre la abundancia se encuentra en la tabla-cr-97.qza
- Reúna secuencias para formar unidades taxonómicas operativas (OTU) con un límite de similitud del 97%.
- Emplee un clasificador bayesiano nativo, que apunta al conjunto de entrenamiento RDP (versión 9; http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/), para ordenar todas las secuencias. La información del taxón mapeado se encuentra en la tabla-cr-97.qza
- Dentro de la OTU dada, asigne una clasificación que refleje la mayor coherencia de las secuencias a las OTU. Luego, alinee las OTU. Ver table-cr-97.qza y rep-seqs-cr-97.qza
- Sobre la base de la información del grupo de muestra, realice la diversidad alfa (incluidos los índices Chao 1, ACE, Shannon, Simpson y Evenness) y el análisis de coordenadas principales (PCoA) basado en UniFrac.
exportación de herramientas qiime \
--input-path table-cr-97.qza \
--output-path exported-feature-table
exportado-característica-tabla
qiime diversidad alfa \
--i-table table-cr-97.qza \
--p-métrica observed_otus \
--o-alfa-diversidad observed_otus_vector.qza
qiime diversidad beta \
--i-table table-cr-97.qza \
--p-métrica braycurtis \
--o-distance-matrix unweighted_unifrac_distance_matrix.qza
5. Predecir la función bacteriana
- Para predecir la representación relacionada de las características de la bacteria, utilice BugBase21. La tabla OTU de entrada para BugBase se prepara mediante los siguientes comandos.
biom convert -i otu_table.biom -o otu_table.txt --to-tsv
biom convert -i otu_table.txt -o otu_table_json.biom --table-type="OTU table" --to-json
NOTA: La predicción se basa en seis categorías de fenotipos (Ward et al. no publicados) (https://bugbase.cs.umn.edu/): tinción de Gram, tolerancia al oxígeno, capacidad para formar biopelículas, contenido de elementos móviles, patogenicidad y tolerancia al estrés oxidativo. - Predecir la composición funcional de un metagenoma por PICRUSt con el uso de datos de genes marcadores y una base de datos que contiene genomas de referencia22.
make_otu_table.py -i microbiome_97/uclust_ref_picked_otus/test_paired_otus.txt -t /mnt/nas_bioinfo/ref/qiime2_ref/97_otu_taxonomy.txt -o otu_table.biom &
normalize_by_copy_number.py -i otu_table.biom -o normalized_otus.biom
predict_metagenomes.py -i normalized_otus.biom -o metagenome_predictions.biom
categorize_by_function.py -i metagenome_predictions.biom -c "KEGG_Pathways" -l 1 -o picrust_L1.biom
categorize_by_function.py -f -i metagenome_predictions.biom -c KEGG_Pathways -l 1 -o metagenome_predictions. L1.txt - Analizar las diferencias de funciones entre cada grupo con la ayuda de STAMP23,24. Consulte las citas para operar el software.
6. Datos
- Utilice software estadístico para calcular la significación de los hallazgos. La indicación de significación estadística debe establecerse como P < 0,05.
- Evalúe las diferencias en edad y paridad por la prueba t de Student. Evaluar las diferencias en el estado menopáusica, los antecedentes de hipertensión y la diabetes mediante la prueba de chi cuadrado. Evaluar las diferencias en el número de taxones bacterianos ováricos mediante la prueba U de Mann-Whitney.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pacientes
Un total de 16 pacientes calificados fueron incluidos en el estudio. El grupo de control incluyó a 10 mujeres con un diagnóstico de tumor uterino benigno (entre ellas, 3 pacientes fueron diagnosticadas con mioma uterino y 7 pacientes fueron diagnosticadas con adenomiosis uterina). Mientras tanto, el grupo de cáncer contenía 6 mujeres con un diagnóstico de cáncer de ovario seroso (entre ellas, 2 pacientes fueron diagnosticadas con estadio II, y 2 de ellas fueron diagnosticadas con estadio III). Las siguientes características no mostraron diferencias entre los pacientes en el grupo de control y el grupo de cáncer: edad, estado menopáusico, paridad, antecedentes de hipertensión y antecedentes de diabetes(Tabla 1).
