Summary
该协议从动物和人类受试者的粪便样本中分离出高质量的总RNA。商业 miRNA 分离试剂盒具有显著适应性，以优化数量和质量分离纯 RNA。RNA分离株适用于大多数下游RNA检测，如测序、微阵列和RT-PCR。
Abstract
越来越清楚的是，RNA存在于动物和人类的肠腔和粪便中。下面描述的方案从动物和人类受试者的粪便样本中分离出包括microRNA在内的总RNA。目的是分离高纯度和高数量的总RNA，用于下游分析，如RNA测序、RT-PCR和微阵列。这种优化方案在miRNA分离中的优势在于能够通过描述的额外洗涤步骤分离高度纯化的RNA产物，通过改进的样品重悬方法增加获得的RNA数量，以及重要的去污技巧。一个限制是无法处理和纯化超过200 mg的较大样品，因为这些样品量会导致界面的清晰形成困难。因此，大样品量可能会污染方案中描述的待提取水相，有机物会影响最终分离的RNA的质量。然而，从高达 200 mg 的样品中分离出的 RNA 足以用于大多数下游分析。
Introduction
细胞外RNA被认为是介导许多生物过程的重要因素1。粪便中的细胞外RNA于2008年首次被报道为结肠癌和活动性溃疡性结肠炎2的标志物，最近发现它是肠腔和粪便的正常成分，并介导宿主 -微生物通讯3，4，5。该RNA分离方案的目的是从动物和人类受试者的粪便样品中提取高质量的细胞外RNA。该方案改编自商业miRNA分离试剂盒。采集的 RNA 用于下游分析，如 RNA 测序、RT-PCR 和微阵列。该协议包括几个重要且有用的技巧，以最大限度地提高动物和人类粪便中发现的RNA的数量和质量。开发和优化这种RNA（包括microRNA）分离方法的原因是减少粪便中的微生物RNA，限制研究中的变量并分析肠道中的RNA组成，而不考虑各种混杂因素和污染源。值得注意的是，这种RNA分离最大限度地减少了活细胞和活微生物（细胞RNA）释放的RNA。它侧重于由肠道细胞释放或通过食物摄入获得的细胞外RNA。原则上，该方法不适用于研究微生物转录组的研究。
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Protocol
这里描述的所有涉及研究动物的方法均已获得哈佛医学院布莱根妇女医院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
此处描述的所有涉及人类研究主题的方法均符合合作伙伴人类研究委员会制定的指导方针。
1. 粪便样本采集
- 高压灭菌或为实验中的每个动物受试者制备带有螺旋盖的无菌且无核酸酶的 2 mL 微量离心管。
- 对于人类受试者，为每个受试者提供适当的、无核酸酶的无菌粪便标本采集装置。
- 在无菌环境中从每个动物受试者收集25-100mg（小鼠粪便样品约1-4个粪便颗粒）粪便样品。
注意：两个或多个粪便颗粒（~50mg或更重）是获得最高纯度RNA的首选。- 利用所有必要的个人防护设备 （PPE） 和材料，例如：一副实验室手套、消毒喷雾剂和无菌纸巾，对放置动物研究对象的工作区域进行消毒，以避免粪便样本污染。
- 对于人类受试者，指示每个研究对象/收集者在尽可能无菌的环境中收集100-200毫克粪便样本。使用标准无菌操作，避免粪便样本污染。
- 利用所有必要的个人防护设备 （PPE） 和材料，例如：一副实验室手套、消毒喷雾剂和无菌纸巾，对放置动物研究对象的工作区域进行消毒，以避免粪便样本污染。
- 将每个动物受试者的粪便样本直接收集到带有螺旋盖的 2 mL 微量离心管中，不要接触任何其他表面以避免污染。
- 对于人类受试者，指示每个受试者直接排便到提供的适用收集装置（例如，无菌粪便标本采集套件）中以避免污染。
注意：指示受试者避免被马桶表面、水、尿液或任何其他非无菌表面/物体污染。
- 对于人类受试者，指示每个受试者直接排便到提供的适用收集装置（例如，无菌粪便标本采集套件）中以避免污染。
- 立即在-80°C下冷冻收集在2 mL微量离心管中的粪便样品，或在粪便重悬之前放入干冰桶中以获得更好的RNA数量和质量，如下所述。
- 对于人类粪便标本，将每个200mg的新鲜标本等分到带螺旋盖的2mL微量离心管中，并在粪便重悬之前将其冷冻至-80°C，如下所述。
- 对于不在带螺旋盖的 2 mL 微量离心管中的粪便标本的储存，在粪便重悬之前，称量每个冷冻标本 100-200 mg 并将其转移到单独的带螺旋盖的 2 mL 微量离心管中，如下所述。
