Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تصنيع صفائف الأنسجة الدقيقة القلبية 3D باستخدام الخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC البشرية ، والخلايا الليفية القلبية ، والخلايا البطانية

Published: March 14, 2021 doi: 10.3791/61879
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

Summary

هنا ، نصف منهجية سهلة الاستخدام لإنشاء صفائف الأنسجة الدقيقة القلبية ذاتية التجميع 3D التي تتكون من الخلايا العضلية القلبية متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المتمايزة مسبقا ، والخلايا الليفية القلبية ، والخلايا البطانية. يمكن تنفيذ هذه التقنية سهلة الاستخدام ومنخفضة الخلايا التي تتطلب تقنية لتوليد الأنسجة الدقيقة القلبية لنمذجة الأمراض والمراحل المبكرة من تطوير الدواء.

Abstract

وقد وفر توليد الخلايا العضلية القلبية البشرية (CMs) والخلايا الليفية القلبية (CFs) والخلايا البطانية (ECs) من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) فرصة فريدة لدراسة التفاعل المعقد بين أنواع الخلايا القلبية الوعائية المختلفة التي تدفع نمو الأنسجة والمرض. في مجال نماذج الأنسجة القلبية ، تستخدم العديد من الأساليب ثلاثية الأبعاد المتطورة (3D) الخلايا العضلية القلبية المستحثة متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية (iPSC-CMs) لمحاكاة الأهمية الفسيولوجية وبيئة الأنسجة الأصلية مع مزيج من المصفوفات خارج الخلية والروابط المتقاطعة. ومع ذلك ، فإن هذه الأنظمة معقدة للتصنيع دون خبرة في التصنيع الدقيق وتتطلب عدة أسابيع للتجميع الذاتي. الأهم من ذلك ، أن العديد من هذه الأنظمة تفتقر إلى الخلايا الوعائية والخلايا الليفية القلبية التي تشكل أكثر من 60٪ من الخلايا غير العضلية في قلب الإنسان. هنا نصف اشتقاق جميع أنواع خلايا القلب الثلاثة من iPSCs لتصنيع الأنسجة الدقيقة القلبية. تسمح تقنية التشكيل المتماثل سهلة هذه بزراعة الأنسجة الدقيقة القلبية في لوحات زراعة الخلايا القياسية متعددة الآبار لعدة أسابيع. تسمح المنصة بالتحكم المحدد من قبل المستخدم في أحجام الأنسجة الدقيقة بناء على كثافة البذر الأولية وتتطلب أقل من 3 أيام للتجميع الذاتي لتحقيق تقلصات الأنسجة الدقيقة القلبية التي يمكن ملاحظتها. علاوة على ذلك ، يمكن هضم الأنسجة الدقيقة القلبية بسهولة مع الحفاظ على صلاحية عالية للخلية للاستجواب أحادي الخلية باستخدام قياس التدفق الخلوي وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq). نحن نتصور أن هذا النموذج المختبري للأنسجة الدقيقة القلبية سيساعد على تسريع دراسات التحقق من الصحة في اكتشاف الأدوية ونمذجة الأمراض.

Introduction

يواجه اكتشاف الأدوية ونمذجة الأمراض في مجال أبحاث القلب والأوعية الدموية العديد من التحديات بسبب نقص العينات ذات الصلة سريريا وعدم كفاية الأدوات الانتقالية1. لا تظهر النماذج ما قبل السريرية شديدة التعقيد أو النماذج أحادية الخلية المبسطة في المختبر ظروفا فسيولوجية مرضية بطريقة قابلة للتكرار. لذلك ، تطورت العديد من المنصات المصغرة التي تم هندستها بالأنسجة للمساعدة في سد الفجوة ، بهدف تحقيق توازن بين سهولة التطبيق بطريقة عالية الإنتاجية والتلخيص الأمين لوظيفة الأنسجة 2,3. مع ظهور تكنولوجيا الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) ، يمكن تطبيق أدوات هندسة الأنسجة على الخلايا الخاصة بالمريض مع أو بدون حالة أمراض القلب والأوعية الدموية الكامنة للإجابة على أسئلة البحث4،5،6. يمكن استخدام مثل هذه النماذج الهندسية للأنسجة ذات التركيب الخلوي المشابه لأنسجة القلب في جهود تطوير الأدوية لاختبار سمية القلب والخلل الوظيفي الناجم عن التغيرات المرضية في سلوك نوع واحد أو عدة خلايا.

الأنسجة الدقيقة ذاتية التجميع أو الأعضاء المشتقة من iPSCs البشرية هي هياكل ثلاثية الأبعاد (3D) عبارة عن تجمعات مصغرة تشبه الأنسجة تظهر أوجه تشابه وظيفية مع نظيراتها في الجسم الحي. هناك العديد من الأساليب المختلفة التي تسمح بتكوين المواد العضوية في الموقع عن طريق التمايز الموجه ل iPSCs أو من خلال تكوين الأجسام الجنينية4. المواد العضوية الناتجة هي أداة لا غنى عنها لدراسة العمليات المورفوجينية التي تدفع التكوين العضوي. ومع ذلك، فإن وجود مجموعة متنوعة من مجموعات الخلايا والاختلافات في التنظيم الذاتي يمكن أن يؤدي إلى تباين في النتائج بين المواد العضوية المختلفة5. بدلا من ذلك ، تعد الخلايا المتمايزة مسبقا التي يتم تجميعها ذاتيا في أنسجة دقيقة ذات أنواع خلايا خاصة بالأنسجة لدراسة تفاعلات الخلايا الخلوية المحلية نماذج ممتازة ، حيث يكون من الممكن عزل المكونات المجمعة ذاتيا. خاصة في أبحاث القلب البشري ، أثبت تطوير الأنسجة الدقيقة القلبية 3D ذات المكونات متعددة الخلايا أنه يمثل تحديا عندما يتم اشتقاق الخلايا من خطوط مختلفة للمرضى أو مصادر تجارية.

لتحسين فهمنا الميكانيكي لسلوكيات الخلايا في نموذج ذو صلة فسيولوجية وشخصية ومختبرية ، من الناحية المثالية ، يجب اشتقاق جميع أنواع الخلايا المكونة من نفس خط المريض. في سياق القلب البشري ، فإن نموذج القلب التمثيلي الحقيقي في المختبر من شأنه أن يلتقط الحديث المتبادل بين أنواع الخلايا السائدة ، وهي الخلايا العضلية القلبية (CMs) ، والخلايا البطانية (ECs) ، والخلايا الليفية القلبية (CFs) 6,7. لا يتطلب التلخيص الأمين لعضلة القلب التمدد الفيزيائي الحيوي والتحفيز الكهروفسيولوجي فحسب ، بل يتطلب أيضا إشارات الخلايا الخلوية التي تنشأ عن أنواع الخلايا الداعمة مثل ECs و CFs8. تشارك CFs في تخليق المصفوفة خارج الخلية والحفاظ على بنية الأنسجة. وفي حالة مرضية ، يمكن أن تحفز CFs التليف وتغير التوصيل الكهربائي في CMs9. وبالمثل ، يمكن لل ECs تنظيم الخصائص الانقباضية ل CMs من خلال إشارات paracrine وتوفير متطلبات التمثيل الغذائي الحيوية 10. وبالتالي ، هناك حاجة إلى أنسجة القلب الدقيقة البشرية المكونة من جميع أنواع الخلايا الرئيسية الثلاثة للسماح بإجراء تجارب عالية الإنتاجية ذات صلة فسيولوجية.