Tabla 1: Estadísticas de pacientes Haga clic aquí para descargar esta Tabla.
La riqueza y variedad de especies bacterianas ováricas en ambos grupos
La presencia de bacterias mediante tinción inmunohistoquímica se mostró en la Figura 1. La diversidad alfa de los microbios se analizó como método para detectar la riqueza y variedad de especies bacterianas ováricas. El número de especies observadas en los tejidos de cáncer de ovario fue menor que el del grupo control, sin diferencias significativas. La riqueza (representada por el índice Chao 1 y ACE) y la diversidad (representada por el índice de Shannon, Simpson y Evenness) de las especies bacterianas no fueron significativamente diferentes entre el grupo de cáncer y el grupo de control(Figura 2).
Figura 2:La secuenciación del gen 16S rRNA muestra diferencias entre los grupos de cáncer y control en la riqueza y diversidad bacteriana. (A) Índice de especies observadas (P = 0,06, prueba U de Mann-Whitney); (B) Índice de Chao 1 (P = 0,06, prueba U de Mann-Whitney); (C) Índice ACE (P = 0.06, prueba U de Mann-Whitney); (D) Índice de Shannon (P = 0,32, prueba U de Mann-Whitney; E. Índice de evenidad (P = 0,48, prueba U de Mann-Whitney); (F) Índice de Simpson (P = 0,46, prueba U de Mann-Whitney). Obtuvimos el permiso de reimpresión de editores anteriores. Esta cifra ha sido modificada a partir de Wang et al.11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Descripción de las bacterias ováricas
La secuenciación profunda de la región del gen V3-V4 16S rRNA se realizó en todas las muestras para obtener una mejor comprensión de las bacterias ováricas. Los resultados mostraron que Proteobacteria fue el filo más abundante (67,10% en el grupo control y 67,20% en el grupo cáncer), Firmicutes fue el segundo filo más abundante (23,77% en el grupo control y 23,82% en el grupo cáncer), y el tercer filo más abundante fue Bacteroidetes (3,26% en el grupo control y 3,41% en el grupo cáncer). Al analizar las especies del grupo control, la composición principal estuvo constituida por Halobacteroides halobios (14,53%), seguido de Gemmata obscuriglobus (11,07%) y Methyloprofundus sedimenti (10,69%). Para el grupo de cáncer, Gemmata obscuriglobus fue el más rico del grupo (13,89%), seguido de Halobacteroides halobius (11,99%) y Methyloprofundus sedimenti (11,12%)(Figura 3).
Figura 3: Abundancia relativa de filos (> 1%) y de las 12 especies principales en muestras ováricas. (A) La abundancia relativa del filo (> 1%) en los ovarios de las pacientes del grupo control. (B) La abundancia relativa del filo (> 1%) en los ovarios de pacientes con cáncer de ovario. (C) Las abundancias relativas de las 12 especies bacterianas más abundantes en los ovarios de las pacientes control. (D) Las abundancias relativas de las 12 especies bacterianas más abundantes en los ovarios de pacientes con cáncer de ovario. Obtuvimos el permiso de reimpresión de editores anteriores. Esta cifra ha sido modificada a partir de Wang et al.11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Diferentes composiciones de bacterias ováricas entre los dos grupos
PCoA realizó una comparación de diferentes comunidades bacterianas utilizando PERMANOVA. Los resultados mostraron que las bacterias en el grupo de control diferían de las del grupo de cáncer, P < 0,05 (Figura 4).
