Summary
Nous présentons des détails des procédures de laboratoire pour l’activation in vitro drogue-libre (IVA) des follicules ovariens pour des patients présentant le dysfonctionnement ovarien grave. Cette méthode pourrait augmenter le nombre d’ovocytes récupérables par hyperstimulation ovarienne et bénéficier de la préservation de la fertilité pour ces patients.
Abstract
La fonction ovarienne diminue progressivement pendant le vieillissement et dans quelques conditions pathophysiologiques comprenant l’anomalie de karyotype, les maladies autoimmunes, les chemo- et les radiations-thérapies, aussi bien que des chirurgies ovariennes. Chez les femmes célibataires atteintes d’un dysfonctionnement ovarien grave, la préservation de la fertilité est importante pour les grossesses futures. Bien que la cryoconservation d’oocyte soit une méthode établie pour la conservation de fertilité, ces patients pourraient seulement préserver un nombre limité d’oocytes même après hyperstimulation ovarien, menant aux stimulations répétées pour assurer les oocytes suffisants pour garantir la grossesse future. Pour résoudre ce problème, nous avons récemment développé une procédure d’activation in vitro sans médicament (IVA), qui nous permet de stimuler les premiers stades des follicules ovariens à se développer au stade follicule préantral. Ces follicules préantraux peuvent répondre au protocole unique de la stimulation de gonadotropin, ayant pour résultat le plus grand nombre d’oocytes récupérés par stimulation ovarienne pour cryopreservation. L’IVA drogue-libre a composé de l’approche chirurgicale et de la stimulation ovarienne. Nous avons enlevé une partie du cortex d’un ou des deux ovaires des patients sous chirurgie laparoscopique. Les tissus corticaux ovariens ont été coupés en petits cubes pour perturber la voie de signalisation d’Hippo et stimuler le développement des follicules de partie. Ces cubes ont été greffés orthotropically dans les ovaires restants aussi bien que sous le serosa des deux trompes de Fallope. Nous avons déjà publié l’intervention chirurgicale de l’IVA sans drogue et le protocole de la stimulation ovarienne suivante, mais ici nous présentons les détails des méthodes de laboratoire exigées pour l’IVA sans drogue.
Introduction
La fonction ovarienne diminue progressivement pendant le vieillissement et quelques conditions pathophysiologiques comprenant l’anomalie de karyotype, les maladies autoimmunes, les chemo- et radiologiques-thérapies, et les chirurgies ovariennes. La préservation de la fertilité est l’une des meilleures options pour les femmes célibataires atteintes d’un dysfonctionnement ovarien grave afin de préserver leur potentiel pour une grossesse future. Pour la préservation de la fertilité, deux méthodes sont actuellement disponibles principalement dans le domaine de la fertilité onco. La cryoconservation des ovocytes est une procédure bien établie pour la conservation de la fertilité et de nombreux cas réussis ont été rapportés1,2. D’autre part, la cryoconservation des tissus ovariens a également été établie pour la préservation de la fertilité chez les patientes atteintes de cancer mais il s’agit toujours d’une stratégie expérimentale3,4. Dans les deux méthodes, plusieurs nombres d’ovocytes matures sont nécessaires pour que la grossesse se produise. Généralement, les patients présentant l’insuffisance ovarienne prématurée (POI), qui deviennent aménorrhée avant 40 ans, et les femmes d’une cinqévrité avec la réserve ovarienne basse ont montré la réponse ovarienne pauvre (POR) à la stimulation ovarienne pour donner les oocytes mûrs5,6,7. En outre, les jeunes patients présentant un faible nombre de follicules antraux ont également montré la POR à la stimulation ovarienne7. Ces patients ont un nombre très limité d’ovocytes récupérables même après hyperstimulation ovarienne appropriée, nécessitant ainsi de multiples procédures coûteuses pour assurer un nombre suffisant d’ovocytes pour la grossesse.