هنا ، نصف نهجا من أسفل إلى أعلى في تصنيع الأنسجة الدقيقة القلبية عن طريق اشتقاق الخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC البشرية (iPSC-CMs) ، والخلايا البطانية المشتقة من iPSC (iPSC-ECs) ، والخلايا الليفية القلبية المشتقة من iPSC (iPSC-CFs) وثقافتها 3D في صفائف الأنسجة الدقيقة القلبية الموحدة. يمكن استخدام هذه الطريقة السهلة لتوليد الأنسجة الدقيقة القلبية التي تنبض تلقائيا لنمذجة الأمراض والاختبار السريع للأدوية من أجل الفهم الوظيفي والميكانيكي لفسيولوجيا القلب. علاوة على ذلك ، يمكن استغلال منصات الأنسجة الدقيقة القلبية متعددة الخلايا هذه بتقنيات تحرير الجينوم لمحاكاة تطور أمراض القلب بمرور الوقت في ظل ظروف الثقافة المزمنة أو الحادة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. المتوسطة ، كاشف ، إعداد لوحة الثقافة

  1. محلول غسل الخلايا لزراعة الخلايا: استخدم محلول ملحي مخزن مؤقتا بالفوسفات 1x (PBS) أو محلول الملح المتوازن Hanks (HBSS) بدون كالسيوم أو مغنيسيوم.
  2. وسائط تمايز الخلايا العضلية القلبية
    1. تحضير التمايز المتوسط # 1 عن طريق إضافة ملحق 10 مل (50x B27 بالإضافة إلى الأنسولين) إلى 500 مل من الوسط القاعدي للخلايا العضلية القلبية (RPMI 1640).
    2. تحضير التمايز المتوسط # 2 عن طريق إضافة ملحق 10 مل (50x B27 ناقص الأنسولين) إلى 500 مل من الوسط القاعدي للخلايا العضلية القلبية (RPMI 1640).
    3. تحضير تنقية متوسطة # 3 عن طريق إضافة ملحق (50x B27 بالإضافة إلى الأنسولين) إلى 500 مل من الوسط القاعدي للخلايا العضلية القلبية (RPMI 1640) ناقص الجلوكوز.
  3. وسائط النمو البطانية وكواشف فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا (MACS)
    1. إعداد وسط النمو البطاني (EGM) مع مجموعة مكملات متوسطة النمو البطانية المتاحة تجاريا.
    2. قم بإعداد محلول المخزن المؤقت لفرز فصل الخلايا عن طريق تخفيف محلول مخزون ألبومين مصل البقر (BSA) إلى 1:20 باستخدام محلول الشطف.
  4. وسط تمايز الخلايا الليفية القلبية: إعداد وسط تمايز الخلايا الليفية القلبية باستخدام وسط الخلايا القاعدية الليفية (الجلوكوز عالي DMEM) ومجموعة عوامل حياة الخلايا الليفية الخالية من المصل.
  5. وسط تصنيع الأنسجة الدقيقة القلبية وصيانتها: قم بإعداد وسط مفلتر مع وسط قاعدي للخلايا العضلية القلبية (RPMI 1640) مع مكمل غذائي (50x B27 بالإضافة إلى الأنسولين) و EGM بنسبة 70/30 v/v٪.
  6. حلول مخزون الجزيئات الصغيرة وعوامل النمو
    1. من أجل التمايز بين جميع أنواع الخلايا الثلاثة ، قم بإعداد 200 ميكرولتر من مثبطات GSK3-beta CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile) ؛ مثبط Wnt IWR-1-endo (4-(1,3,3a,4,7,7a-Hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-yl)-N-8-quinolinyl-Benzamide ؛ وتحويل مثبط عامل النمو بيتا (TGF-β) SB431542 (4-[4-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]benzamid) عند تركيز 10 mM في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).
    2. من أجل تمايز iPSC-EC البشري ، قم بإعداد 100 ميكرولتر من عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) (20 ميكروغرام / مل) ، وعامل النمو البطاني الوعائي 165 (VEGF165 ؛ 50 ميكروغرام / مل) ، والبروتين المورفوجيني العظمي 4 (BMP4 ؛ 20 ميكروغرام / مل) في 0.1٪ (ث / v) BSA في الماء المقطر فائق النقاء. تخزين aliquots في -20 درجة مئوية ؛ للتخزين على المدى الطويل ، يمكن تخزين aliquots في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة.
  7. لوحات ما قبل الطلاء لصيانة iPSC-CMs و iPSC-ECs و iPSC-CFs.
    1. قم بإعداد مصفوفة الأغشية السفلية متوسطة المغلفة بألواح 6 آبار لإعادة طلاء iPSC-CM عن طريق تخفيف وسط مصفوفة الغشاء السفلي المخفض لعامل النمو (GFR) في DMEM / F12 بنسبة 1:200. أضف 2 مل من وسط مصفوفة الغشاء السفلي المخفف إلى كل بئر من الصفيحة المكونة من 6 آبار واتركها لضبط لمدة 2 إلى 4 ساعات على الأقل.
    2. قبل تغطية طبق 6 بئر أو طبق 10 سم مع الجيلاتين. تسييل محلول الجيلاتين 2٪ في حمام مائي عند 37 درجة مئوية وإعداد الجيلاتين المصفى 0.2٪ (v / v) في PBS في حجم مناسب حسب الحاجة. قم بتغطية لوحة الاستزراع ب 10 مل من الجيلاتين بنسبة 0.2٪ لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
      ملاحظة: يمكن استخدام ألواح الجيلاتين لكل من iPSC-CFs و iPSC-ECs بعد MACS.
  8. تصنيع قوالب الأنسجة الدقيقة: قم بإعداد محلول أغاروز منخفض الذوبان بنسبة 2٪ في PBS في زجاجة زجاجية جافة سعة 100 مل. قم بتعقيم الأغاروز عند 121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 20 دقيقة قبل الاستخدام. قم بتعقيم قوالب السيليكون الدقيقة المصبوبة عند 121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 15 دقيقة.
  9. حلول للهضم والتلطيخ المناعي وقياس التدفق الخلوي
    1. لهضم الأنسجة الدقيقة ، قم بإعداد مخزن مؤقت لهضم الإنزيم من Dispase I (1 U / mL) و Liberase (3 U / mL) في PBS. حافظ على هذا الحل على الجليد.
    2. لكل من تثبيت الخلايا والأنسجة الدقيقة ، استخدم كاشف التثبيت المتوفر تجاريا على الجليد البارد الذي يحتوي على 4.2٪ بارافورمالديهايد (PFA).
    3. تحضير 0.25٪ Triton X-100 في PBS للنفاذية و 0.1٪ Tween-20 للغسل. يمكن تخزين الحل في درجة حرارة الغرفة.
    4. لتحليلات فرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS) ، قم بإعداد مخزن مؤقت FACS [PBS أو HBSS مع مصل بقري جنيني بنسبة 2٪] وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
    5. للتلطيخ المناعي ، قم بإعداد مصل الماعز / الحمار / الأرانب الطبيعي بنسبة 2٪ في PBS. اختر أنواع المصل بناء على المضيف الذي أثيرت فيه الأجسام المضادة.

2. تمايز القلب وتنقية

ملاحظة: يجب الحفاظ على جميع iPSCs عند ~ 75٪ إلى 80٪ من الالتقاء قبل تمايز الخلايا العضلية القلبية. تم اشتقاق iPSCs المستخدمة لهذا البروتوكول من خلايا الدم أحادي النواة الطرفية (PBMCs) باستخدام إعادة برمجة فيروس سينداي التي أجريت في البنك الحيوي لمعهد ستانفورد للقلب والأوعية الدموية (SCVI).

  1. قبل التمايز ، مستعمرات iPSC الثقافية حتى المرور (P20).
  2. قم بإزالة وسط ثقافة iPSC من لوحة 6 آبار واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 2 مل PBS.
  3. في اليوم 0 ، ابدأ تحريض الأديم المتوسط بإضافة 2 مل من التمايز المتوسط # 1 مع CHIR (6 ميكرومتر نهائي) في كل بئر. قد يتراوح التركيز النهائي بين 6 إلى 9 ميكرومتر لخطوط iPSC المختلفة. وبالتالي ، يوصى باختبار تركيزات CHIR المختلفة على صفيحة من 6 آبار لتحديد تحريض الأديم المتوسط الأمثل للقلب.
  4. في اليوم 2 ، استرجع الخلايا عن طريق استبدالها ب 2 مل متوسطة # 1 طازجة في كل بئر.
  5. في اليوم الثالث ، استبدل الوسط في كل بئر بتمايز 2 مل متوسط # 1 بمثبط Wnt IWR-1-endo (5 ميكرومتر) للحث على مواصفات سلالة القلب.
  6. في اليوم 5 ، استرجع الخلايا عن طريق استبدال الوسط ب 2 مل متوسط جديد # 1 في كل بئر.
  7. في اليوم 7 ، استبدل الوسط ب 2 مل متوسط # 2 في كل بئر. يمكن ملاحظة الضرب التلقائي للخلايا العضلية القلبية في وقت مبكر من اليوم 8-9. بالنسبة لبعض الخطوط، قد تظهر خلايا الضرب في وقت متأخر من اليوم 11.
  8. لتنقية ثقافة التمايز ، استبدل ب 2 مل ناقص الجلوكوز المتوسط # 3 في كل بئر في اليوم 10.
  9. في اليوم 13 ، استرجع الخلايا عن طريق تغيير الوسط مع 2 مل بالإضافة إلى الجلوكوز المتوسط # 2 في كل بئر.
  10. في اليوم 16 ، قم بإجراء الجولة الثانية من التنقية مع 2 مل من المتوسط # 3 في كل بئر.
  11. استعادة الخلايا في اليوم 19 مع 2 مل بالإضافة إلى الجلوكوز المتوسط # 2.
  12. في اليوم 20 ، اغسل الآبار مرة واحدة باستخدام 1 مل PBS وافصل الخلايا باستخدام 1 مل 10x Trypsin لمدة 6 دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، يتم رفع الخلايا من سطح البئر إلى خلايا مفردة لمدة تقل عن 15 ثانية وتضاف إلى أنبوب مخروطي 15 مل بحجم متساو من الوسط # 2 لتحييد الإنزيم. الطرد المركزي تعليق الخلية لمدة 3 دقائق في 270 × غرام.
  13. أعد تعليق بيليه الخلية في 3 مل متوسطة # 3. عد الخلايا وأضف الحجم المناسب من Medium # 3 إلى لوحة ما مجموعه ~ 3 ملايين خلية في كل بئر من مصفوفة غشاء قبو جديدة متوسطة المغلفة بلوحة 6 آبار. في اليوم الثاني بعد إعادة الطلاء ، استبدل الوسط ب 2 مل متوسط # 2 ، وقم بتجديده ب 2 مل متوسط # 2 كل يوم حتى التربسينات من الخلايا العضلية القلبية للتجميد أو التجارب المستقبلية.