注意：对于人类粪便标本，请避免服用超过200毫克的粪便标本进行RNA分离，因为它可能会在以下步骤中造成困难。将超载样品放入 2 mL 微量离心管中时，水相、有机相和中间相可能无法清晰形成和分离。该过程可以在此处暂停。
- 对于不在带螺旋盖的 2 mL 微量离心管中的粪便标本的储存，在粪便重悬之前，称量每个冷冻标本 100-200 mg 并将其转移到单独的带螺旋盖的 2 mL 微量离心管中，如下所述。
- 对于人类粪便标本，将每个200mg的新鲜标本等分到带螺旋盖的2mL微量离心管中，并在粪便重悬之前将其冷冻至-80°C，如下所述。
2. 洗涤液的制备
- 将 21 mL 美国化学学会 （ACS） 级 100% 乙醇加入 miRNA 分离试剂盒中提供的洗涤溶液 1（参见 材料表）中，以达到 30 mL 的最终体积，如瓶子上所示。涡旋直到所有东西都溶解在瓶子里。
- 将 40 mL ACS 级 100% 乙醇加入提供的洗涤溶液 2/3 中，以达到 50 mL 的最终体积，如瓶子上所示。涡旋5秒或直到最终混合物充分混合。
3. 设备和材料的准备
- 用核糖核酸酶（RNase）去污溶液（例如市售RNase去污溶液）喷洒工作区域和设备，例如：实验室工作台、化学通风橱和微量离心管架。为避免污染，请在必要时随时随地将RNase去污溶液涂抹在表面上。
- 穿上干净的实验室外套，戴上口罩，戴上适当的实验室手套，以保护粪便样品中的RNA免受人体皮肤上存在的核酸酶的影响。用RNase去污溶液喷洒手套，并经常更换手套以避免污染。
- 为储存在-80°C的粪便样品准备一桶干冰，以防止在粪便重悬之前解冻，并为材料准备一桶冰，例如：酸苯酚：氯仿，以延长保质期。
注意：确保材料（包括协议中使用的培养基）是无菌的，没有核酸酶污染。
4.粪便重悬
- 将 25-100 mg 粪便样品重悬于 600 μL 无菌 1x Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 中。
注意：粪便样品从-80°C解冻时应立即处理，甚至不部分解冻，以尽量减少RNA酶和细胞RNA的释放，因为当样品中的细胞解冻时，冰晶会破裂内部和外部细胞区室。- 在室温 （RT） 下将 600 μL 1x DPBS 加入带有螺旋盖的 2 mL 微量离心管中，其中包含粪便样品。
- 将粪便样品混合物浸没在 600 μL 1x DPBS 中，在室温下盖上盖子的 2 mL 微量离心管中孵育 30 分钟。
- 用 1 mL 移液器吸头捣碎重悬混合物，并在盖上 2 mL 微量离心管的情况下涡旋良好。为了优化和增加RNA的数量和质量，用均质机重悬混合物，并在S4000（或4000rpm）和45秒下设置一个循环。
5. 有机萃取
注意：使用危险化学品通风柜进行以下步骤，直到步骤6使用酸苯酚：氯仿和ACS级100%乙醇，因为它们具有毒性和易燃性。处理危险材料时，请根据需要更换个人防护装备，并遵循适当的标准预防措施。
- 用 600 μL 酸性苯酚：氯仿提取 RNA（所需的酸性苯酚：氯仿的体积等于步骤 4.1 中加入的 1x DPBS 的初始体积）。
- 向步骤 4.1 中的悬浮液中加入 600 μL 酸苯酚：氯仿。
注意：从瓶子的下相取出酸苯酚：氯仿从瓶子的下相中取出，因为上相与水性缓冲液混合。如果这两个相之间的中间相受到干扰，则仅当中间相重新建立以避免污染时，才等待并取出酸苯酚：氯仿。
- 向步骤 4.1 中的悬浮液中加入 600 μL 酸苯酚：氯仿。
- 将混合物涡旋60秒以彻底混合。或者，为了优化和增加产量中RNA的数量，使用均质器混合，在S4000和45 s下设置一个循环。
- 在室温下以10，000× g 离心15分钟，用微量离心机分离水相和有机相。离心后，界面应紧凑。如果没有，请重复离心。
注意：如果由于初始体积与添加的酸苯酚：氯仿的体积比在多次重复离心后无法达到预期的那样紧凑，请继续回收水相，更加小心以避免污染。 - 回收水相并将其转移到带有铰链盖的新 2 mL 微量离心管中（miRNA 分离试剂盒不提供）。
- 小心地取出水相（或上相），不要干扰下相，并将其转移到带有铰链盖的新 2 mL 微量离心管中。注意转移的体积（例如，~500 μL）。