Le don d’ovocytes suivi d’une fécondation in vitro (FIV) avec transfert de sperme et d’embryons (ET) du mari est la seule option pour ces patients POI et POR qui ont des difficultés à obtenir leurs propres ovocytes8,9,10. Cependant, le don d’ovocytes est compliqué par des questions éthiques ainsi que par des complications auto-immunes et de grossesse11,12,13,14. Pour résoudre ces problèmes, l’établissement d’un traitement de l’infertilité en utilisant les propres ovocytes des patients est souhaité. Pour les patients poi, nous avons développé l’approche d’activation in vitro (IVA) pour permettre la croissance réussie des follicules et la génération d’ovocytes matures, conduisant un certain nombre de grossesses et d’accouchements15. Dans IVA, nous avons fragmenté les cortex ovariens après le retrait des ovaires sous chirurgie laparoscopique et les avons cultivés pendant deux jours pour activer les follicules par des médicaments stimulants Akt, puis effectuer une greffe hétérotopique dans des poches artificielles fabriquées sous la séreuse des trompes de Fallope sous la deuxième chirurgie laparoscopique15. Cette procédure a favorisé la croissance des follicules primordiaux, primaires et secondaires après fragmentation du cortex ovarien pour favoriser la perturbation de la signalisation Hippo16, suivie de deux jours de culture avec des stimulateurs de signalisation Akt17.
Contrairement aux cas graves de POI, les patients de POR présentant la réserve ovarienne diminuée ont les follicules secondaires multiples. Puisque la perturbation de signalisation d’hippo est seule efficace en favorisant la croissance secondaire de follicule16,nous avons récemment démontré des grossesses et des livraisons réussies pour des patients de POR utilisant le procédé sans drogue d’IVA impliquant la fragmentation corticale et la greffe orthotopic sans traitement des drogues stimulantes d’Akt. L’IVA sans médicament stimule le stade précoce des follicules ovariens à se développer jusqu’au stade follicule préantral après une seule chirurgie et a augmenté le nombre d’ovocytes récupérés pour le transfert d’embryons de FIV15,18. L’approche sans drogue d’IVA a plusieurs avantages par rapport à notre IVA originale par 1) en évitant la perte potentielle de follicule pendant la culture, 2) en minimisant l’invasiveness et les coûts de la deuxième chirurgie, 3) impliquant seulement l’alitement de poteau-chirurgie à court terme et 4) le potentiel de la grossesse spontanée due à la greffe orthotopic. Nous avons récemment publié un article vidéo montrant les procédures chirurgicales de l’IVA19 sans médicament et les protocoles détaillés de stimulation ovarienne après la chirurgie20. Ici, nous présentons les détails des méthodes de laboratoire requises pour les IVA sans drogue.
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Protocol
Le consentement éclairé écrit a été obtenu de chaque patiente de POR présentant la réserve ovarienne décroissante qui s’est inscrite dans le traitement sans drogue d’IVA. Cette étude a été approuvée par le comité d’éthique de l’Université internationale de la santé et du bien-être (no 17-S-21). L’essai clinique a été enregistré sous le numéro UMIN000034464 et réalisé conformément au Code de déontologie de l’Association médicale mondiale (Déclaration d’Helsinki).
1. Extraction du cortex ovarien
- Enlever une partie du cortex ovarien (10 x 10 mm, épaisseur de 2-3 mm) d’un ou des deux ovaires sous anesthésie générale par chirurgie laparoscopique comme décrit précédemment19,20.
- Placer les cortex ovariens recueillis dans un récipient stérile contenant 10 mL de HTF modifié (mHTF) à 37 °C.
2. Fragmentation du cortex ovarien
REMARQUE : Avant la dissection du cortex ovarien, réchauffer le mHTF à 37 °C. Maintenir des conditions stériles tout au long de la procédure. Tous les outils de cette procédure sont répertoriés dans la table des matières.
- Placez les cortex ovariens collectés dans une boîte en plastique contenant 5-10 mL de mHTF à 37 °C et placez-les sur la plaque chauffante pour maintenir le tissu à 37 °C(figure 2A).
- Prenez une photo de chaque cortex à l’aide d’un appareil photo numérique avec le nom du patient avant de commencer la procédure suivante pour lier les données de fond du patient.
- Placez un cortex individuel sur une gaze stérile humidifiée avec du mHTF (Figure 2B).
REMARQUE: Appliquez mHTF supplémentaire avec une pipette jetable sur la gaze pour empêcher la surface du cortex d’être desséchée pendant cette procédure. - Enlevez le tissu médullaire résiduel là où il semble rose à l’aide d’un micro-ciseaux de sorte que l’épaisseur du tissu atteigne 1-2 mm(Figure 2C et D).