3. تمايز الخلايا البطانية و MACS

  1. عند التقاء iPSC بنسبة 75٪ إلى 80٪ ، اغسل اللوحة باستخدام PBS ، 2 مل لكل بئر.
  2. ابدأ التمايز في اليوم 0 عن طريق الاستعاضة عن 2 مل من التمايز المتوسط #1 مع 6 ميكرومتر CHIR.
  3. في اليوم 2 ، استبدل الوسط ب 2 مل من التمايز المتوسط # 1 مع 2 ميكرومتر CHIR.
  4. في اليوم الرابع ، استبدل الوسط ب 2 مل من EGM مع استكمال 20 نانوغرام bFGF-2 ، و 50 نانوغرام VEGF165 ، و 20 نانوغرام BMP4.
  5. تغيير الوسط مع 2 مل من EGM تكممل بعوامل النمو كل يومين من اليوم 6 إلى اليوم 10. إضافة مثبط TGFβ (SB431542) بتركيز 8 ميكرومتر اختياري لتعزيز التوسع البطاني وقمع التمايز بين أنواع الخلايا الأخرى ذات الأصل المتوسط.
  6. في اليوم 12 ، ابدأ خطوات MACS عن طريق شطف كل بئر ب 1 مل من PBS متبوعا بتفكك الخلايا باستخدام 1 مل من 10x Trypsin في كل بئر من لوحة من 6 آبار لمدة 8 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  7. تحضير حجم متساو من وسط EGM في أنبوب مخروطي 50 مل لتحييد إنزيم التفكك. ضع مصفاة خلية 40 ميكرومتر على الأنبوب المخروطي سعة 50 مل ومرر تعليق الخلية المنفصل عبر المصفاة. تغيير المرشح لكل 2 إلى 3 آبار منفصلة.
  8. تعداد إجمالي الخلايا القابلة للحياة باستخدام 0.4٪ Trypan blue باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي.
  9. قم بتكسير تعليق الخلية عند 300 × g لمدة 5 دقائق في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  10. تخلص من السوبرناتانت وأعد تعليق حبيبة الخلية في الحجم المناسب من المخزن المؤقت للفرز استنادا إلى العدد الإجمالي في الخطوة 3.8.
    ملاحظة: إضافة 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفرز لكل 107 خلايا إجمالية.
  11. لوضع العلامات على الخرز المغناطيسي ، أضف 20 ميكرولتر من كاشف FcR Block لكل 107 خلية واحتضنه لمدة 5 دقائق.
  12. أضف 20 ميكرولتر من الميكروبيدات CD144 أو CD31 لكل 107 خلايا واخلطها جيدا. احتضان تعليق الخلية في الظلام عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
  13. أضف 20 مل من المخزن المؤقت للفرز لغسل الخلايا الملصقة وقم بتكوير الخلايا 300 × g لمدة 5 دقائق في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  14. أعد تعليق حبيبات الخلية في 3 مل من المخزن المؤقت للفرز واتركها على الجليد.
  15. قم بإعداد عمود فصل مغناطيسي عن طريق وضع العمود في درجة الفاصل.
  16. قم بموازنة العمود عن طريق الشطف باستخدام 3 مل من المخزن المؤقت للفرز وجمع التدفق من خلاله في أنبوب مخروطي للنفايات.
  17. بمجرد تدفق المخزن المؤقت للشطف ، أعد تعليق تعليق الخلية جيدا لكسر أي كتل وتطبيق تعليق الخلية على العمود.
  18. بعد تدفق تعليق الخلية ، اغسل العمود ب 3 مل من المخزن المؤقت للفرز ثلاث مرات لإزالة أي خلايا غير مسماة.
  19. قم بإزالة العمود من الفاصل وضعه في أنبوب مخروطي 15 مل لإزالة الخلايا CD144 + / CD31 +.
  20. أضف 5 مل من المخزن المؤقت للفرز على العمود واغسل الخلايا المصنفة مغناطيسيا على الفور باستخدام المكبس.
  21. حدد رقم الخلية القابل للحياة باستخدام 0.4٪ Trypan Blue باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي.
  22. جهاز طرد مركزي لتعليق الخلية في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا عند 300 × g لمدة 3 دقائق.
  23. أعد تعليق حبيبات الخلايا في الحجم المناسب من EGM باستخدام 5-8 ميكرومتر من مثبط TGFβ (SB431542) استنادا إلى العدد الإجمالي في الخطوة 3.21.
  24. لوحة هذا الممر 0 (P0) الخلايا في كثافة خلية مناسبة (4 × 104 خلية / سم 2) على لوحة الجيلاتين المغلفة مسبقا 0.2٪.
  25. بالنسبة ل P0 و P1 ، استمر في تجديد الوسط ب EGM طازج كل يومين باستخدام مثبط TGFβ. من P2 ، يمكن زراعة الخلايا في وسط نمو بطاني بدون مثبط TGFβ.

4. تمايز الخلايا الليفية القلبية

  1. السماح ل iPSCs بأن تصبح متقاربة بنسبة 90٪ إلى 95٪ ؛ غسل كل بئر مع 1 مل PBS.
  2. ابدأ التمايز في اليوم 0 بإضافة 2 مل من التمايز المتوسط #1 مع 11 ميكرومتر CHIR. بالنسبة لخطوط iPSC الحساسة ، قد يتراوح التركيز بين 9-10 ميكرومتر.
  3. في اليوم 1 ، راقب اللوحة. من الطبيعي ملاحظة موت الخلايا بشكل كبير مع ~ 30٪ إلى 40٪ من الخلايا الملتصقة باللوحة.
  4. في اليوم 3 ، أضف 2 مل من التمايز المتوسط # 1 مع 5 ميكرومتر IWR-1-endo لتعزيز توسع أسلاف القلب.
  5. في اليوم 4 ، استبدل الوسط ب 2 مل من وسط تمايز الخلايا الليفية القلبية. استبدل بالوسط الطازج كل يومين حتى اليوم 16.
  6. في اليوم 18 ، افصل الخلايا باستخدام 1 مل من 10x Trypsin في كل بئر من صفيحة من 6 آبار لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  7. قم بتعطيل طبقة الخلية جيدا وتمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على حجم متساو من وسط DMEM / F12 مع 5٪ FBS.
  8. حدد رقم الخلية القابل للحياة باستخدام 0.4٪ Trypan Blue باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي.
  9. الطرد المركزي تعليق الخلية في 300 × غرام لمدة 5 دقائق للحصول على بيليه.
  10. بالنسبة لإعادة الطلاء الأولى ، أعد تعليق حبيبات الخلية في حجم مناسب من وسط التمايز والصفيحة بكثافة خلية (6 × 104 خلايا / سم 2) على صفيحة مغلفة بالجيلاتين بنسبة 0.2٪ حتى التقاء بنسبة 90٪.
  11. قم بتقسيم اللوحة والحفاظ على الخلايا الليفية القلبية في DMEM / F12 العادي مع مصل 10٪ على ألواح مغلفة بالجيلاتين.