Figura 4: PCoA detecta grupos de comunidades y las abundancias relativas de Anoxynatronum sibiricum y Methanosarcina vacuolata. (A) Las comunidades se agruparon utilizando PCoA. PC1 y PC2 se trazan en los ejes x e y. El bloque rojo indica una muestra en el grupo de cáncer de ovario. El círculo azul indica una muestra en el grupo de control. Las muestras del grupo de cáncer de ovario se separaron de otras muestras del grupo de control. B) Comunidades agrupadas utilizando PCoA. PC1 y PC2 se trazan en los ejes x e y. El bloque rojo indica una muestra en el grupo de cáncer de ovario. El círculo sólido azul indica una muestra de una paciente con mioma uterino, y el círculo hueco azul es igual a una muestra de una paciente con adenomiosis uterina. (C) La abundancia relativa de Anoxynatronum sibiricum (grupo control: n = 10, grupo de cáncer: n = 6, P = 0,034, prueba U de Mann-Whitney). (D) La abundancia relativa de Methanosarcina vacuolata (grupo control: n = 10, grupo de cáncer: n = 6, P = 0,001, prueba U de Mann-Whitney). Obtuvimos el permiso de reimpresión de editores anteriores. Esta cifra ha sido modificada a partir de Wang et al.11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Composición bacteriana ovárica en grupos de cáncer y control desde diferentes perspectivas
Se realizó un análisis de la composición bacteriana ovárica desde diferentes perspectivas para detectar aún más las diferencias en las bacterias ováricas identificadas. En la Tabla 2,se consideraron los niveles de filo, clase, orden, familia, género y especie, y las estadísticas se proporcionan en la tabla. En particular, hubo una asociación entre la abundancia relativa de Anoxynatronum sibiricum y el estadio del tumor, y Methanosarcina vacuolata fue un signo específico al diagnosticar el cáncer de ovario (Tabla 2).
Conservación fenotípica de las bacterias ováricas en los dos grupos en función de las funciones predichas
En el grupo de cáncer, la expresión de genes relacionados con fenotipos potencialmente patógenos y tolerantes al estrés oxidativo aumentó en comparación con la del grupo de control (prueba de rango firmado de Wilcoxon, P = 0,02 y P = 0,002). No se encontraron diferencias significativas entre los grupos de cáncer de ovario y control en los siguientes aspectos: los fenotipos de bacterias aeróbicas, anaeróbicas, anaeróbicas facultativamente anaeróbicas, grampositivas y gramnegativas; elementos móviles; y la formación de biopelículas de las bacterias ováricas(Figura 5). Se determinaron cuarenta y seis variantes de las vías KEGG entre las bacterias en los ovarios en los grupos de cáncer y control. Los ovarios en el grupo de cáncer mostraron 26 vías aumentadas. Entre ellos, las vías más relacionadas fueron los transportadores. Por otro lado, las bacterias en el tejido del cáncer de ovario mostraron 20 vías reducidas. Las funciones más relevantes fueron las siguientes: sistema de secreción, funciones desconocidas y sistema de dos componentes. El resto de las vías se muestran en la Figura 6.
Figura 1: Expresión inmunohistoquímica de LPS en ovarios. (A) Grupo control (10 x). Barras de escala, 200 μm. (B) Grupo control (40 x). Barras de escala, 50 μm. (C) Grupo cáncer (10x). Barras de escala, 200 μm. (D) Grupo cáncer (40 x). Barras de escala, 50 μm. Las flechas apuntan a la tinción de LPS en el tejido ovárico. Obtuvimos el permiso de reimpresión de editores anteriores. Esta cifra ha sido modificada a partir de Wang et al.11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Metagnomos predichos analizados por BugBase. La expresión de algunos genes en el grupo de cáncer aumentó en comparación con la del grupo de control. Estos genes se relacionaron con fenotipos potencialmente patógenos (prueba de rango firmado de Wilcoxon, P = 0,02) y tolerantes al estrés oxidativo de los ovarios. (Prueba de rango firmado de Wilcoxon, P = 0.002). Obtuvimos el permiso de reimpresión de editores anteriores. Esta cifra ha sido modificada a partir de Wang et al.11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Análisis PICRUSt de diferentes vías KEGG entre los grupos de cáncer y control. Obtuvimos el permiso de reimpresión de editores anteriores. Esta cifra ha sido modificada a partir de Wang et al.11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 2: Riqueza (representada por el índice Chao 1 y ACE) y la diversidad (representada por el índice Shannon, Simpson y Evenness) de las especies bacterianas Haga clic aquí para descargar esta Tabla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El cáncer de ovario tiene una influencia notable en la fertilidad de las mujeres25. La mayoría de las pacientes con cáncer de ovario se diagnostican en etapas tardías, y la tasa de supervivencia a 5 años es inferior al 30%18. Se ha publicado la confirmación de bacterias en las vísceras sólidas abdominales, incluyendo el hígado, el páncreas y el bazo. La existencia de bacterias en el tracto reproductivo femenino superior se produce porque el cuello uterino no está encerrado2,3,4,5. Sin embargo, aún no se ha determinado si los ovarios, que son vísceras sólidas abdominales, son estériles o no. Además, si las bacterias en los ovarios están relacionadas con el cáncer de ovario también es una pregunta importante.