REMARQUE: Pour éviter la perte de follicules à un stade précoce, ne préparez pas les bandes corticales de moins de 1 mm d’épaisseur, car les follicules de stade précoce sont situés à moins de 1-2 mm de la surface du cortex ovarien21. - Disséquer un morceau de tissu de 1 mm x 1 mm x 5 mm de chaque bandelette corticale ovarienne à l’aide d’un scalpel fin et le soumettre à une analyse histologique pour déterminer la présence de follicules résiduels comme décrit précédemment18 (figure 2E).
REMARQUE : Les tissus disséqués pour l’histologie sont immergés dans le mHTF et se maintiennent à 4 °C jusqu’à la fixation(figure 2F,voir étape 4). - Couper le cortex en bandes de 1 mm x 1 mm x 10 mm à l’aide d’un scalpel fin (Figure 2G).
REMARQUE: Il est plus facile de couper en appuyant sur le scalpel qu’en tirant dessus. - Couper ces bandes de tissus en petits cubes de 1 mm x 1 mm x 1 mm(figure 2H).
REMARQUE: Pour éviter les changements de pression osmotique dans le milieu, ajouter mHTF avec modération avant l’autografting tissulaire.
3. Auto-greffe de fragments corticaux ovariens
- Ouvrez l’emballage de la canule IVA et mettez-le sur un rideau stérile.
- Rincer à l’intérieur de la canule IVA avec mHTF en aspirant et en déchargeant mHTF plusieurs fois.
- Aspirer 100-200 μL de mHTF pour remplir la pointe de la canule IVA afin d’éviter que les cubes corticaux ne se dessèchent pendant le chargement(figure 3A).
- Chargez les cubes corticaux dans la pointe de la canule IVA à l’aide d’une pince à épiler fine(Figure 3B-E).
REMARQUE: Le nombre de cubes corticaux pour le chargement dépend du site de greffe. Généralement, 20-30 cubes peuvent être transplantés dans un ovaire restant orthotrope, tandis que 10-15 cubes peuvent être transplantés dans une poche sous la séreuse de la trompe de Fallope. - Après avoir chargé les cubes corticaux, maintenez la pointe de la canule contenant les cubes corticaux par les doigts jusqu’à transférer la canule IVA à un chirurgien. Cela évitera que la température du cube diminue.
REMARQUE: Les détails de la procédure d’autografting sous chirurgie laparoscopique ont été rapportés précédemment19. Pour greffer des cubes corticaux ovariens, un dispositif en forme de canule (canule IVA) a été développé par notre collaborateur, kitazato Corporation.
4. Analyse histologique du cortex ovarien
REMARQUE: Pour compter le nombre de follicules résiduels, effectuez une analyse histologique comme décrit précédemment15.
- Marquer la surface de la bande corticale avec un colorant de marquage tissulaire avant la fixation de l’échantillon. Cela indiquera le côté du cortex en bande pour l’histologie.
- Fixer les bandes de tissu pendant la nuit à 4 °C en utilisant la solution de Bouin.
REMARQUE: Pour détecter les follicules atrétiques, nous vous déconseillons d’utiliser du paraformaldéhyde pour la fixation afin d’éviter le rétrécissement du cytoplasme des ovocytes. - Déshydrater et enrober les bandes de tissus dans la paraffine.
- Sectionner en série le bloc de paraffine contenant l’échantillon de tissu.
- Colorer chaque section à l’aide d’hématoxyline et d’éosine pour visualiser les follicules.
- Comptez les follicules comme décrit précédemment17.
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Representative Results
Dans la première publication de l’approche IVA15,nous avons transplanté les cubes corticaux ovariens un par un dans les sites de greffe sous chirurgie laparoscopique(figure 1A). Puisque 100-150 cubes ovariens ont été utilisés, il a fallu 3-4 heures pour la greffe de tissu sous la chirurgie laparoscopic. En outre, certains cubes ovariens ont été perdus avant la greffe. Étant donné que la canule IVA pouvait transférer 20 à 30 cubes sur un site de greffe en même temps(figure 1B),nous pourrions réduire le temps d’opération à 1-2 heures. En outre, la canule d’IVA pourrait éliminer la perte de cubes corticaux ovariens pendant la chirurgie.