5. صب قوالب الأنسجة الدقيقة القلبية وبذر الخلايا

  1. يذوب الأغاروز في الميكروويف في زجاجة زجاجية سعة 100 مل حتى الغليان. رش زجاجة الأغاروز ووضعها في خزانة السلامة الأحيائية. اترك الأغاروز ليبرد لمدة 3 دقائق تقريبا.
  2. ماصة 700 ميكرولتر من الأغاروز المنصهر في قالب دقيق من السيليكون من صفيف 9 × 9. تجنب توليد فقاعات أثناء السحب.
  3. ضع القالب بعناية على كتلة ثلج مبردة مسبقا لتسريع هلام الأغاروز.
  4. تأكد من أنه بمجرد أن يتم هلام الأغاروز ، يصبح شفافا. انحني بعناية حول حواف القالب الصغير لتخفيف نسخة الأغاروز المتماثلة. ثم ، قشر النسخة المتماثلة بلطف من جميع الجوانب لفصل نسخة الأغاروز المتماثلة عن قالب السيليكون الصغير.
  5. انقل صينية الأنسجة الدقيقة الأغاروز التي تحتوي على 81 استراحة دائرية (قطرها 800 ميكرومتر؛ عمق 800 ميكرومتر) إلى صفيحة معقمة من 12 بئرا.
  6. أضف 2 مل من PBS إلى صينية الأنسجة الدقيقة الأغاروز وافحصها تحت المجهر بحثا عن أي فقاعات محاصرة أو آبار غير منتظمة الشكل.
  7. اغمر صينية الأغاروز في 2 مل 70٪ من الإيثانول بين عشية وضحاها ، تليها المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية في خزانة السلامة البيولوجية لمدة 1 ساعة.
  8. قبل الاستخدام ، قم بإزالة الإيثانول بنسبة 70٪ واغسله مرتين بالماء المقطر وغسله النهائي باستخدام 2 مل PBS.
  9. قم بتثبيط وتحييد وحساب iPSC-CMs و iPSC-ECs و iPSC-CFs ووضع معلقات الخلايا على الجليد.
  10. قم بإزالة PBS من البئر وغرفة بذر الخلايا بعناية دون لمس الاستراحات.
  11. في أنبوب جديد، امزج iPSC-CMs و iPSC-ECs و iPSC-CFs بنسبة 7: 2: 1 ، على التوالي ، لتحقيق كثافة خلية نهائية تبلغ 106 خلية / مل. ستؤدي كثافات الخلايا العالية إلى أنسجة دقيقة أكبر.
    ملاحظة: لا تتجاوز 2 × 106 خلية/مل.
  12. أضف بعناية 200 ميكرولتر من تعليق الخلية قطرة في غرفة البذر.
  13. اسمح للخلايا بالاستقرار عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 لمدة ساعتين.
  14. أضف وسط تصنيع الأنسجة الدقيقة المحيط بقالب الأغاروز لتغطية سطح الغرفة الداخلية فقط.
  15. بعد 24 ساعة ، تتجمع الخلايا ذاتيا وتضغط بشكل كبير في الاستراحات الدائرية. استبدل بوسط طازج كل 2 أيام للصيانة.

6. تثبيت ونفاذية الخلايا والأنسجة الدقيقة القلبية للتلطيخ المناعي

  1. لكل نوع من أنواع الخلايا الفردية ، قم بزراعة الخلايا بشكل منفصل على شرائح الحجرة المتوسطة أو الحجرة المطلية بالجيلاتين (حوالي 2.5-3 × 105 خلية / مل). يمكن جمع الأنسجة الدقيقة القلبية في أنبوب مخروطي 15 مل عن طريق تنظيفها بلطف من الاستراحات الدائرية.
  2. شفط الوسط وشطف الخلايا أو الأنسجة الدقيقة مع 1 مل PBS ؛ بعد ذلك ، قم بالإصلاح باستخدام المخزن المؤقت للتثبيت الذي يحتوي على 4.2٪ PFA لمدة 20 دقيقة لشرائح الغرفة و 1 ساعة للأنسجة الدقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. قم بشفط PFA وأضف 1 مل من محلول النفاذية (0.25٪ Triton X-100 في PBS) لمدة 5 إلى 7 دقائق لشرائح الغرفة و 20 دقيقة للأنسجة الدقيقة في أنبوب مخروطي 15 مل.
    ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا، يمكن هز العينات بلطف على منصة هزاز على الطاولة.
  4. استنشق محلول الاختراق واشطفه مرة واحدة باستخدام 2 إلى 3 مل من PBS.
  5. احتضان الخلايا مع 500-1000 ميكرولتر من محلول الحجب (2٪ إلى 5٪ مصل الماعز الطبيعي أو مصل الحمار) لمدة 1 ساعة على الأقل لشرائح الغرفة و 3 إلى 4 ساعات للأنسجة الدقيقة.
  6. احتضان الخلايا أو الأنسجة الدقيقة القلبية بأجسام مضادة مقترنة محضرة في محلول الحجب الكافي لتغطية العينة. احتضن مع التروبونين-T المضاد للقلب (cTnT2) (1:50) ، ومضاد CD31 (1:75) ، ومضاد DDR2 / Vimentin (1:50) لمدة ساعة واحدة لشرائح الغرفة وبين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية للأنسجة الدقيقة القلبية.
  7. اغسل منزلقات الغرفة ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر 0.1٪ Tween-20 لمدة 5 دقائق بين كل غسل وغسل نهائي باستخدام PBS.
  8. بالنسبة للأنسجة الدقيقة القلبية ، اغسل ب 2 مل 0.1٪ Tween-20 خمس مرات مع مدة 20 دقيقة بين كل غسلة. نفذ خطوة الغسيل النهائية لمدة 20 دقيقة إضافية.
  9. احتضان الخلايا أو الأنسجة الدقيقة باستخدام 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (1 ميكروغرام / مل) قبل الفحص المجهري البؤري.
  10. بالنسبة للأنسجة الدقيقة القلبية ، انقلها بعناية إلى طبق سفلي زجاجي 35 مم وأضف PBS لغمر الأنسجة الدقيقة.
  11. للتصوير ثلاثي الأبعاد ، باستخدام هدف غمر الزيت 20x أو 40x ، ركز مركز التركيز على الأنسجة الدقيقة وضبط معلمات التعرض لكل فلوروفور.
  12. للحصول على مكدس Z ، قم بتعيين الإحداثيات الأولى والأخيرة في الوضع المباشر بعمق تصوير إجمالي يتراوح بين 100 و 200 ميكرومتر مع فاصل زمني لشريحة 5-10 ميكرومتر.

7. هضم الأنسجة الدقيقة القلبية وإعداد الخلايا لقياس التدفق الخلوي

  1. لهضم الأنسجة الدقيقة ، اغسل الأنسجة الدقيقة بلطف باستخدام Medium # 1 من الاستراحات الدائرية باستخدام طرف ماصة عريض التجويف 1 مل في أنبوب مخروطي 15 مل.
  2. اسمح للأنسجة الدقيقة بالاستقرار وشفط الوسط بعناية وشطف الخلايا أو الأنسجة الدقيقة باستخدام 1 مل PBS وإضافة 200-300 ميكرولتر من مخزن هضم الإنزيم لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. في 10 دقائق ، امزج الأنسجة الدقيقة بلطف لمدة دقيقة واحدة واحتضنها مرة أخرى عند 37 درجة مئوية لبقية الوقت.
  3. بعد الحضانة ، استخدم طرف ماصة منتظم 1 مل لخلط الأنسجة الدقيقة بقوة للحصول على تعليق خلية عكر.
  4. بمجرد هضم الأنسجة الدقيقة بشكل كاف إلى خلايا مفردة ، قم على الفور بتحييد تعليق الخلية باستخدام 5 مل من الوسط الذي يحتوي على 5٪ FBS وقم بإجهاد تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر. احسب العدد الإجمالي للخلايا وقم بالطرد المركزي لتعليق الخلية الواحدة عند 300 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  5. قم بشفط المادة الفائقة وأعد تعليق 1 × 105-1 × 106 خلايا في مخزن مؤقت ملزم بالملحق 100 ميكرولتر مع FITC Annexin V و 100 ميكروغرام / مل يوديد البروبيديوم (PI) أو صبغة استبعاد الخلايا الميتة To-Pro3 لمدة 10 دقائق على الجليد.
  6. بعد الحضانة ، أضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت المرتبط بالملحق إلى تعليق الخلية وانقله إلى أنبوب FACS مستدير القاع لتحليل التدفق الخلوي. استخدم أشعة الليزر الصحيحة ومرشحات الانبعاثات للفلوروفورات المحددة.
  7. لتحديد كمي لعلامات سطح الخلية باستخدام خلايا ثابتة، قم بإجراء تثبيت واختراق بيليه الخلية كما هو موضح في الخطوتين 6.2 و 6.3.
  8. بعد التخلل ، شطف بيليه الخلية واحتضن الخلايا بالأجسام المضادة المترافقة ذات الصلة لمدة 1 ساعة. اغسل حبيبات الخلايا في مخزن مؤقت FACS سعة 4 مل (2٪ FBS في PBS) وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 3 دقائق. كرر خطوة الغسيل مرتين.
  9. أعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت FACS 200-300 ميكرولتر لتحليل قياس التدفق الخلوي.
  10. اضبط خصائص التشتت الأمامي والجانبي باستخدام عينة غير ملطخة وفكر في استخدام عنصر تحكم متساوي النمط لكل فلوروفور لضبط جهد الليزر. جمع ما لا يقل عن 20000 حدث لتحليل البيانات.