Las diferencias significativas en las bacterias que encontramos se compararon entre diferentes grupos. Todos los procedimientos mencionados anteriormente estaban estrictamente libres de gérmenes, incluidos instrumentos, reactivos, equipos y el funcionamiento de todo el protocolo. Más importante aún, utilizamos ovarios de pacientes con enfermedad uterina benigna como grupo de control para contrarrestar la posible contaminación. Sin embargo, en este protocolo, la contaminación no se puede evitar. Así, dado que el grupo de cáncer y el grupo de control se analizaron en el mismo entorno experimental, simplemente comparando las diferencias entre estos dos grupos, pudimos obtener evidencia primaria sobre el origen microbiológico del cáncer de ovario.
Los hallazgos de bacterias en el tejido ovárico podrían comenzar un nuevo campo investigando las bacterias que influyen en el cáncer de ovario. Además, la presencia y composición únicas de bacterias en los tejidos ováricos cancerosos podría dirigir la carcinogénesis del cáncer de ovario y los objetivos terapéuticos y pronósticos de las bacterias. Entre las 46 vías kegg, las funciones relacionadas con la biosíntesis de antibióticos del grupo de la vancomicina llamaron especialmente la atención. Esto puede proporcionar más opciones de tratamiento para el cáncer de ovario.
Sin embargo, el protocolo tenía algunas limitaciones. En primer lugar, las muestras no se pudieron recolectar de personas sanas por razones éticas. El grupo de control fueron ovarios de pacientes con enfermedad uterina benigna (incluyendo mioma uterino y adenomiosis). En segundo lugar, el número de muestras debe ser mayor. El tamaño limitado de la muestra del estudio podría obstaculizar la precisión de los resultados. En tercer lugar, aunque el grupo de cáncer y el grupo de control estaban en las mismas condiciones, no hubo controles negativos o positivos. Además, no se pudo evitar la contaminación. Hasta la fecha, el estudio de la bacteria ovárica en pacientes con cáncer de ovario aún se encuentra en una etapa temprana. Se necesita un estudio a mayor escala con más muestras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Premio de Investigación Clínica del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Xi'an Jiaotong, China (XJTU1AF-2018-017, XJTU1AF-CRF-2019-002), el Proyecto Principal de Investigación Básica de Ciencias Naturales del Departamento Provincial de Ciencia y Tecnología de Shaanxi (2018JM7073, 2017ZDJC-11), el Proyecto Clave de Investigación y Desarrollo del Departamento Provincial de Ciencia y Tecnología de Shaanxi (2017ZDXM-SF-068, 2019QYPY-138), el Proyecto Provincial de Innovación Tecnológica Colaborativa de Shaanxi (2 017XT-026, 2018XT-002), y el Proyecto de Investigación Médica del Plan de Orientación para el Desarrollo Social de Xi'an (2017117SF/YX011-3). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
Agradecemos a los colegas del Departamento de Ginecología del Primer Hospital Afiliado de la Universidad xi'an Jiaotong por sus contribuciones a la recolección de muestras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2200 TapeStation Software | Agilgent United States |
||
| AmpliSeq for Illumina Library Prep, Indexes, and Accessories | Illumina | ||
| Image-pro plus 7 | Media Cybernetics | ||
| Leica ASP 300S | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| Leica EG 1150 | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| Leica RM2235 | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| LPS Core monoclonal antibody, clone WN1 222-5 | Hycult Biotech | ||
| Mag-Bind RxnPure Plus magnetic beads | Omega Biotek | M1386-00 | |
| Mag-Bind Universal Pathogen 96 Kit | Omega Biotek | M4029-01 | |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | |
| Silva database | Max Planck Institute for Marine Microbiology and Jacobs University | ||
| the QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | |
| Trimmomatic | Björn Usadel | ||
| ZytoChem Plus (HRP) Anti-Rabbit (DAB) Kit | Zytomed Systems | HRP008DAB-RB |
References
- Manfredo Vieira, S., et al. Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans. Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).