Figure 1: L’efficacité de la canule IVA. (A)Méthode précédente de repiquage de cubes corticaux ovariens un par un à l’aide d’un pince. (B) La méthode actuelle avec repiquage de 20-30 cubes à la fois en utilisant la canule IVA. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Dissection du tissu ovarien pour l’IVA sans médicament. (A) Un morceau de cortex ovarien est placé dans une boîte en plastique contenant du mHTF à 37 °C.(B) Pour éliminer les tissus médullaires résiduels, le cortex ovarien est placé sur une gaze humidifiée. (C) Le tissu médullaire est enlevé à l’aide d’un micro-ciseau fin. (D) L’épaisseur du cortex à préparer est comprise entre 1 et 2 mm. (E) Après le retrait du tissu médullaire, un morceau de tissu de 1 mm x 1 mm x 5 mm de chaque bande corticale ovarienne est disséqué pour l’analyse histologique. (F) Le tissu disséqué est stocké dans un tube de 1,5 mL contenant du mHTF à 4 °C jusqu’à fixation pour l’histologie. (G et H) Le cortex ovarien est coupé en bandes de 1 mm x 1 mm x 10 mm, puis coupé en petits cubes de 1 mm x 1 mm x 1 mm à l’aide d’un scalpel fin. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Auto-greffe de fragments corticaux ovariens. (A) Avant de charger des cubes, 100-200 μL de mHTF sont aspirés pour remplir la pointe de la canule IVA afin d’éviter que les cubes corticaux ne se dessèchent pendant le chargement(B-E)Chargement de cubes corticaux ovariens dans la pointe de la canule IVA. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Dans ce manuscrit, nous avons montré un protocole de laboratoire détaillé pour l’IVA sans drogue. L’IVA sans médicament est une nouvelle approche de traitement de l’infertilité pour les patientes de POR avec une diminution de la réserve ovarienne pour favoriser la croissance des follicules secondaires, ce qui entraîne des ovocytes plus matures après stimulation ovarienne et augmente dans une grossesse réussie20. Dans 15 patients de POR présentant la réserve ovarienne décroissante, cette approche a réalisé une grossesse spontanée, le transfert in vitro de fertilisation-embryon a permis quatre naissances vivantes, ainsi qu’une grossesse en cours19.
Pour la préparation du cortex ovarien greffant, le tissu médullaire a été enlevé utilisant un micro-ciseaux avec 1-2 millimètres d’épaisseur. Précédemment, nous avons démontré que primordial, primaire et la majorité des follicules secondaires ont été situés dans un délai de 1 millimètre d’épaisseur de la surface du cortex ovarien dans les patients présentant la réserve ovarienne normale21. Dans des patients de POI, nous avons constaté que les follicules secondaires ont été situés plus profondément que 1 millimètre mais dans un délai de 2 millimètres de la surface du cortex ovarien21. Les follicules antraux sont connus pour localiser dans les tissus de médulle21,mais aucun follicule n’a été trouvé dans les tissus de médulle chez les patients POI21. Bien que les patients de POR présentant la réserve ovarienne décroissante pourraient avoir les follicules antraux dans le tissu de médulle, les follicules antraux sont difficiles à survivre après greffe dû au manque de communication de vaisseau sanguin22. Par conséquent, nous avons déterminé l’épaisseur du cortex ovarien à 1-2 millimètres et l’étape critique dans le protocole ne fait pas les bandes corticales < 1-2 millimètres pour éviter la perte des follicules résiduels précieux. Pendant la préparation des bandes et des cubes corticaux, nous avons employé le mHTF, mais on peut employer le milieu semblable qui incluent le tampon de l’acide 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic (HEPES).
Dans cette procédure, nous avons transplanté le cortex ovarien après l’avoir coupé en 1 mm3 cubes15,20. En raison de la difficulté à manipuler de tels petits fragments pour la greffe, la greffe précédente des cubes ovariens un par un sous la chirurgie laparoscopique a pris 3-4 heures avec quelques cubes parfois perdus pendant la chirurgie. Après le développement de la canule IVA, nous pourrions raccourcir le temps d’opération à 1-2 heures, ayant pour résultat de minimiser le caractère invasif de la chirurgie pour permettre à l’IVA sans drogue de devenir un seul jour-chirurgie. De plus, nous pourrions éliminer la perte de cubes corticaux ovariens pendant la chirurgie. En raison du nombre limité de follicules dans le cortex ovarien dans des patients de POR présentant la réserve ovarienne décroissante, il est important d’éviter la perte de cubes corticaux ovariens. Si la canule IVA n’est pas disponible, vous pouvez essayer de trouver une canule similaire à utiliser sous chirurgie laparoscopique.