8. إجراء تحليلات الانقباض للأنسجة الدقيقة القلبية الضاربة تلقائيا

  1. سجل مقاطع فيديو للأنسجة الدقيقة القلبية لالتقاط ثلاث دقات على الأقل. اضبط دقة التسجيل على 1280 × 720 بكسل على الأقل بمعدل إطارات >30 إطارا في الثانية واحفظ الفيديو في . تنسيق AVI.
  2. قم بتشغيل البرنامج النصي MotionGUI11 في بيئة MATLAB لتشغيل واجهة المستخدم.
  3. ابحث عن ملف . موقع ملف AVI في المجلد الخاص بك لتحميل الفيديو. ثم أدخل معدل الإطارات الذي تم التقاط الفيديو به في لوحة الإدخال.
  4. في لوحة الإدخال المتقدمة، يمكن تحديد حجم بكسل استنادا إلى الدقة وتكبير الالتقاط.
  5. يمكن تحديد حجم بكسل macroblock مناسب (افتراضي 16) وحركة بكسل قابلة للكشف اعتمادا على قوة تقلص الأنسجة الدقيقة.
  6. بعد ضبط المعلمات ، انقر فوق الحصول على متجهات الحركة لبدء التحليل.
  7. حدد منطقة ذات أهمية باستخدام زر الاختيار اختيار AOI لاستبعاد المناطق المحيطة بالأنسجة الدقيقة المفردة في العطلة الدائرية.
  8. استخدم الدالة Map Time Ave لإنشاء خريطة حرارية متوسطة للانكماش استنادا إلى الحركة المكتشفة على المحورين X وY.
  9. للحصول على بيانات تتبع الذروة، استخدم الدالة Get Contraction Data لقياس قمم الانكماش والاسترخاء تلقائيا.
  10. في حالة انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء، قم بتطبيق ارتفاع الذروة وعتبة المسافة لتعليق أقصى سرعة انكماش (نقطة زرقاء) وأقصى سرعة استرخاء (مثلث أحمر) بشكل صحيح.
  11. بعد تعيين العتبات الصحيحة، حدد تحليل القمم للحصول على قيم الانكماش والاسترخاء مع معدل الضرب والفاصل الزمني للضرب.
  12. الحصول على قياسات من ما لا يقل عن 25 من الأنسجة الدقيقة الفردية للتحليلات الإحصائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

توصيف التلطيخ المناعي وقياس التدفق الخلوي ل CMs و ECs و CFs المشتقة من iPSC
لتوليد الأنسجة الدقيقة القلبية المكونة من iPSC-CMs و iPSC-ECs و iPSC-CFs ، يتم تمييز جميع أنواع الخلايا الثلاثة وتمييزها بشكل فردي. وقد تحسن التمايز في المختبر بين iPSCs و iPSC-CMs على مدى السنوات العديدة الماضية. ومع ذلك ، يختلف عائد ونقاء iPSC-CMs من خط إلى آخر. ينتج البروتوكول الحالي أكثر من 75٪ من iPSC-CMs النقية التي تبدأ تلقائيا في الضرب في اليوم 9 (الشكل 1A). يمكن لمزيد من خطوات التنقية من اليوم 9 إلى اليوم 14 تحسين نقاء iPSC-CM إلى أكثر من 80٪ كما هو موضح سابقا12. وبالمثل ، يمكن إنشاء iPSC-ECs عالية النقاء باستخدام بروتوكولات منشورة سابقا 13,14 تتضمن إضافة العديد من عوامل نمو الأوعية الدموية التي تستقطب السلف البطاني الناشئة عن الأديم المتوسط في حوالي الأيام 4-5 (الشكل 1B) لتشكيل iPSC-ECs محددة جيدا ظاهريا. iPSC-CFs هي مجموعة سكانية غير متجانسة للغاية بناء على موقعها وتتميز بناء على مورفولوجيتها وتعبيرها عن بروتينات المصفوفة خارج الخلية. هنا ، باستخدام البروتوكولات المنشورة 15،16،17 مع التعديلات ، يتم الحصول على iPSC-CFs البشرية من الخلايا السلفية للأديم المتوسط القلبي (الشكل 1C).

Figure 1
الشكل 1: الجدول الزمني للتمايز. مخطط عام ل (A) iPSC-CM و (B) iPSC-EC و (C) iPSC-CF الجدول الزمني للتمايز مع صور تباين الطور التمثيلية للخلايا بعد خطوات التمايز والتنقية. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم تحديد نقاء iPSC-CMs و iPSC-ECs و iPSC-CFs عن طريق التلطيخ المناعي وقياس التدفق الخلوي باستخدام cTnT2 وجزيء التصاق الخلايا البطانية للصفائح الدموية (PECAM1 / CD31) و vimentin (VIM) ، على التوالي (الشكل 2A). أظهر التحليل الكمي وجود مجموعة سكانية نقية تحتوي على أكثر من 90٪ من خلايا cTnT2 في اليوم 20. تم تحديد iPSC-ECs التي تم الحصول عليها في اليوم 12 بعد MACS باستخدام حبات CD31 مع تلطيخ مناعي ضد علامة سطح الخلية البطانية PECAM1 / CD31. أنتجت MACS خلايا بطانية عالية النقاء كما يتضح من أكثر من 95٪ من خلايا CD31 + في P0. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن نقاء الخلايا البطانية انخفض مع ارتفاع أرقام المرور بسبب إزالة التمايز. وبالمثل ، في اليوم 20 ، كشفت تحليلات قياس التدفق الخلوي أن أكثر من 95٪ من iPSC-CFs عبرت عن علامة الخلايا الليفية VIM (الشكل 2B).

Figure 2
الشكل 2: التألق المناعي وتوصيف قياس التدفق الخلوي. (A) [اللوحة من اليسار إلى اليمين] iPSC-CMs في اليوم 25 ملطخة ب cTnT2 (سماوي) ، iPSC-ECs ملطخة ب PECAM1 / CD31 (أخضر) ، iPSC-CFs ملطخة ب VIM (أحمر) ، ونوى ملطخة ب DAPI (أزرق). شريط المقياس = 50 ميكرومتر (B) [اللوحة من اليسار إلى اليمين] أظهر القياس الكمي لقياس التدفق الخلوي نقاء عالي النسبة المئوية ل iPSC-CMs (91.8٪) و iPSC-ECs (98.1٪) و iPSC-CFs (96.7٪) بعد التمايز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تصنيع مزارع الأنسجة الدقيقة القلبية وتحليل الحجم
تم خلط معلقات الخلية الواحدة من iPSC-CMs و iPSC-ECs و iPSC-CFs بنسبة 7: 2: 1 وتم توزيعها بعناية في غرفة بذر الخلايا في قالب الأغاروز المقلد المعقم (الشكل 3A ، B). استقرت الخلايا بشكل موحد داخل الاستراحات الدائرية في 2 ساعة. في حوالي اليوم 3 ، تنتظم الخلايا المجمعة ذاتيا في حجم موحد تضرب تلقائيا الأنسجة الدقيقة القلبية (الشكل 3C). يمكن تصنيع صفائف الأنسجة الدقيقة ذات الأحجام المختلفة عن طريق ضبط كثافة الخلية النهائية (الشكل 3D ، E). الأنسجة الدقيقة القلبية المصنعة بكثافة خلية نهائية تبلغ 1 × 106 خلية / مل يبلغ قطرها ~ 300-350 ميكرومتر ، وقطر 2 × 106 خلية / مل حوالي 600 ميكرومتر ، وقطر 4 × 106 خلية / مل يزيد عن 800 ميكرومتر. تم الحصول على تجميع الأنسجة الدقيقة بكثافة خلية تبلغ 1 × 106 خلية / مل ، والتي تستخدم عادة في التجارب. يمكن الحفاظ على مزارع الأنسجة الدقيقة هذه في الثقافة لمدة تصل إلى 6 أسابيع.

