Summary
重度の卵巣機能障害患者に対する卵巣卵胞の薬物を含まないインビトロ活性化(IVA)の検査手順の詳細を提示する。この方法は、卵巣過剰刺激当たりの取得可能な卵母細胞の数を増加させ、それらの患者の生殖能力の保存に利益をもたらす可能性がある。
Abstract
卵巣機能は、加齢の間、および核型異常、自己免疫疾患、化学および放射線療法、ならびに卵巣手術を含むいくつかの病態生理学的状態において徐々に低下する。重度の卵巣機能不全を有する未婚女性では、不妊治療の保存は将来の妊娠にとって重要である。卵母細胞凍結保存は出生時の保存のための確立された方法であるが、これらの患者は卵巣過剰刺激後でさえ限られた数の卵母細胞を保存することができ、将来の妊娠を保証するのに十分な卵母細胞を確保するために反復刺激につながった。この問題を解決するために、我々は最近、卵巣卵胞の初期段階を刺激して前根嚢胞段階に発達することを可能にする薬物を含まないインビトロ活性化(IVA)手順を開発しました。これらの前骨葉包は、性腺刺激のユニークなプロトコルに応答することができ、その結果、凍結保存のための卵巣刺激当たりの取得卵母細胞の数が増加する。薬物を含まないIVAは、外科的アプローチおよび卵巣刺激から構成される。腹腔鏡手術を受けた患者から片方または両方の卵巣から皮質の一部を取り除いた。卵巣皮質組織は、カバのシグナル伝達経路を破壊し、初期段階の卵胞の発達を刺激するために小さな立方体に切断された。これらの立方体は、両方の卵管のセロサの下だけでなく、残りの卵巣に正交性に移植された。我々はすでに薬物を含まないIVAの外科的処置及びその後の卵巣刺激のプロトコルを公表しているが、ここでは、薬物を含まないIVAに必要な実験室法の詳細を提示する。
Introduction
卵巣機能は、加齢の間に徐々に低下し、いくつかの病態生理学的状態は、核型異常、自己免疫疾患、化学および放射線療法、および卵巣手術を含む。不妊治療の保存は、重度の卵巣機能不全を持つ未婚女性が将来の妊娠の可能性を維持するための最良の選択肢の1つです。不妊治療の保存のために、現在、主にオンコ不妊治療分野で2つの方法が利用可能です。卵母細胞凍結保存は、不妊治療の保存のための確立された手順であり、多くの成功した症例が報告されている1,2.一方、卵巣組織凍結保存は、がん患者における不妊治療の保存のためにも確立されたが、まだ実験戦略3、4である。どちらの方法でも、妊娠のためには複数の数の成熟卵母細胞が必要である。一般に、早期卵巣不全(POI)を有する患者は、40歳より前に月経前に、卵巣予備軍が低い中年女性は、成熟卵母細胞5、6、7を生み出すために卵巣刺激に対して貧しい卵巣応答(POR)を示した。さらに、低い数の角根を有する若年患者も、卵巣刺激7に対してPORを示した。これらの患者は、適切な卵巣過剰刺激の後でさえ、取得可能な卵母細胞の数が非常に限られており、したがって、妊娠のための卵母細胞の十分な数を確保するために複数の高価な手順を必要とする。
卵母細胞の寄付に続いて、夫の精子と胚移植(ET)を伴う体外受精(IVF)は、自分の卵母細胞8、9、10を得るのに困難を有するこれらのPOIおよびPOR患者にとって唯一の選択肢である。しかし、卵母細胞の寄付は、倫理的な問題だけでなく、自己免疫および妊娠合併症11、12、13、14によって複雑化しています。これらの問題を解決するために、患者自身の卵母細胞を用いた不妊治療の確立が望まれている。POI患者に対して、我々は、正常な卵胞の成長と成熟卵子の生成を可能にするインビトロ活性化(IVA)アプローチを開発し、多くの妊娠および出産をリードする15。IVAでは、腹腔鏡手術の下で卵巣を除去した後に卵巣コルテックスを断片化し、Akt-刺激薬による卵胞を活性化し、第2回腹腔鏡手術15の下で卵管のセロシの下に作られた人工パウチにヘテロトーブリ移植を行うために2日間培養した。この手順は、卵巣皮質断片化後の原始、一次および二次卵胞の成長を促進し、カバのシグナル伝達破壊を促進する16、続いてAktシグナル伝達刺激装置17を有する2日間培養を行った。
重篤なPOI症例とは対照的に、卵巣予備軍の減少を有するPOR患者は複数の二次卵胞を有する。カバのシグナル伝達破壊だけでも二次卵胞の成長を促進するのに有効であるため、我々は最近、Akt刺激薬の治療なしに皮質断片化および直交性移植を含む薬物のないIVA処置を使用してPOR患者のための成功した妊娠および出産を実証した。薬物を含まないIVAは、卵巣卵胞の初期段階を刺激して、1回の手術後に前骨胞期に発達し、IVF胚移植15,18に対して取得卵母細胞の数を増加させた。薬物を含まないIVAアプローチは、培養中の潜在的な卵胞喪失を回避する1)によって当社の元のIVAと比較していくつかの利点を有し、2)第2の手術の侵襲性とコストを最小限に抑え、3)短期手術後の安静所のみを含む、および4)正体移植による自発的な妊娠の可能性。我々は最近、薬物を含まないIVA19の外科的処置と手術後の卵巣刺激の詳細なプロトコルを示すビデオ記事を公開した20.ここでは、薬物を含まないIVAに必要なラボメソッドの詳細を紹介します。