注意：当中间相致密且上层相明显分离时，水相顶部可能漂浮着一些微小的残留颗粒。小心移液以避免这些残留物，并且仅恢复可见且清晰分离的水相，以确保高质量的RNA产量，即使您只能获得少量的水相。
- 小心地取出水相（或上相），不要干扰下相，并将其转移到带有铰链盖的新 2 mL 微量离心管中。注意转移的体积（例如，~500 μL）。
6. 最终RNA分离
- 向 2 mL 微量离心管中的水相中加入 1.25 体积的 RT ACS 级 100% 乙醇（例如，如果从步骤 5.4 中回收 500 μL 水相，则加入 625 μL 100% 乙醇）。涡旋3秒。
- 通过miRNA分离试剂盒中提供的滤芯加载水相/乙醇混合物。
- 对于每个样品，将滤芯放入试剂盒提供的收集管之一中。
- 移液并将 600 μL 水相/乙醇混合物上样到滤芯中。
注意：移液前短暂涡旋混合物，将乙醇与水相彻底混合。一次上样的水相/乙醇混合物不得超过 700 μL。
- 移液并将 600 μL 水相/乙醇混合物上样到滤芯中。
- 以 10，000 x g 离心 90 秒以过滤混合物。以更高的速度旋转可能会损坏过滤器。
- 弃去滤液并重复步骤6.2.1至6.2.2，直到所有混合物在连续应用中通过相同的滤膜过滤。保留并重复使用相同的收集管进行下面的洗涤步骤。
- 用 700 μL miRNA 洗涤溶液 1 洗涤过滤器。
注意：miRNA 洗涤液 1 含有硫氰酸胍，可引起皮肤刺激和严重眼睛损伤。穿戴必要的个人防护用品，例如：手套、面罩、实验室防护服。必要时经常更换手套。- 将 700 μL miRNA 洗涤溶液 1（用 ACS 级 100% 乙醇制备的工作溶液）涂入滤芯中。
- 离心60秒，通过滤芯过滤miRNA洗涤溶液1。
- 从收集管中丢弃滤液，并将相同的滤芯放入同一收集管中。
- 用洗涤溶液 2/3 洗涤过滤器，每次一次，体积分别为 700 μL、500 μL 和 250 μL。
- 将 700 μL 洗涤溶液 2/3（用 ACS 级 100% 乙醇制备的工作溶液）加入滤芯中。
- 以10，000× g 离心1分钟。
- 从收集管中丢弃滤液，并将相同的滤芯放入同一收集管中。
- 将 500 μL 洗涤溶液 2/3 加入滤芯中。
- 以10，000× g 离心1分钟。
- 从收集管中丢弃滤液，并将相同的滤芯放入同一收集管中。
- 将 250 μL 洗涤溶液 2/3 加入滤芯中。
- 以10，000× g 离心1分钟。
- 从收集管中丢弃滤液。
- 将滤芯转移到新的收集管中，旋转组件5分钟以去除过滤器中的残留液体。
- 将 700 μL 洗涤溶液 2/3（用 ACS 级 100% 乙醇制备的工作溶液）加入滤芯中。
- 对于每个样品，将滤芯放入试剂盒提供的收集管之一中。
7. 用 50 μL 无核酸酶水洗脱 RNA
- 将滤芯转移到新的收集管中。将 50 μL 无核酸酶水移液到过滤器中心并盖上收集管。
- 在室温下孵育10分钟。
- 以8，000 x g 旋转5分钟，将RNA回收到新的收集管中。
- 使用荧光计测定回收粪便RNA的浓度和纯度。回收的粪便RNA可以储存在-80°C。
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Representative Results
分别从50 mg小鼠粪便样品（2个小鼠粪便沉淀）和100 mg人粪便标本中分离代表性RNA，并在50 μL无核酸酶水中洗脱。分光光度计对浓度的分析表明，分别分离出49μg和16μgRNA的总量（表1）。如 ~2.0 的 A260/A280 比值和 ~1.8 的 A260/A230 比值所示，RNA 纯度很高（表 1）。如报告3所示，粪便中的大多数RNA是microRNA，这些microRNA可以存在于外泌体中。与此一致，基于芯片的RNA电泳测定表明，来自小鼠和人类粪便的代表性RNA分离物在18S和28S rRNA组成中含量低或缺乏，并且RNA分离物的大小落在小RNA区域（图1A）。使用基于芯片的电泳进行进一步的小RNA电泳显示，大部分RNA具有microRNA大小（图1B）。这与使用小型RNA生物分析仪完成的定量与先前测定获得的定量相当的观察结果一致6。
| 样品编号 | 洗脱体积（μL） | 核糖核酸浓度（纳克/微升） | A260/A280 | A260/A230 | 产量（纳克） |
| 鼠 | 50 | 978.333 | 2.036 | 1.897 | 48916.65 |