Figure 3
الشكل 3: تقنية صب النسخ المتماثلة لتوليد أنسجة قلبية دقيقة متعددة الخلايا . (أ) صواني ميكروويل أغاروز مصبوبة طبق الأصل من (B) مخاليط iPSC-CM و iPSC-EC و iPSC-CF تم التقاطها داخل الآبار الدقيقة للتجميع الذاتي. شريط المقياس 500 = ميكروغرام (C) مجهري يوضح ضغط الأنسجة الدقيقة القلبية في اليوم 3. شريط المقياس = 500 ميكرومتر (D) تظهر أحجام الأنسجة الدقيقة القلبية المشكلة علاقة خطية مع كثافات البذر الأولية ، مع كثافات خلايا أعلى تؤدي إلى أنسجة دقيقة أكبر. (ه) شكل تمثيلي يبين الأنسجة الدقيقة القلبية المجمعة ذاتيا في مصفوفة البئر الدقيقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تلطيخ المناعة والبقاء بعد الهضم الأنزيمي
كشف تلطيخ التألق المناعي لليوم 12 بعد التصنيع باستخدام الأجسام المضادة ضد cTnT2 ل iPSC-CMs و CD31 ل iPSC-ECs و DDR2 ل iPSC-CFs عن توزيع الخلايا الفريد في الأنسجة الدقيقة القلبية. احتلت iPSC-CMs ، وهي أثقل أنواع الخلايا الثلاثة ، المركز ، في حين أن iPSC-ECs كانت تتخلل الأنسجة الدقيقة ، ولوحظ أن iPSC-CFs تحتل في الغالب المحيط (الشكل 4A). أدى الهضم القصير والسريع للأنسجة الدقيقة التي تم تحقيقها باستخدام Dispase I و Liberase TL إلى نسبة خلايا إجمالية قابلة للحياة للغاية (الشكل 4B ، اللوحة العلوية) مع أقل من 5٪ من الخلايا المستصصة بعد 2 أسابيع في الثقافة. وأعقب ذلك تعرض قصير لمدة 1 ساعة للأنسجة الدقيقة القلبية لتركيز عال (5 ميكرومتر) من دوكسوروبيسين ، وهو دواء علاجي كيميائي معروف بأنه يحفز سمية القلب المعتمدة على الجرعة (الشكل 4 ب ، اللوحة السفلية).

Figure 4
الشكل 4: التلطيخ المناعي للأنسجة الدقيقة القلبية وتقييم صلاحية الخلايا. (أ) صور مكدسة z-stack البؤرية للأنسجة الدقيقة القلبية البشرية الملطخة ب iPSC-CMs (cTnT2) و iPSC-ECs (CD31) و iPSC-CFs (DDR2) والنوى الملطخة ب (DAPI). شريط المقياس = 200 ميكرومتر (B) مخططات قياس التدفق الخلوي للأنسجة الدقيقة القلبية المهضومة إنزيميا في تعليق خلية واحدة وملطخة ب Annexin V (علامة الاستماتة) وصبغة استبعاد الخلايا الميتة (To-Pro3). أظهر تعليق الخلية الواحدة المهضوم قابلية عالية للخلية (91٪) مع <5٪ من الخلايا الماصة (اللوحة العلوية) ، مقارنة بتعليق الخلية الواحدة المعالج بدواء العلاج الكيميائي المبرمج ، Doxorubicin ، لمدة 1 ساعة بتركيز 5 ميكرومتر (اللوحة السفلية). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تحليل الانقباض الحسابي
يمكن إجراء تحليلات الانقباض للأنسجة الدقيقة القلبية الفردية بمساعدة أداة تحليل الصور المستندة إلى MATLAB. تم الحصول على تسجيلات فيديو للأنسجة الدقيقة القلبية التي تضرب تلقائيا بمعدل 30 إطارا في الثانية للتحليل. كما هو موضح سابقا11 ، تستخدم طريقة مطابقة الكتلة خوارزمية تتبع الحركة لالتقاط حركة كتلة من وحدات البكسل لإجمالي الإطارات المكتسبة كسلسلة زمنية من متجهات الحركة. يولد انقباض الأنسجة الدقيقة وحركة المتجهات خريطة حرارية زائفة توضح متوسط أو متوسط ملف الانكماش عبر الأنسجة الدقيقة (الشكل 5A). تولد الحركة الانقباضية للأنسجة الدقيقة القلبية قمم موجبة تقاس على أنها سرعة الانقباض (الدائرة الزرقاء) ، وسرعة الاسترخاء (المثلث الأحمر) ، ومعدل الضرب ، ويتم حساب آخرها على أنه الوقت بين دورتي انقباض (الشكل 5B). علاوة على ذلك ، لا يتغير انقباض الأنسجة الدقيقة القلبية بشكل كبير على مدار 4 أسابيع في الثقافة (الشكل 5C).

Figure 5
الشكل 5: تحليل انكماش الأنسجة الدقيقة القلبية. (أ) صورة تباين المرحلة وخريطة انكماش الأنسجة الدقيقة القلبية 1 أسبوع بعد التصنيع. شريط المقياس = 200 ميكرومتر (B) تظهر الأنسجة الدقيقة القلبية ملامح انكماش واسترخاء منتظمة ومعدلات ضرب. يوضح الجدول القيم التمثيلية لمعدل الفوز، والحد الأقصى للانكماش، وسرعات الاسترخاء. (ج) لا تؤثر زراعة الأنسجة الدقيقة القلبية على المدى الطويل لمدة تصل إلى 4 أسابيع بشكل كبير على معلمات الانقباض (n = 20 / group). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لتوليد أنسجة دقيقة للقلب من iPSC-CMs و iPSC-ECs و iPSC-CFs المتمايزة مسبقا ، من الضروري الحصول على ثقافة نقية للغاية للتحكم بشكل أفضل في أعداد الخلايا بعد ضغط الخلايا المثبط للاتصال داخل الأنسجة الدقيقة القلبية. في الآونة الأخيرة ، جياكوميلي وآخرون. وقد أثبتت al.18 تصنيع الأنسجة الدقيقة القلبية باستخدام iPSC-CMs و iPSC-ECs و iPSC-CFs. تتكون الأنسجة الدقيقة القلبية التي يتم إنشاؤها باستخدام الطريقة الموصوفة من حوالي 5000 خلية (70٪ iPSC-CMs و 15٪ iPSC-ECs و 15٪ iPSC-CFs). في هذه الطريقة ، تم تمييز كل من الخلايا العضلية القلبية والخلايا البطانية بشكل مشترك متبوعا بفصل السلف البطاني باستخدام علامة CD34 +. يتكون البروتوكول الحالي الموصوف هنا من 12000 خلية (70٪ iPSC-CMs ، و 20٪ iPSC-ECs ، و 10٪ iPSC-CFs) لكل نسيج دقيق ، مما ينتج عنه أعداد خلايا أعلى لكل بناء لتحليلات الخلية الواحدة في نهاية المطاف. علاوة على ذلك ، نظرا لأن جميع أنواع الخلايا الثلاثة يتم تمييزها بشكل منفصل ، فهناك عدم تجانس محدود في مجموعات الخلايا التي تنفرد بفهم الاستجابات الخاصة بالخلايا للعلاجات.