- Geller, L. T., et al. Potential role of intratumor bacteria in mediating tumor resistance to the chemotherapeutic drug gemcitabine. Science. 357 (6356), 1156-1160 (2017).
- Manfredo, V. S., et al. Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans. Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).
- Brunelli, R., et al. Globular structure of human ovulatory cervical mucus. FASEB J. 21 (14), 3872-3876 (2007).
- Chen, C., et al. The microbiota continuum along the female reproductive tract and its relation to uterine-related diseases. Nature Communications. 8 (1), 875 (2017).
- Zervomanolakis, I., et al. Physiology of upward transport in the human female genital tract. Annals of the New York Academy of Sciences. 1101, 1-20 (2007).
- Verstraelen, H., et al. Characterisation of the human uterine microbiome in non-pregnant women through deep sequencing of the V1-2 region of the 16S rRNA gene. PeerJ. 4, 1602 (2016).
- Fang, R. L., et al. Barcoded sequencing reveals diverse intrauterine microbiomes in patients suffering with endometrial polyps. American Journal of Translational Research. 8 (3), 1581-1592 (2016).
- Miles, S. M., Hardy, B. L., Merrell, D. S. Investigation of the microbiota of the reproductive tract in women undergoing a total hysterectomy and bilateral salpingo-oopherectomy. Fertil Steril. 107 (3), 813-820 (2017).
- Banerjee, S., et al.
- Wang, Q., et al. The differential distribution of bacteria between cancerous and noncancerous ovarian tissues in situ. Journal of Ovarian Research. 13 (1), 8 (2020).
- Wang, L., et al. Bacterial overgrowth and diversification of microbiota in gastric cancer. European Journal of Gastroenterology & Hepatology. 28 (3), 261-266 (2016).
- Hosgood, H. D., et al. The potential role of lung microbiota in lung cancer attributed to household coal burning exposures. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 643-651 (2014).
- Kwon, M., Seo, S. S., Kim, M. K., Lee, D. O., Lim, M. C. Compositional and Functional Differences between Microbiota and Cervical Carcinogenesis as Identified by Shotgun Metagenomic Sequencing. Cancers. 11 (3), 309 (2019).
- Urbaniak, C., et al. The Microbiota of Breast Tissue and Its Association with Breast Cancer. Applied and Environmental Microbiology. 82 (16), 5039-5048 (2016).
- Feng, Y., et al. Metagenomic and metatranscriptomic analysis of human prostate microbiota from patients with prostate cancer. BMC Genomics. 20 (1), 146 (2019).
- Walsh, D. M., et al. Postmenopause as a key factor in the composition of the Endometrial Cancer Microbiome (ECbiome). Scientific Reports. 9 (1), 19213 (2019).
- Walther-Antonio, M. R., et al. Potential contribution of the uterine microbiome in the development of endometrial cancer. Genome Medicine. 8 (1), 122 (2016).
- Poore, G. D., et al. Microbiome analyses of blood and tissues suggest cancer diagnostic approach. Nature. 579 (7800), 567-574 (2020).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Ward, T., et al. BugBase predicts organism-level microbiome phenotypes. bioRxiv. , (2017).
- Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
- Langille, M. G. I., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814 (2013).
- Parks, D. H., Tyson, G. W., Hugenholtz, P., Beiko, R. G. STAMP: statistical analysis of taxonomic and functional profiles. Bioinformatics. 30 (21), 3123 (2014).
- Leranth, C., Hamori, J. 34;Dark" Purkinje cells of the cerebellar cortex. Acta Biologica Hungarica. 21 (4), 405-419 (1970).
