Summary
我们为严重卵巢功能障碍患者提供卵巢卵泡无药物体外活化 (IVA) 的实验室程序详情。这种方法可以增加每次卵巢过度刺激的可检索卵母细胞的数量,并有利于这些患者的生育能力保护。
Abstract
卵巢功能在衰老期间和某些病理生理条件下逐渐下降,包括卡约型异常、自身免疫性疾病、化疗和放射疗法以及卵巢手术。在患有严重卵巢功能障碍的未婚妇女中,生育能力的保存对于未来的怀孕非常重要。虽然卵母细胞冷冻保存是保存生育力的既定方法,但这些患者即使在卵巢过度刺激后也只能保留数量有限的卵母细胞,导致反复刺激,以确保卵母细胞有足够的保证未来怀孕。为了解决这个问题,我们最近开发了一种无药物体外活化(IVA)程序,使我们能够刺激卵巢卵泡的早期发育到前额卵泡阶段。这些前额叶囊可以响应独特的性腺激素刺激协议,导致每次卵巢刺激的检索卵母细胞数量增加,用于冷冻保存。无药物IVA包括手术方法和卵巢刺激。在腹腔镜手术中,我们从一个或两个卵巢中取出了部分皮层。卵巢皮质组织被切成小块,以破坏河马信号通路,刺激早期卵泡的发展。这些立方体被移植到剩余的卵巢以及两个输卵管的血清下。我们已经发布了无药物IVA的外科手术和随后的卵巢刺激协议,但在这里我们介绍了无药物IVA所需的实验室方法的细节。
Introduction
卵巢功能在衰老期间逐渐下降,一些病理生理疾病,包括卡约型异常、自身免疫性疾病、化疗和放射治疗以及卵巢手术。生育力保护是患有严重卵巢功能障碍的未婚妇女保持未来怀孕潜力的最佳选择之一。在生育保护方面,目前有两种方法主要在生育领域。卵母细胞冷冻保存是一个成熟的生育保护程序,许多成功的病例已经报告1,2。另一方面,卵巢组织冷冻保存也建立了为癌症患者的生育保存,但它仍然是一个实验策略3,4。在这两种方法中,怀孕需要多个数量的成熟卵母细胞。一般来说,早产卵巢不足(POI)的患者在40岁之前成为闭经,卵巢储备低的中年妇女对卵巢刺激产生成熟的卵母细胞5、6、7的反应很差。此外,蚂蚁卵泡数量少的年轻患者也向卵巢刺激7显示POR。这些患者的可检索卵母细胞数量非常有限,即使经过适当的卵巢过度刺激,因此需要多个昂贵的程序,以确保足够的卵母细胞怀孕。
卵母细胞捐赠,其次是体外受精(IVF)与丈夫的精子和胚胎移植(ET)是这些POI和POOR患者谁很难获得自己的卵母细胞8,9,10的唯一选择。然而,卵母细胞捐赠是复杂的道德问题,以及自身免疫和怀孕并发症11,12,13,14。为了解决这些问题,需要建立使用患者自身卵母细胞的不孕症治疗。对于POI患者,我们开发了体外活化(IVA)方法,使卵泡生长成功,并产生成熟的卵母细胞,导致一些怀孕和分娩15。在IVA中,我们在腹腔镜手术切除卵巢后将卵巢皮层分割,并培养卵巢两天,用Akt刺激药物激活卵泡,然后进行异位移植回到第二次腹腔镜手术15下法洛皮管下的人工袋中。这个过程促进卵巢皮层分裂后原始、初级和次要卵泡的生长,促进河马信号中断16,随后两天培养与Akt信号刺激器17。
与严重的 POI 病例相比,卵巢储备减少的 POR 患者具有多个继发性毛囊。由于河马信号中断本身是有效的促进继发性毛囊生长16,我们最近证明成功的怀孕和分娩的POOR患者使用无药物IVA程序涉及皮质碎裂和正畸移植没有治疗Akt刺激药物。无药物IVA刺激卵巢卵泡的早期阶段,在仅进行一次手术后发育到前额卵泡阶段,并增加了为IVF-胚胎移植15,18检索卵母细胞的数量。无药物IVA方法与我们原来的IVA相比有几个优点,1) 避免培养过程中潜在的毛囊损失, 2) 尽量减少第二次手术的侵入性和成本, 3) 只涉及短期手术后卧床休息和 4) 由于正交移植而自发怀孕的可能性。我们最近发表了一篇视频文章,展示了无药物IVA19的外科手术和手术后卵巢刺激的详细协议20。在这里,我们介绍无药物IVA所需的实验室方法的详细信息。
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Protocol
从每个参加无药物IVA治疗的卵巢储备减少的 POR 患者那里获得书面知情同意。这项研究得到了国际卫生和福利大学伦理委员会(第17-S-21号)的批准。临床试验登记在编号为UMIN000034464,并根据《世界医学协会道德守则》(赫尔辛基宣言)进行。
1. 卵巢皮层提取
- 通过腹腔镜手术从一个或两个卵巢中取出部分卵巢皮层(10 x10毫米,厚度2-3毫米),如前所述19,20。
- 将收集的卵巢皮层放置在无菌容器中,容器中含有 10 mL 的改性 HTF (mHTF),体积为 37 °C。
2. 卵巢皮层碎片
注意:在卵巢皮层解剖之前,将mHTF加热到37°C。 在整个过程中保持无菌状态。此过程的所有工具都列在 材料表中。
- 将收集的卵巢皮层放在含有 5-10 mL mHTF 的塑料盘中,在 37 °C 时放置在热板上,以保持组织在 37 °C (图 2A)。
- 在开始下一个程序链接患者背景数据之前,使用带有患者姓名的数码相机拍摄每个皮层的照片。
- 将单个皮层放在用 mHTF (图 2B)湿润的无菌纱布上。
注意:在纱布上涂上额外的 mHTF,用一次性移液器,以防止皮层表面在此过程中干燥。 - 使用微剪刀去除看起来粉红色的残余美杜拉组织,使组织厚度达到 1-2 毫米(图 2C 和 D)。
注意:为了避免在早期失去卵泡,不要准备厚度小于1毫米的皮质条,因为早期卵泡位于距离卵巢皮层21的1-2毫米以内。 - 使用细手术刀从每个卵巢皮质条上解剖一块1毫米×1毫米×5毫米的组织片,并接受组织学分析,以确定残余卵泡的存在,如先前描述的18(图2E)。
注意:组织学的解剖组织被浸入mHTF中,并保持在4°C,直到修复(图2F,见第4步)。 - 使用细手术刀(图 2G)将皮层切成 1mm x 1 mm x 10 mm 条。
注意:按下手术刀比拉手术刀更容易切割。 - 将这些组织条切成 1 mm x 1 mm x 1 mm 小立方体(图 2H)。
注意:为了避免介质中渗透压力的变化,在组织自动移植前适度添加 mHTF。
3. 卵巢皮质碎片的自动移植
- 打开IVA罐子的包装,并把它放在无菌窗帘上。
- 通过多次吸气和卸载 mHTF,用 mHTF 冲洗 IVA 罐内。
- 吸气100-200μL的mHTF,以填补IVA坎努拉的尖端,以避免皮质立方体在加载过程中干燥(图3A)。
- 使用细钳子(图 3B-E)将皮质立方体加载到 IVA 坎努拉的尖端。
注:加载的皮质立方体数量取决于嫁接部位。一般来说,20-30个立方体可以移植到矫形剩余卵巢中,而10-15个立方体可以移植到输卵管下方的袋子里。 - 加载皮质立方体后,用手指握住含有皮质立方体的管子尖端,直到将IVA管转移到外科医生那里。这将避免立方体温度降低。
注:腹腔镜手术下的自动移植手术细节已经报告之前19。为了嫁接卵巢皮质立方体,我们的合作者北崎公司开发了一种管状装置(IVA坎努拉)。
4. 卵巢皮层的病理学分析
注:要计算残留卵泡的数量,请像以前描述的15个一样进行病理学分析。
- 在样品固定前用组织标记染料标记皮质条面。这将指示皮层的一侧在条带的病理学。
- 使用 Bouin 的解决方案在 4 °C 下修复组织条过夜。
注意:为了检测腹膜卵泡,我们不建议使用副甲醛进行固定,以避免卵母细胞质收缩。 - 脱水,并将组织条嵌入石蜡中。
- 连续分割含有组织样本的石蜡块。
- 使用血氧素和 eosin 染色每个部分,以可视化毛囊。
- 数一数之前描述的17个卵泡。
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Representative Results
在IVA方法15的第一版中,我们逐一移植卵巢皮质立方体到腹腔镜手术的移植部位(图1A)。由于使用了100-150个卵巢立方体,因此在腹腔镜手术下进行组织移植需要3-4个小时。此外,一些卵巢立方体在移植前丢失。由于IVA坎努拉可以一次将20-30个立方体转移到嫁接站点(图1B),因此我们可以将操作时间缩短到1-2小时。此外,IVA坎努拉可以消除手术过程中卵巢皮质立方体的损失。
图1:IVA管的功效。 (A) 以前使用钳子移植卵巢皮质立方体的方法。(B) 目前使用IVA管一次移植20-30个立方体的方法。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2:卵巢组织解剖无药物IVA。(A) 卵巢皮层放置在含有 mHTF 的塑料盘中,在 37 °C. (B) 为了去除残留的梅杜拉组织,卵巢皮层被放置在湿纱布上。(C) 用细微剪刀去除美杜拉组织。(D) 准备的皮层厚度在1至2毫米之间。 (E) 切除梅杜拉组织后,从每个卵巢皮质条中分离出1毫米 x 1毫米 x 5 毫米的组织片,用于组织学分析。(F) 解剖的组织储存在1.5毫升管中,其中含有mHTF在4°C,直到修复组织学。(G 和 H) 卵巢皮层被切成 1 毫米 x 1 毫米 x 10 毫米条, 然后使用精细的手术刀进一步切成 1 毫米 x 1 毫米 x 1 毫米的小立方体。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3:卵巢皮质片段的自动移植。 (A) 在加载立方体之前,需要 100-200 μL 的 mHTF 来填充 IVA 坎努拉的尖端,以避免皮质立方体在加载期间干燥(B-E) 将卵巢皮质立方体加载到 IVA 罐头。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在这份手稿中,我们展示了无药物IVA的详细实验室协议。无药物IVA是一种新的不孕症治疗方法,为POR患者与减少卵巢储备,以促进次要卵泡生长,导致产生更成熟的卵母细胞卵巢刺激后,并在成功怀孕20增加。在15名卵巢储备减少的POR患者中,这种方法实现了一次自发怀孕,体外受精-胚胎移植允许4例活产,以及1例持续妊娠19例。
为了准备移植卵巢皮层,用1-2毫米厚度的微剪刀切除了梅杜拉组织。此前,我们证明,原始,原发和大多数次要卵泡位于1毫米厚度内,从卵巢皮层的表面在正常卵巢储备21患者。在POI患者中,我们发现继发性卵泡位于1毫米以下,但距离卵巢皮层21的表面不到2毫米。已知在21日脑膜组织中发现蚂蚁卵泡,但在21日POI患者的髓组织中未发现卵泡。虽然卵巢储备减少的 POR 患者可能在美杜拉组织中出现心角孔,但由于缺乏血管沟通,动脉毛囊在移植后难以存活。因此,我们确定卵巢皮层的厚度为1-2毫米,协议中的关键步骤是不会使皮质条<1-2毫米,以避免失去珍贵的残余卵泡。在准备皮质条带和立方体时,我们使用 mHTF,但可以使用类似的介质,包括 4-(2-羟基)-1-管道拉齐尼硫酸 (HEPES) 缓冲器。
在这个程序中,我们移植卵巢皮层后,切成1毫米3立方体15,20。由于处理这种小片段进行移植的困难,以前在腹腔镜手术下一个接一个地移植卵巢立方体需要3-4个小时,有些卵巢偶尔会在手术过程中丢失。IVA坎努拉开发后,我们可以将手术时间缩短到1-2小时,从而最大限度地减少手术的侵入性,使无药IVA成为单日手术。此外,我们可以消除手术过程中卵巢皮质立方体的损失。由于在卵巢储备减少的 POR 患者中卵巢皮层的卵泡数量有限,因此避免卵巢皮质立方体的损失非常重要。如果IVA坎努拉不可用,您可以尝试找到一个类似的管子,以便能够在腹腔镜手术下使用。
卵巢功能的下降是由衰老和一些病理生理条件23,24,25逐渐造成的。 因此,在患有严重卵巢功能障碍的未婚妇女中,保持生育能力对于允许未来怀孕非常重要。对于这些患者,卵母细胞或卵巢组织冷冻保存的方法报告26,27,28,29。虽然卵母细胞冷冻保存是生育保护的既定方法1,2,这些患者可能有非常有限的数量可回收卵母细胞,即使在卵巢过度刺激后,由于卵巢储备低。此外,在卵巢功能障碍的老年患者中,26、30号排卵卵母细胞的染色体异常发生率很高。这导致需要多个昂贵的程序,以确保足够的卵母细胞数量,以保证怀孕。为了解决这些问题,我们开发了无药物IVA方法,以增加卵母细胞检索的成熟卵母细胞的数量。由于卵母细胞冷冻保存不再是一种实验方法31,32,无药物IVA,其次是卵母细胞冷冻保存,预计将是一个有希望的方法,以保存在未婚妇女与严重的卵巢功能障碍。然而,今后需要利用从无药物IVA获得的冷冻卵母细胞进行临床研究,以确定这种方法对患有严重卵巢功能障碍的未婚妇女的生育保护的有效性。
最后,我们开发了无药物IVA作为一种新的方法,不孕不育治疗的POR患者与减少卵巢储备,并展示了详细的实验室协议,能够重复我们的程序。无药物IVA的方法限制是手术前难以预测残留卵泡数量,也难以评估移植存活率。无毒IVA的实验室技术可以成为卵巢组织培养未来应用的基础,在不嫁接的情况下获得成熟的卵母细胞。
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Disclosures
作者确认他们没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢伊哈纳、桥本太郎、高桥正彦、吉泽裕久、麻生太郎、藤田健太郎、久藤美子、久本裕久和武松木美子支持无毒品IVA程序,以及Aaron J.W. Hsueh教授(斯坦福大学医学院,加州斯坦福)对手稿的批判性阅读和编辑。我们也感谢丽贝卡杜鲁门和格雷戈里杜鲁门插入英语旁白。这项研究得到了日本科学促进会(JSPS)、科学研究B(19H03801)和具有挑战性的探索研究(18K19624)的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
4.5 onz specimen container | FALCON | 354013 | Other products may also be suitable |
60mm dish | FALCON | 351007 | Other products may also be suitable |
50 x 50 cm sterile drape | HOGY Medical | SR-823 | Any type of sterile produsts may also be suitable |
Disposable pippete | FALCON | 357575 | Other products may also be suitable |
Fine scissors, Curved | WPI | #14224-G | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |
Hot plate | TOKAI HIT | TPiE-SP | Use at operation room to maintain the temperature of dishes containing ovarian tissue before transplantation |
Human Serum Albumin Solution | Irvine Scientific | 9988 | Medium for handling ovarian tissue |
IVA cannule | KITAZATO | 446030 IVA-6030E | Specific cannula for tissue autografting |
KAI medical Disposable scalpel | WPI | #5 10-A | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |
Micro scissors, Curved | WPI | #503364 | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |
Modified HTF Medium-HEPES | Irvine Scientific | 90126 | Medium for handling ovarian tissue |
Sterile gauze | Osaki Medical | 15004 | Any type of sterile produsts may also be suitable |
Swiss Tweezers, Curved Tips | KAI | #504505 | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |
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