Le déclin de la fonction ovarienne est progressivement causé par le vieillissement et certaines conditions physiopathologiques 23,24,25. Ainsi, dans les femmes non mariées avec le dysfonctionnement ovarien grave, la conservation de fertilité est importante pour permettre la grossesse future. Pour ces patientes, les méthodes de cryoconservation des ovocytes ou des tissus ovariens ont été rapportées26,27,28,29. Bien que la cryoconservation des ovocytes soit une méthode établie pour la préservation de la fertilité1,2,ces patients pourraient avoir un nombre très limité d’ovocytes récupérables même après hyperstimulation ovarienne due à une faible réserve ovarienne. En outre, dans les patients vieillissants présentant le dysfonctionnement ovarien, l’incidence élevée des anomalies de chromosome a été rapportée dans les oocytes ovulés26,30. Cela conduit à l’exigence de plusieurs procédures coûteuses pour assurer un nombre suffisant d’ovocytes pour garantir la grossesse. Pour résoudre ces problèmes, nous avons développé l’approche IVA sans médicament pour augmenter le nombre d’ovocytes matures pour la récupération des ovocytes. Puisque la cryoconservation d’ovocyte n’est plus une méthode expérimentale31,32, l’IVA drogue-libre suivie de la cryoconservation d’oocyte est censée être une méthode prometteuse pour la conservation de fertilité dans les femmes célibataires avec le dysfonctionnement ovarien grave. Cependant, de futures études cliniques utilisant les ovocytes congelés-décongelés obtenus à partir de l’IVA sans drogue seront exigées pour déterminer l’efficacité de cette approche pour la conservation de fertilité dans les femmes célibataires avec le dysfonctionnement ovarien grave.
En conclusion, nous avons développé l’IVA drogue-libre comme nouvelle approche de traitement d’infertilité pour la patiente de POR présentant la réserve ovarienne décroissante et avons montré le protocole de laboratoire de détail pour pouvoir répéter nos procédures. Les limites méthodologiques de l’IVA sans drogue sont difficulté dans la prévision du nombre résiduel de follicule avant la chirurgie et également incapacité d’évaluer la survie de greffe. La technique de laboratoire de l’IVA drogue-libre pourrait devenir la base de l’application future de la culture ovarienne de tissu pour obtenir les ovocytes mûrs sans greffe.
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Disclosures
Les auteurs confirment qu’ils ne sont pas en conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Nous remercions Tatsuji Ihana, Sachiyo Kurimoto, Kazuko Takahasih, Yuki Yoshizawa, Maho Arashi, Kentaro Fujita, Erina Kudo, Yuka Kurimoto et Mayuko Wakatsuki pour leur soutien à la procédure IVA sans drogue et le professeur Aaron J.W. Hsueh (Stanford University School of Medicine, Stanford, CA) pour la lecture critique et l’édition du manuscrit. Nous remercions également Rebecca Truman et Gregory Truman d’avoir inséré une narration en anglais. Cette étude a été soutenue par la Japan Society for the Promotion of Science (JSPS), Scientific Research B (19H03801) et Challenging Exploratory Research (18K19624).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4.5 onz specimen container | FALCON | 354013 | Other products may also be suitable |
| 60mm dish | FALCON | 351007 | Other products may also be suitable |
| 50 x 50 cm sterile drape | HOGY Medical | SR-823 | Any type of sterile produsts may also be suitable |
| Disposable pippete | FALCON | 357575 | Other products may also be suitable |
| Fine scissors, Curved | WPI | #14224-G | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |
| Hot plate | TOKAI HIT | TPiE-SP | Use at operation room to maintain the temperature of dishes containing ovarian tissue before transplantation |
| Human Serum Albumin Solution | Irvine Scientific | 9988 | Medium for handling ovarian tissue |
| IVA cannule | KITAZATO | 446030 IVA-6030E | Specific cannula for tissue autografting |
| KAI medical Disposable scalpel | WPI | #5 10-A | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |
| Micro scissors, Curved | WPI | #503364 | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |
| Modified HTF Medium-HEPES | Irvine Scientific | 90126 | Medium for handling ovarian tissue |
| Sterile gauze | Osaki Medical | 15004 | Any type of sterile produsts may also be suitable |
| Swiss Tweezers, Curved Tips | KAI | #504505 | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |
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