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Protocol
書面によるインフォームド・コンセントは、薬物を含まないIVA治療に登録した卵巣予備軍の減少を伴う各POR患者から得られた。本研究は国際保健福祉大学倫理委員会(第17-S-21)によって承認されました。臨床試験は、番号UMIN000034464の下で登録され、世界医師会の倫理規定(ヘルシンキ宣言)に従って行われました。
1. 卵巣皮質抽出
- 卵巣皮質の一部(10 x 10mm、2〜3mm厚)を、前述の腹腔鏡手術を通じて全身麻酔下の一方または両方の卵巣から取り除く。
- 37°Cで10mLの修飾HTF(mHTF)を含む無菌容器に、採取した卵巣コルテックスを入れる。
2. 卵巣皮質の断片化
注:卵巣皮質の解剖の前に、mHTFを37°Cにウォームアップしてください。 手順を通じて無菌状態を維持します。この手順のすべてのツールは、一覧の一覧を 示します。
- 収集した卵巣コルテックスを37°CのmHTFを5〜10 mL含むプラスチック皿に入れ、ヒートプレートの上に置いて組織を37°Cに維持する(図2A)。
- 患者のバックグラウンドデータをリンクするための次の手順を開始する前に、患者の名前を持つデジタルカメラを使用して各皮質の写真を撮ります。
- mHTFで湿らせた滅菌ガーゼに個々の皮質を置く(図2B)。
注:この手順の間に皮質の表面が乾燥するのを防ぐためにガーゼに使い捨てピペットを使用して追加のmHTFを適用します。 - マイクロハサミを使用してピンク色に見える残留髄組織を除去し、組織の厚さが1〜2mmに達するようにします(図2CおよびD)。
注:初期段階の卵胞は卵巣皮質21の表面から1〜2mm以内に位置しているので、初期段階で卵胞の損失を避けるために、厚さが1mm未満の皮質ストリップを準備しないでください。 - 各卵巣皮質ストリップから1mm x 1mm x 5mmの組織片を微細なメスを用いて解剖し、それを組織学的分析に供して、前述の18(図2E)のように残留卵胞の存在を決定する。
注:組織学のための解剖組織はmHTFに浸漬され、固定されるまで4°Cに保つ(図2F、ステップ4を参照)。 - 細かいメスを使って皮質を1mm x 1mm x 10mmのストリップに切ります(図2G)。
注:メスを押し下げるよりも、引っ張るよりもカットする方が簡単です。 - これらのティッシュストリップを1 mm x 1 mm x 1 mmの小さい立方体に切る(図2H)。
注:培地の浸透圧の変化を避けるために、組織の自動移植の前に適度にmHTFを加えてください。
3. 卵巣皮質断片の自動移植
- IVAカニューレのパッケージを開き、滅菌ドレープに置きます。
- IVAカニューレの内部をmHTFで数回吸引して排出して、mHTFを使用してリンスします。
- 吸引100-200 μLのmHTFは、ローディング中に皮質キューブが乾燥するのを避けるためにIVAカニューレの先端を満たす(図3A)。
- 細かいトゥイザーを使用して、皮質キューブをIVAカニューレの先端にロードします(図3B-E)。
注: ローディング用の皮質キューブの数は、移植部位によって異なります。一般的に、20〜30キューブは直交性残りの卵巣に移植することができ、10〜15キューブは卵管のセロサの下のポーチに移植することができる。 - 皮質キューブをロードした後、麻酔体を含むカニューレの先端を指で保持し、IVAカニューレを外科医に移します。これにより、立方体の温度が低下するのを避けます。
注:腹腔鏡下手術の下での自己移植手順の詳細は、以前に報告されています 19.卵巣皮質キューブの移植のために、カニューレ形の装置(IVAカニューレ)は、我々の共同研究者である北里株式会社によって開発されました。
4. 卵巣皮質の組織学的解析
注:残留卵胞の数を数えるために、前に説明した15のように組織学的分析を行います。
- サンプル固定の前に、皮質ストリップ表面に組織マーキング染料でマークします。これは、体質学のためのストリップの皮質の側面を示します。
- ブインの溶液を使用して4°Cで一晩組織ストリップを固定します。