من أجل تمايز الخلايا العضلية القلبية، سبق لنا ولغيرنا أن أثبتنا اشتقاق الخلايا العضلية القلبية النقية باستخدام ظروف الثقافة المحددة كيميائيا12،19،20. باختصار ، يبدأ التمايز بتحريض الأديم المتوسط ، يليه تعديل إشارات Wnt / β-catenin التي تعزز مواصفات سلالة القلب. مزيد من تنقية الخلايا العضلية القلبية في وسط محروم من الجلوكوز يسمح بالقضاء على الخلايا العضلية غير القلبية. هنا ، من المهم ملاحظة أن الثقافة المطولة في وسط التنقية يمكن أن تعيق جودة الخلايا العضلية القلبية. يظهر بروتوكول نشر مؤخرا أن القدرة التكاثرية للخلايا العضلية القلبية في المراحل المبكرة يمكن تسخيرها للحصول على عدد كبير من الخلايا. يتم تحفيز توسع iPSC-CMs البشري مع إعادة إدخال CHIR ، وهو ميتوجين قوي خلال المرحلة التكاثرية المبكرة21. على الرغم من أن الآلية الجزيئية الدقيقة لا تزال غير معروفة ، إلا أن هذه التقنية يمكن أن تحسن بشكل كبير من إنتاجية iPSC-CM بمقدار عشرة أضعاف أو مائة ضعف. علاوة على ذلك، لتحسين دقة iPSC-CMs لنمذجة الأمراض، يمكن استزراعها في وسط نضج لتعزيز النضج الكهروفسيولوجي والميكانيكي والهيكلي22. تتم مراجعة نظرة عامة شاملة على تقنيات نضج iPSC-CM في مكان آخر23.

تم توليد الخلايا البطانية الوعائية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات ذات الكفاءات المتغيرة المختلفة للتنقية13،24،25. يوفر البروتوكول الحالي كفاءة تمايز عالية واختيار iPSC-ECs المستقرة ظاهريا مع MACS26. تتبع منهجية التمايز لتوليد الخلايا الليفية القلبية الوظيفية تعديل مسار Wnt وإشارات عامل نمو الخلايا الليفية (FGF) لتوليد iPSC-CFs17. في الجسم الحي تنشأ CFs من epicardium و endocardium و propretors العصبية16،27،28،29. هنا ، يتم إنشاء سلالة التليف الكيسي من أسلاف القلب الملتزمين في الجلد المتوسط دون توليد خلايا فوق القلب كوسيط. بشكل عام ، تأخذ البروتوكولات الموضحة هنا لإنشاء iPSC-CMs و iPSC-ECs و iPSC-CFs في الاعتبار سهولة التكرار والنقاء العالي بناء على خصائص النمط الظاهري. للحصول على أنسجة دقيقة عالية الجودة ، من المهم الحصول على نقاء >90٪ لكل نوع من أنواع الخلايا الفردية. كما سيضمن النقاء العالي في النمط الظاهري الخلوي الكشف عن التغيرات في المسار الخلوي بسبب العلاجات المختلفة.

بعد الاشتقاق الناجح لجميع أنواع الخلايا الثلاثة ، يتم توزيع الخلايا بعناية في غرفة بذر الأغاروز للسماح باستقرار الخلايا في الاستراحات الدائرية. تشمل المعلمات الحرجة تحقيق تعليق متجانس للخلية الواحدة ومنع مجاميع الخلايا أو الكتل التي قد تسبب تباينا في توزيع حجم الأنسجة الدقيقة القلبية. من منظور الهيكل العام ، غالبا ما تكون التركيبات 3D محدودة بنشر العناصر الغذائية ، ومع زيادة كثافة الخلية ، يزداد حجم وسمك التركيبات خطيا أيضا. الهياكل الهندسية للأنسجة في شكل هياكل كروية لها معدل استهلاك موحد للمغذيات بسبب الانتشار متساوي التروبيا والمسافة الثابتة من القلب إلى السطح30,31. الحجم النهائي للأنسجة الدقيقة يملي تدرج تركيز العناصر الغذائية وانتشار الأكسجين إلى المركز. في نظام الزراعة الثابتة ، قد تؤدي الإنشاءات التي تزيد عن 350-400 ميكرومتر إلى قلب خلية نخرية عند استزراعها على مدى فترات زمنية أطول. وبالتالي ، ينبغي النظر بعناية في كثافة البذر. أحد القيود المفروضة على نموذج الأنسجة الدقيقة القلبية هو أنه لا يسمح بمحاذاة الخلايا العضلية القلبية التي توفرها المنهجيات التي تنطوي على الحبس الهندسي للخلايا المفردة. وبالتالي ، فإن القياس الكمي للمعلمات مثل محاذاة الساركومير أو الطول لا يزال محدودا بسبب التجميع الخلوي العشوائي متعدد الأبعاد. وعلى الرغم من القيود، تسمح هذه التقنية بإجراء تقييم سريع يعتمد على الجرعة لسمية الأدوية أو الجزيئات الصغيرة على خلايا القلب والأوعية الدموية32. في دراسة حديثة ، استخدمنا الأنسجة الدقيقة ثلاثية الأبعاد المكونة من iPSC-CMs لنمذجة اعتلال عضلة القلب الثانوي الناجم عن الحمل الزائد للحديد ، ولاحظنا انخفاضا كبيرا في حجم الأنسجة الدقيقة بسبب التركيز العالي للعلاج بالحديد 33.

فيما يتعلق بالتلطيخ المناعي ، على عكس ثقافات 2D ، فإن النفاذية الأطول ومدة حضانة الأجسام المضادة الأولية ضرورية للسماح بنشر الأجسام المضادة في جميع أنحاء الأنسجة الدقيقة. قد يتطلب وقت الحضانة لاختراق الأجسام المضادة الكافي مزيدا من التحسين للأنسجة الدقيقة التي يزيد قطرها عن ~ 400 ميكرومتر. جانب آخر مهم هو خطوة الحجب الأطول مع بروتينات المصل لتقليل التألق في الخلفية الناتج عن الربط غير المحدد. عادة ، يفضل مصل مانع يحتوي على مستويات عالية من IgG ، مثل مصل الماعز أو الحمار. من أجل الحفاظ على السلامة الهيكلية للأنسجة الدقيقة القلبية ، لم نبحث عن البروتينات المشاركة في تفاعلات محددة بين الخلايا والخلايا وصيانتها خلال فترة الزرع. بالنسبة للتنميط الظاهري الخلوي ، يجب هضم الأنسجة الدقيقة خلال فترة زمنية قصيرة لضمان بقاء الخلايا العالية والحفاظ على المستضدات المستهدفة خارج الخلية. مزيج من الهضم الأنزيمي والاضطراب الميكانيكي مع طرف ماصة واسع التجويف يسمح بمعالجة فعالة وخفيفة للأنسجة الدقيقة أثناء عملية الهضم. يمكن استخدام الخلايا المفردة القابلة للحياة عالية الجودة التي تم الحصول عليها من خلال بروتوكول الهضم السريع هذا لتوضيح التفاعلات المعقدة بين الخلايا البيولوجية والخلايا بمساعدة scRNA-seq34,35,36.

بالإضافة إلى التوصيف المورفولوجي والهيكلي ، من المهم تقييم الخصائص الوظيفية للأنسجة الدقيقة القلبية لتقييم فعالية وسمية وحالة المرض لتجميع الأنسجة في المختبر. التحليل الكمي لتقلص الأنسجة هو معلمة ذات صلة لتقييم وظيفة القلب. مكنت العديد من تقنيات الفحص المجهري بالفيديو غير الغازية جنبا إلى جنب مع خوارزميات تتبع الحركة من المراقبة في الوقت الفعلي مع مقياس قوي لتقلص أنسجة القلب المرتبط بخصائص النمط الظاهري. لتحديد التغيرات في النمط الظاهري ، يمكن الحفاظ على الأنسجة الدقيقة القلبية في المختبر لمدة تصل إلى 4 أسابيع دون تغييرات كبيرة في معلمات الانقباض. تعمل معظم خوارزميات البرامج على مبادئ التدفق البصري ورسم الخرائط المتجهة ، والتي يتم تركيبها على سلسلة من إطارات الفيديو الملتقطة 11،37،38. قد يؤدي تحليل التدفق البصري إلى اكتشاف القطع الأثرية. وبالتالي ، يجب على المستخدم تجنب أو تقليل الاضطرابات المحيطة غير المقصودة التي يمكن أن تؤدي إلى حركة العينة أو الاهتزازات المنقولة إلى مرحلة المجهر. تجدر الإشارة إلى أن تحليلات الانقباض قد لا تكشف عن التوتر السلبي أو تأثيرات التحميل بسبب الشكل المعلق للأنسجة الدقيقة ، على عكس الأنسجة الدقيقة التي تتشكل بين الوظائف المرنة للصلابة المحددة مسبقا. ومع ذلك ، في كلتا الحالتين ، من المهم ملاحظة أن ملامح تقلص أنسجة عضلة القلب المهندسة لا تحقق قوى الانكماش المتولدة على مستوى العضو. المزايا الرئيسية للفحوصات القائمة على الصور هي أنها غير مدمرة وتسمح بقياس التعرض الحاد والمزمن للأدوية دون معايرة واسعة النطاق. يمكن تطبيق هذه الأدوات على مجموعة متنوعة من منصات 2D و 3D لقياس التغيرات في انقباض القلب بسبب العلاجات أو الأمراض الوراثية الكامنة ، وتقييم استراتيجيات نضج الأنسجة. قد يتضمن التحقيق المستقبلي لنموذج الأنسجة الدقيقة هذا الجمع بين القياسات الكهروفسيولوجية التي ستسمح بالتسجيل المتزامن للأصباغ الحساسة للكالسيوم أو الجهد للحصول على تسجيلات مستقلة متعددة لكل نسيج دقيق في صفيف بطريقة عالية الإنتاجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

J.C.W. هو أحد مؤسسي Khloris Biosciences ولكن ليس لديه مصالح متنافسة ، لأن العمل المعروض هنا مستقل تماما. المؤلفون الآخرون لا يبلغون عن أي تعارضات.