| 人 | 50 | 330.759 | 1.981 | 1.849 | 16537.95 |
表1：使用该协议分离的RNA的代表性纳米滴分析。 从2个小鼠粪便颗粒或100 mg人粪便标本中分离代表性RNA，在50 μL无核酸酶水中洗脱。用纳米滴测量RNA浓度，A260/A280的比率和A260/A230的比率。
图 1：粪便 RNA 分离株大小分布的代表性芯片电泳分析。 （A）使用基于芯片的电泳测定法对使用此处描述的方案从2个小鼠粪便颗粒（左图）和100mg人粪便标本（右图）中分离的代表性RNA。该测定表明大多数RNA分离株是小RNA。（B）然后使用基于芯片的电泳系统对分离株进行小RNA电泳，以分析分离株的尺寸分布。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
重要的是使用无RNase技术来防止分离过程中的RNase污染7。离心并形成致密界面后，在回收水相时，关键是要避免中间相、下层相和颗粒污染物漂浮在水相顶部。此外，还添加了 500 μL 和 250 μL 洗涤溶液 2/3 的两个洗涤步骤，以消除滤膜中的污染物，从而优化质量。此外，不建议使用超过200 mg的起始样品材料，因为它可能会在中间相的明确形成中造成困难。同样，不建议使用小于25 mg的样品材料，因为它可能不足以提取足够的RNA样品进行下游分析。
微生物组研究的惊人增长推动了微生物物种、基因的测量，以微生物谱的宏转录研究8。粪便中的MicroRNA已被研究为疾病的标志物9，10，11。自从粪便microRNA介导宿主-微生物相互作用的首次报道3以来，越来越多的研究开始调查宿主和饮食在肠道生态系统中的贡献12，13，14。值得注意的是，由于肠腔和粪便中微生物的丰富性，专注于宿主 - 微生物相互作用的宿主臂的研究需要来自微生物的最小RNA污染。因此，包括细胞裂解步骤15的RNA提取方案对于研究从宿主和饮食释放的RNA并不理想。因此，我们调整了该协议以消除裂解步骤，以最大程度地减少粪便中活细菌和活宿主细胞对RNA的污染。
该协议适用于粪便或肠腔内容物中的细胞外RNA是感兴趣目标的研究。使用该协议分离的RNA是总RNA，包括microRNA作为主要成分。该方案不区分RNA是外泌体，微囊泡还是无囊泡形式。
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Disclosures
作者声明与本协议论文中描述的研究方法无关的相关或重大经济利益。
Acknowledgments
我们得到了哈佛医学院生物聚合物设施的生物分析仪技术援助。这项工作得到了国家多发性硬化症协会研究资助RG-1707-28516（H.L.W.和S.L.）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Thermo Fischer Scientific | AM9720 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-144 | |
| Gloves | |||
| Microcentrifuge | |||
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1561 | |
| Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL) | |||
| Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated) | Thermo Fischer Scientific | AM9937 | |
| Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter) | |||
| PowerLyzer 24 Homogenizer | QIAGEN | 13155 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fischer Scientific | AM9780 | |
| Vortex Shaker |
References
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