注意:食毒卵胞を検出するために、卵母細胞質の収縮を避けるために、固定にパラホルムアルデヒドを使用することはお勧めしません。 - 脱水し、パラフィンに組織ストリップを埋め込みます.
- 組織試料を含むパラフィンブロックを連続的に切片する。
- 各セクションをヘマトキシリンとエオシンを使用して染色し、卵胞を可視化する。
- 前述の17のように卵胞を数えます。
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Representative Results
IVAアプローチ15の最初の刊行物では、卵巣皮質キューブを腹腔鏡手術下の移植部位に1つずつ移植した(図1A)。100-150の卵巣キューブが使用されたので、腹腔鏡手術の下で組織移植に3〜4時間かかった。また、いくつかの卵巣キューブは移植前に失われました。IVAカニューレは、一度に20〜30キューブを移植部位に移すことができるので(図1B)、1-2時間に動作時間を短縮することができます。さらに、IVAカニューレは、手術中の卵巣皮質キューブの損失を排除することができます。
図1: IVAカニューレの有効性( A) 前に、鉗子を用いて卵巣皮質キューブを1つずつ移植する方法。(B)IVAカニューレを用いて一度に20~30キューブを移植する現行の方法。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:薬物を含まないIVAに対する卵巣組織解剖(A)37°CでmHTFを含むプラスチック皿に卵巣皮質を入れて(B)残りの髄質組織を除去するために、卵巣皮質を湿潤ガーゼに置く。(C)細かいマイクロハサミを使用して、髄質組織を除去する。(D)調製する皮質の厚さは1〜2mmの間である(E)髄質組織の除去後、各卵巣皮質ストリップから1mm x 1mm x 5mmの組織片が組織学的分析のために解剖される。(F)解剖組織は、組織学のために固定されるまで4°CでmHTFを含む1.5mLのチューブに保存される。(GおよびH)卵巣皮質を1mm x 1mm x 10mmのストリップに切断し、さらに細かいメスを使って1mm x 1 mm x 1 mmの小さな立方体に切り分けます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:卵巣皮質断片の自動移植(A)キューブをローディングする前に、100-200 μL の mHTF を吸引して IVA カニューレの先端を充填し、ローディング中に皮質キューブが乾燥するのを避ける(B-E)卵巣皮質キューブを IVA カニューレの先端にロードします。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本稿では、薬物を含まないIVAの詳細な実験プロトコルを示した。薬物を含まないIVAは、卵巣予備軍を減少させて二次卵胞の成長を促進するPOR患者に対する不妊治療の新しいアプローチであり、卵巣刺激後により成熟した卵母細胞を生み出し、妊娠20に成功した。卵巣予備軍の減少を有する15人のPOR患者において、このアプローチは1つの自発的な妊娠を達成し、体外受精胚移植は4回の出生を可能にし、1つの進行中の妊娠19と共に。
卵巣皮質の移植の準備のために、髄質組織は、厚さ1〜2mmのマイクロハサミを使用して除去した。以前は、原始卵胞、原発性および大部分の二次卵胞が、正常卵巣予備軍21の患者における卵巣皮質の表面から1mmの厚さの範囲内に位置することを実証した。POI患者では、二次卵胞は1mmより深く、卵巣皮質21の表面から2mm以内に位置していることがわかった。アンタル卵胞は髄質組織21に位置することが知られているが、POI患者21の髄質組織には卵胞は見つからなかった。卵巣予備の減少を有するPOR患者は髄質組織に角質卵胞を有する可能性があるが、血管通信22の欠如のために移植後に生き残ることは困難である。したがって、卵巣皮質の厚さは1〜2mmであると判断し、プロトコル内の重要なステップは、貴重な残留卵胞の損失を避けるために皮質ストリップを1〜2mm<にしていない。皮質ストリップとキューブの調製中に、mHTFを使用しましたが、4-(2-hydroxyethyl)-1-ピペラジネタンスルホン酸(HEPES)緩衝液を含む同様の培地を使用することができます。
この手順では、卵巣皮質を1mm3キューブ15、20に切断した後に移植した。移植のためのこのような小さな断片を扱うのが難しいため、腹腔鏡手術の下で卵巣キューブを1つずつ移植するのに3〜4時間かかり、時折手術中に失われたキューブもありました。IVAカニューレの開発後、手術時間を1〜2時間に短縮し、薬物を含まないIVAが1日手術になることを可能にする手術の侵襲性を最小限に抑えることができる。さらに、手術中の卵巣皮質キューブの損失を排除することができます。卵巣予備軍の減少を伴うPOR患者における卵巣皮質の卵胞の数が限られているため、卵巣皮質キューブの損失を避けることは重要である。IVAカニューレが利用できない場合は、腹腔鏡手術下で使用できる同様のカニューレを見つけようとするかもしれません。
卵巣機能の低下は老化といくつかの病態生理学的状態23、24、25によって徐々に引き起こされる。 したがって、重度の卵巣機能不全を有する未婚女性では、将来の妊娠を可能にするために不妊治療の保存が重要である。これらの患者に対して、卵母細胞または卵巣組織凍結保存の方法は、26、27、28、29を報告した。卵母細胞凍結保存は、出生率の保存1,2のための確立された方法であるが、これらの患者は、低卵巣予備軍による卵巣過剰刺激後でさえ、取得可能な卵母細胞の数が非常に限られている可能性がある。さらに、卵巣機能障害を有する高齢患者において、排卵卵細胞26,30において染色体異常の高い発生率が報告された。これは、妊娠を保証するのに十分な数の卵母細胞を確保するために、複数の高価な手順の要件につながります。これらの問題を解決するために、我々は卵母細胞の検索のための成熟卵母細胞の数を増加させる薬剤フリーIVAアプローチを開発しました。卵母細胞凍結保存は、もはや実験的な方法31,32ではないので、無薬IVAに続いて卵母細胞凍結保存は、重度の卵巣機能不全を有する未婚女性における不妊治療保存のための有望な方法であると予想される。しかし、薬物を含まないIVAから得られた凍結解凍卵母細胞を用いた将来の臨床研究は、重度の卵巣機能不全を有する未婚女性における不妊治療保存に対するこのアプローチの有効性を決定するために必要とされるであろう。
結論として、卵巣予備軍の減少を伴うPOR患者の不妊治療の新しいアプローチとして薬物を含まないIVAを開発し、我々の手順を繰り返すことができる詳細な実験室プロトコルを示した。薬物を含まないIVAの方法論的限界は、手術前の残留卵胞数の予測において困難であり、また移植片の生存率を評価することができない。薬物を含まないIVAの実験室技術は、移植せずに成熟した卵母細胞を得るために卵巣組織培養の将来の適用の基礎となり得る。
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Disclosures
著者らは、利益相反がないことを確認した。
Acknowledgments
薬を含まないIVA処置を支援してくれた伊華達司、栗本佐知子、高橋和子、吉沢由紀、嵐正生、藤田健太郎、九藤恵奈、栗本由佳、若槻真由子氏に感謝します。また、英語のナレーションを挿入してくれたレベッカ・トルーマンとグレゴリー・トルーマンに感謝します。本研究は、日本学術振興会(JSPS)、科学研究B(19H03801)、チャレンジング探索研究(18K19624)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4.5 onz specimen container | FALCON | 354013 | Other products may also be suitable |
| 60mm dish | FALCON | 351007 | Other products may also be suitable |
| 50 x 50 cm sterile drape | HOGY Medical | SR-823 | Any type of sterile produsts may also be suitable |
| Disposable pippete | FALCON | 357575 | Other products may also be suitable |
| Fine scissors, Curved | WPI | #14224-G | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |
| Hot plate | TOKAI HIT | TPiE-SP | Use at operation room to maintain the temperature of dishes containing ovarian tissue before transplantation |
| Human Serum Albumin Solution | Irvine Scientific | 9988 | Medium for handling ovarian tissue |
| IVA cannule | KITAZATO | 446030 IVA-6030E | Specific cannula for tissue autografting |
| KAI medical Disposable scalpel | WPI | #5 10-A | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |
| Micro scissors, Curved | WPI | #503364 | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |
| Modified HTF Medium-HEPES | Irvine Scientific | 90126 | Medium for handling ovarian tissue |
| Sterile gauze | Osaki Medical | 15004 | Any type of sterile produsts may also be suitable |
| Swiss Tweezers, Curved Tips | KAI | #504505 | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |
References
- Liang, T., Motan, T. Mature Oocyte Cryopreservation for Fertility Preservation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 951, 155-161 (2016).
- Yoon, T. K., et al. Live births after vitrification of oocytes in a stimulated in vitro fertilization-embryo transfer program. Fertility and Sterility. 79 (6), 1323-1326 (2003).
- Donnez, J., et al. Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. Lancet. 364 (9443), 1405-1410 (2004).
- Meirow, D., et al. Pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a patient with ovarian failure after chemotherapy. New England Journal of Medicine. 353 (3), 318-321 (2005).
- De Vos, M., Devroey, P., Fauser, B. C.
- Scott, R. T., et al. Follicle-stimulating hormone levels on cycle day 3 are predictive of in vitro fertilization outcome. Fertility and Sterility. 51 (4), 651-654 (1989).
- Ferraretti, A. P., et al. ESHRE consensus on the definition of 'poor response' to ovarian stimulation for in vitro fertilization: the Bologna criteria. Human Reproduction. 26 (7), 1616-1624 (2011).
- Huhtaniemi, I., et al. Advances in the Molecular Pathophysiology, Genetics, and Treatment of Primary Ovarian Insufficiency. Trends in Endocrinology and Metabolism. 29 (6), 400-419 (2018).
- Męczekalski, B., Maciejewska-Jeske, M., Podfigurna, A. Reproduction in premature ovarian insufficiency patients - from latest studies to therapeutic approach. Prz Menopauzalny. 17 (3), 117-119 (2018).
- Baker, V. Life plans and family-building options for women with primary ovarian insufficiency. Seminars in Reproductive Medicine. 29 (4), 362-372 (2011).
- Englert, Y., Govaerts, I. Oocyte donation: particular technical and ethical aspects. Human Reproduction. 13, Suppl 2 90-97 (1998).
- Englert, Y., Rodesch, C., Laruelle, C., Govoerts, I. Oocyte donation: ethical aspects related to the donor. Contraception, Fertilite, Sexualite. 25 (3), 251-257 (1997).
- Storgaard, M., et al. Obstetric and neonatal complications in pregnancies conceived after oocyte donation: a systematic review and meta-analysis. BJOG: An International Journal of Obstetrics and Gynaecology. 124 (4), 561-572 (2017).
- Storgaard, M., Malchau, S., Loft, A., Larsen, E., Pinborg, A. Oocyte donation is associated with an increased risk of complications in the pregnant woman and the fetus. Ugeskrift for Laeger. 179 (11), (2017).
- Kawamura, K., et al. Hippo signaling disruption and Akt stimulation of ovarian follicles for infertility treatment. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17474-17479 (2013).
- Hsueh, A. J., Kawamura, K., Cheng, Y., Fauser, B. C.
- Li, J., et al. Activation of dormant ovarian follicles to generate mature eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10280-10284 (2010).
- Suzuki, N., et al. Successful fertility preservation following ovarian tissue vitrification in patients with primary ovarian insufficiency. Human Reproduction. 30 (3), 608-615 (2015).
- Tanaka, Y., Hsueh, A. J., Kawamura, K. Surgical approaches of drug-free in activation and laparoscopic ovarian incision to treat patients with ovarian infertility. Fertility and Sterility. , (2020).
- Kawamura, K., Ishizuka, B., Hsueh, A. J. W. Drug-free in-vitro activation of follicles for infertility treatment in poor ovarian response patients with decreased ovarian reserve. Reproductive Biomedicine Online. 40 (2), 245-253 (2020).
- Haino, T., et al. Determination of Follicular Localization in Human Ovarian Cortex for Vitrification. Journal of Adolescent and Young Adult Oncology. 7 (1), 46-53 (2018).
- Baird, D. T., Webb, R., Campbell, B. K., Harkness, L. M., Gosden, R. G. Long-term ovarian function in sheep after ovariectomy and transplantation of autografts stored at -196 C. Endocrinology. 140 (1), 462-471 (1999).
- Qin, Y., Jiao, X., Simpson, J. L., Chen, Z. J. Genetics of primary ovarian insufficiency: new developments and opportunities. Human Reproduction Update. 21 (6), 787-808 (2015).
- Domniz, N., Meirow, D. Premature ovarian insufficiency and autoimmune diseases. Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 60, 42-55 (2019).
- Laven, J. S.
- Grynberg, M., et al.
- Tomao, F., Spinelli, G. P., Panici, P. B., Frati, L., Tomao, S. Ovarian function, reproduction and strategies for fertility preservation after breast cancer. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 76 (1), 1-12 (2010).
- Kim, S., Lee, Y., Lee, S., Kim, T. Ovarian tissue cryopreservation and transplantation in patients with cancer. Obstetrics & Gynecology Science. 61 (4), 431-442 (2018).
- Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue freezing: current status. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology. 27 (3), 222-230 (2015).
- Wu, R. C., Kuo, P. L., Lin, S. J., Liu, C. H., Tzeng, C. C. X chromosome mosaicism in patients with recurrent abortion or premature ovarian failure. Journal of the Formosan Medical Association. 92 (11), 953-956 (1993).
- De Munck, N., Vajta, G. Safety and efficiency of oocyte vitrification. Cryobiology. 78, 119-127 (2017).
- Argyle, C. E., Harper, J. C., Davies, M. C. Oocyte cryopreservation: where are we now. Human Reproduction Update. 22 (4), 440-449 (2016).