Acknowledgments

نشكر الدكتورة أماندا تشيس على ملاحظاتها المفيدة على المخطوطة. وقدم الدعم التمويلي برنامج بحوث الأمراض المتصلة بالتبغ التابع لجامعة كاليفورنيا، T29FT0380 (D.T) و 27IR-0012 (J.C.W.)؛ جمعية القلب الأمريكية 20POST35210896 (H.K.) و 17MERIT33610009 (J.C.W.) ؛ والمعاهد الوطنية للصحة (NIH) R01 HL126527 و R01 HL123968 و R01 HL150693 و R01 HL141851 و NIH UH3 TR002588 (J.C.W).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plates Fisher Scientific 08-772-29
3D micro-molds Microtissues 12-81 format
6-well plates Fisher Scientific 08-772-1B
AutoMACS Rinsing Solution Thermo Fisher Scientific NC9104697
B27 Supplement minus Insulin Life Technologies A1895601
B27 Supplement plus Insulin Life Technologies 17504-044
BD Cytofix BD Biosciences 554655
BD Matrigel, hESC-qualified matrix BD Biosciences 354277
Cardiac Troponin T Antibody Miltenyi 130-120-403
CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads Miltenyi 130-097-857
CD31 Antibody Miltenyi 130-110-670
CD31 Microbeads Miltenyi 130-091-935
CHIR-99021 Selleckchem S2924
DDR2 Santa Cruz Biotechnology sc-81707
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI Thermo Fisher Scientific V13242
Dispase I Millipore Sigma 4942086001
DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium 11960044
DMEM/F-12 basal medium Gibco 11320033
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium Life Technologies 14190-136
EGM2 BulletKit Lonza CC-3124
Fetal bovine serum Life Technologies 10437
FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit LifeLIne Cell Technology LS-1010
Glucose free RPMI medium Life Technologies 11879-020
Goat serum Life Technologies 16210-064
Human FGF-basic Thermo Fisher Scientific 13256029
Human VEGF-165 PeproTech 100-20
IWR-1-endo Selleckchem S7086
Liberase TL Millipore Sigma 5401020001
LS Sorting Columns Miltenyi 130-042-401
MACS BSA Stock solution Miltenyi 130-091-376
MACS Rinsing Buffer Miltenyi 130-091-222
MidiMACS Separator Miltenyi 130-042-302
RPMI medium Life Technologies 11835055
SB431542 Selleckchem S1067
TO-PRO 3 Thermo Fisher Scientific R37170
Triton X-100 Millipore Sigma X100-100ML
TrypLE Select 10X Thermo Fisher Scientific red
Vimentin Alexa Fluor® 488-conjugated Antibody R&D Systems IC2105G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neofytou, E., O'Brien, C. G., Couture, L. A., Wu, J. C. Hurdles to clinical translation of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 125 (7), 2551-2557 (2015).
  2. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
  3. Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 156166 (2018).
  4. Yin, X., Mead, B. E., Safaee, H., Langer, R., Karp, J. M., Levy, O. Engineering stem cell organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
  5. Giacomelli, E., et al. Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells. Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).
  6. Kurokawa, Y. K., George, S. C. Tissue engineering the cardiac microenvironment: Multicellular microphysiological systems for drug screening. Advances in Drug Delivery Reviews. 96, 225-233 (2016).
  7. Cartledge, J. E., et al. Functional crosstalk between cardiac fibroblasts and adult cardiomyocytes by soluble mediators. Cardiovascular Research. 105 (3), 260-270 (2015).
  8. Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac non-myocyte cells show enhanced pharmacological function suggestive of contractile maturity in stem cell derived cardiomyocyte microtissues. Toxicology Science. 152 (1), 99-112 (2016).
  9. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Developmental Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
  10. Brutsaert, D. L. Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity. Physiological Reviews. 83 (1), 59-115 (2003).
  11. Huebsch, N., et al. Automated video-based analysis of contractility and calcium flux in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured over different spatial scales. Tissue Engineering Part C Methods. 21 (5), 467-479 (2015).
  12. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  13. Gu, M., et al. Pravastatin reverses obesity-induced dysfunction of induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells via a nitric oxide-dependent mechanism. European Heart Journal. 36 (13), 806-816 (2015).
  14. Williams, I. M., Wu, J. C. Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).
  15. Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. , Springer. New York. 1-7 (2020).
  16. Zhang, H., et al. Generation of quiescent cardiac fibroblasts from human induced pluripotent stem cells for in vitro modeling of cardiac fibrosis. Circulation Research. 125 (5), 552-566 (2019).
  17. Zhang, J., et al. Functional cardiac fibroblasts derived from human pluripotent stem cells via second heart field progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2238-2315 (2019).
  18. Giacomelli, E., et al. Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3d cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease. Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).
  19. Burridge, P. W., Holmström, A., Wu, J. C. Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 87 (1), 1-15 (2015).
  20. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  21. Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
  22. Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
  23. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: Advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  24. Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Development. 20 (10), 1701-1710 (2011).
  25. Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Report. 3 (5), 804-816 (2014).
  26. Gu, M. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial cells. Current Protocols in Human Genetics. 98 (1), 64 (2018).
  27. Acharya, A., et al. The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors. Development. 139 (12), 2139-2149 (2012).
  28. Wessels, A., et al. Epicardially derived fibroblasts preferentially contribute to the parietal leaflets of the atrioventricular valves in the murine heart. Development Biology. 366 (2), 111-124 (2012).
  29. Ali, S. R., et al. Developmental heterogeneity of cardiac fibroblasts does not predict pathological proliferation and activation. Circulation Research. 115 (7), 625-635 (2014).
  30. McMurtrey, R. J. Analytic and numerical models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids. Tissue Engineering Part C Methods. (3), 221-249 (2015).
  31. Thomas, D., O'Brien, T., Pandit, A. Toward customized extracellular niche engineering: progress in cell-entrapment technologies. Advanced Materials. 30 (1), 1703948 (2018).
  32. Thomas, D., Shenoy, S., Sayed, N. Building Multi-dimensional induced pluripotent stem cells-based model platforms to assess cardiotoxicity in cancer therapies. Front Pharmacol. 12, 39 (2021).
  33. Rhee, J. -W., et al. Modeling secondary iron overload cardiomyopathy with human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (2), 107886 (2020).
  34. Paik, D. T., Cho, S., Tian, L., Chang, H. Y., Wu, J. C. Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease, and medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (8), 457-473 (2020).
  35. Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108 (2018).
  36. Lau, E., Paik, D. T., Wu, J. C. Systems-wide approaches in induced pluripotent stem cell models. Annual Reviews in Pathology. 14 (1), 395-419 (2019).
  37. Maddah, M., et al. A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing. Stem Cell Report. 4 (4), 621-631 (2015).
  38. Sala, L., et al. Musclemotion: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), 5-16 (2018).

Tags

الهندسة الحيوية ، العدد 169 ، iPSC ، الخلايا العضلية القلبية ، الخلايا البطانية ، الخلايا الليفية ، الأنسجة الدقيقة ، التجميع الذاتي
تصنيع صفائف الأنسجة الدقيقة القلبية 3D باستخدام الخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC البشرية ، والخلايا الليفية القلبية ، والخلايا البطانية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thomas, D., Kim, H., Lopez, N., Wu,… More

Thomas, D., Kim, H., Lopez, N., Wu, J. C. Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (169), e61879, doi:10.3791/61879 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter