Summary
توضح هذه المقالة تقنية زرع الأنسجة التي تم تصميمها لاختبار خصائص الإشارات والأنماط للدماغ الأمامي القاعدي أثناء النمو القحفي الوجهي.
Abstract
تم استخدام جنين الطيور كنظام نموذجي لأكثر من قرن وأدى إلى فهم أساسي لتطور الفقاريات. تتمثل إحدى نقاط القوة في هذا النظام النموذجي في أنه يمكن تقييم تأثير الأنسجة والتفاعل بينها مباشرة في الأجنة الوهمية. لقد أظهرنا سابقا أن الإشارات من الدماغ الأمامي تساهم في تشكل الوجه من خلال تنظيم شكل مجال التعبير للقنفذ الصوتي (SHH) في منطقة الأديم الظاهر الجبهي الأنفي (FEZ). في هذه المقالة ، يتم وصف طريقة توليد الوهم الأمامي وتقديم الرسوم التوضيحية لنتائج هذه التجارب.
Introduction
تركز الكثير من الأبحاث المعاصرة في علم الأحياء التنموي على دور الجينات في تشكيل الأجنة. هناك أدوات جيدة لفحص آليات النمو من منظور وراثي. ومع ذلك ، يتم تجميع الأجنة وتخضع للتشكل استجابة لتفاعلات الأنسجة. نظام الطيور هو أداة كلاسيكية تستخدم لتقييم مجموعة متنوعة من تفاعلات الأنسجة التي تنظم التطور للأسباب التالية: علم الأجنة مفهوم جيدا ، ويمكن الوصول إلى الأجنة بسهولة ، وأدوات تحليل أنظمة الطيور متطورة بشكل جيد ، والأجنة غير مكلفة.
تم استخدام نظام زرع الطيور على نطاق واسع لتتبع النسب وتقييم تفاعلات الأنسجة أثناء التطور لما يقرب منقرن من الزمان 1،2،3،4. تم استخدام هذا النظام للتحقيق في مركز الإشارات ، منطقة الأديم الظاهر الجبهي الأنفي (FEZ) ، الذي ينظم تشكل الفك العلوي5 ، وتم نشر مقطع فيديو يصف هذه التقنية سابقا6. بالإضافة إلى كتكوت السمان ، تم استخدام أنواع أخرى لإنتاج الكيميرا لتحليل تفاعلات الأنسجة. على سبيل المثال ، تم زرع الفأر FEZ من النوعالبري 7 والفئرانالطافرة 8 ، واستخدم آخرون أنظمة البط والسمان والكتاكيت لتقييم دور القمة العصبية في تشكيل الهيكل العظمي للوجه9،10،11،12.
في هذا العمل ، تم تقييم دور الدماغ الأمامي في تنظيم نمط التعبير الجيني في المنطقة الاقتصادية الحرة عن طريق زرع الدماغ الأمامي البطني بشكل متبادل بين أجنة السمان والبط والكتاكيت ، لأن إشارة من الدماغ الأمامي مطلوبة للحث على تعبير القنفذ الصوتي في المنطقة الاقتصادية الحرة. عمليات زرع الدماغ الأمامي ليست فريدة من نوعها في هذا المجال. تم استخدام عمليات الزرع هذه لتقييم تطور الحركة في أجنة السمان والبط13 ، على الرغم من أنه في هذه التجارب تم أيضا زرع الأنسجة التي ساهمت في المشتقات غير العصبية. في أعمال أخرى ، تم تقييم الدوائر السمعية في الطيور عن طريق زرع الدماغ الأمامي 14 ، لكن عمليات الزرع هذه احتوت على خلايا قمة عصبية مفترضة ، والتي تساهم في تشكيل الوجه9،10 وتشارك في تنظيم تعبير SHH في FEZ15. ومن ثم ، تم ابتكار نظام لزرع الدماغ الأمامي البطني فقط من نوع واحد من الطيور إلى آخر قبل إغلاق الأنبوب العصبي لتقييم دور الدماغ في شكل الوجه16 (الشكل 1 أ ، ب). كانت هذه الطريقة خالية من تلوث القمة العصبية للكسب غير المشروع. في هذه المقالة ، يتم توضيح الطريقة ووصف النتائج المتوقعة ، ومناقشة التحديات التي تواجهها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتم تحضين بط بيكين الأبيض (Anas platyrhynchos) ودجاج Leghorn الأبيض (Gallus gallus) والسمان الياباني (Cortunix coturnix japonica) عند 37 درجة مئوية في غرفة مرطبة حتى يتم مطابقتها في HH7 / 817.
1. تحضير أنسجة المتبرع
ملاحظة: تم وصف تحضير الكواشف والأدوات وكيفية فتح البيض للتلاعب التجريبي6.
- قم بإعداد وسائط DMEM باللون الأحمر المحايد ، وماصة نقل الزجاج ، وإبر التنغستن الحادة.
- كشف الأجنة (كما هو موضح في6).
- حصاد ترقيع الأنسجة من الجانب الأيسر من الدماغ الأمامي القاعدي للمرحلة 7/8 من الأجنة. استخدم إبر التنغستن الحادة المنحنية 6 لشق قطعة من الدماغ الأمامي برفق بطول ~ 0.3 مم وعرض 0.2 مم ، مع التأكد من عدم تضمين الأديم الباطن الأساسي عن طريق تحريك الإبرة أسفل الدماغ الأمامي بحيث تكون الإبرة موازية لمحور الأنبوبالعصبي .
- باستخدام ماصة نقل الزجاج ، التقط الكسب غير المشروع من الجنين المانح.
- انقل الكسب غير المشروع إلى DMEM الذي يحتوي على أحمر محايد (0.01٪ في PBS ، 23 درجة مئوية) لمدة دقيقتين لتلطيخه ، ثم ضع الكسب غير المشروع الملون في DMEM الذي لا يحتوي على أحمر محايد حتى يصبح جاهزا للنقش.
2. إعداد المضيف
- احتضان البيض المخصب من دجاج ليغورن الأبيض (جالوس جالوس) على حرارة 37 درجة مئوية في غرفة مرطبة حتى HH7 / 8 17.
- كشف الأجنة (كما هو موضح في6).
- باستخدام إبر التنغستن الحادة ، قم بإعداد موقع الكسب غير المشروع عن طريق القطع برفق ، ثم إزالة قطعة 0.3 مم × 0.2 مم من الدماغ الأمامي القاعدي من الجانب الأيسر لاستيعاب الكسب غير المشروع كما حدث لعزل أنسجة المتبرع.
- احرص على تجنب الاضطراب المفرط للأديم الباطن الأساسي ، والذي سيكون واضحا حيث ستبدأ حبيبات صفار البيض في التسرب من خلال أي تمزق يتم إجراؤه. هذا يتطلب ممارسة ولن تنجح كل المحاولات.
- بعد الانتقال إلى المضيف6 ، ضع الكسب غير المشروع ليحل محل الدماغ الأمامي القاعدي المستأصل للمضيف.
- ضع الشريط بإحكام فوق الفتحة وأعد الجنين إلى حاضنة 37 درجة مئوية للمدة الزمنية المناسبة للتحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تقييم الخيمرية وتلوث الزرع
من أجل تقييم الوهم ، يجب معالجة مدى الوهم وتلوث الكسب غير المشروع بأنواع الخلايا الأخرى. يسمح إنشاء الوهم عن طريق زرع أنسجة السمان في أجنة الفرخ بهذا النوع من التحليل. باستخدام خلايا السمان للأجسام المضادة QCPN يمكن تصورها وتمييزها عن الأنسجة المضيفة (الشكل 1 C ، D). في هذه الحالة ، تم تلطيخ الأنسجة المشتقة من الدماغ الأمامي البطني فقط بالجسم المضاد مما يشير إلى أن الكسب غير المشروع لم يكن ملوثا بأنواع الخلايا الأخرى بما في ذلك القمة العصبية. يمكن تقدير مدى الخيمرية من هذه الأقسام باستخدام علم التعقيم إما لحساب الخلايا المضيفة والمانحة أو من خلال تقييم المنطقة التي تشغلها أنسجة المتبرع والمضيف.
تقييم النتائج المورفولوجية والجزيئية
كان الهدف هو تقييم تأثير الدماغ الأمامي البطني على مورفولوجيا الوجه وتعبيرات SHH في المنطقة الاقتصادية الحرة. في البداية ، تم زرع أنسجة السمان في أجنة البط من أجل استخدام QCPN لتقييم الخيمرية كما هو موضح أعلاه. ومع ذلك ، أدى دماغ السمان الأسرع نموا إلى وهم مشوه بشدة (الشكل 2) ، مما حال دون هذا النهج في التجارب. بسبب هذا القيد ، تم استخدام زرع أنسجة البط في أجنة الدجاج للتحليل التجريبي. في حين أن هذا لم يسمح بتقييم الخيمرية ، فقد تم استخدام نظام فرخ السمان للقيام بذلك وأكد أن جميع الطعوم كانت تتكون فقط من الأنسجة العصبية16. كان لوهم فراخ البط الناتج تغيرات مورفولوجية تشير إلى أن الدماغ شارك في تنظيم التشكل (الشكل 3). يبدو أن جانب البط من عملية الزرع يتطور بشكل أبطأ وبدا أكثر شبها بالبط. تم استخدام تحليل كمي لتحديد أن هذه الوهم قد تحولت نحو مورفولوجيا البط16. كما تطابقت مرحلة الضوابط مع أجنة البط والكتاكيت ، وكذلك تم استخدام وهم الفرخ.
تم استخدام التهجين الكامل في الموقع لتقييم تعبير SHH . على غرار التشكل ، بدا تعبير SHH على جانب البط من الوهم أكثر شبها بالبط (الشكل 3). تم استخدام التحليل الكمي18 أيضا لإظهار أن مجال التعبير هذا مرتبط بشكل الرأس16.
الشكل 1. زرع وتقييم الخيمرية في الأجنة التجريبية
(أ) منظر ظهري لجنين الدجاج في المرحلة 8 مصبوغ باللون الأحمر المحايد يوضح موقع الكسب غير المشروع وموقع النقش. الخط المنقط هو المستوى التقريبي الموضح في B. (B) المقطع العرضي من خلال جنين الدجاج في المرحلة 8 بعد التهجين في الموقع لإظهار تعبير SHH . يظهر الموقع التقريبي للكسب غير المشروع ، مربع منقط أحمر. (ج) يظهر التلوين المناعي للكشف عن QCPN في كيميرا كتكوت السمان أن الكسب غير المشروع واسع الانتشار ويساهم فقط في الأنبوب العصبي البطني الجانبي (السهم) والكأس البصري البطني (رأس السهم). (د) تكبير أعلى في C. أشرطة المقياس: أ: 500 ميكرومتر ، ب: 100 ميكرومتر ، ج: 1 مم ، د: 200 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2. تقييم مورفولوجيا كيميرا بطة السمان.
(أ، ب) مثالان على كيميرا بطة السمان في المرحلة 22. هذه الأجنة لديها تشوهات خطيرة تمنع المزيد من التحليل. شريط المقياس: 2 مم الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3. تقييم كيميرا البط الفرخ.
(أ) الفرخ الطبيعي و (ب) أجنة البط في المرحلة 22 بعد التهجين الكامل في الموقع لتصور تعبير SHH . (ج) يظهر التحكم في الفرخ والفرخ نمطا من SHH والتشكل يشبه جنين الفرخ الطبيعي. (د) يظهر وهم كتكوت البط نمطا متغيرا من تعبير SHH . على الجانب المزروع ، يكون تعبير SHH (الخط المنقط الأصفر) أكثر تقريبا ويشبه نمط البط. كما أن حفرة الأنف أكثر تقريبا على الجانب المزروع (السهم الأصفر) مقارنة بالمظهر الأكثر "شقا" على الجانب المضيف (السهم الأحمر). يشير الشريط الأحمر إلى خط الوسط وتكون عملية الزرع على الجانب الأيمن من الصورة. شريط المقياس: 1 مم الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تسمح الطريقة الموصوفة بفحص تفاعلات الأنسجة بين الدماغ الأمامي القاعدي والأديم الظاهر المجاور. يختلف هذا النهج عن طرق زراعة الدماغ الأمامي السابقة ، لأن أنسجة المتبرع كانت مقصورة على الدماغ الأمامي البطني. هذا يلغي زرع خلايا القمة العصبية ، والتي ثبت أنها تشارك في تشكيل مورفولوجيا الوجه 9,10. ومن ثم ، كان قصر الكسب غير المشروع على الدماغ الأمامي القاعدي ضروريا لتقييم النتائج التجريبية المخطط لها.
في البحث السابق الذي استخدم عمليات زرع الدماغ الأمامي13,14 ، لم يتداخل وجود الأنسجة خارج الأعصاب مع تفسير مقاييس النتائج المخطط لها ، لأن النتائج كانت إما سلوكية ، أو اختبرت على وجه التحديد بيئة المضيف والمتبرع على نمو الدماغ بشكل عام. هذا اعتبار مهم في تصميم التجارب باستخدام هذه الأساليب الجنينية ويجب موازنة الجدوى مع الدقة. على سبيل المثال ، خلق شرط استبعاد خلايا القمة العصبية المفترضة عقبات كبيرة للتغلب عليها. كان لا بد من إجراء عمليات الزرع على أجنة مرحلة العصب المبكرة. في هذه المراحل ، يكون الأديم الباطن مجاورا مباشرة لموقع الزرع ، وكان لا بد من توخي الحذر الشديد لتجنب إتلاف الأديم الباطن ، لأن هذا يقلل من البقاء على قيد الحياة. في حين أنه ليس من الواضح أن تلوث الكسب غير المشروع بواسطة الأديم الباطن سيؤثر على مقاييس النتائج ، كان الهدف هو عزل تأثير الدماغ الأمامي البطني حصريا على نمو الوجه. لذلك ، لهذا الغرض كان هناك ما يبرر الصرامة الإضافية.
وينبغي إيلاء الاعتبار لمعدل نمو الأنواع المضيفة والمانحة. في حين تم استخدام الاختلافات في معدلات هذه الحيوانات للاستفادة منها في تقييم دور خلايا القمة العصبية في تصميم الهيكل العظمي للوجه النامي19,20 ، في هذه الحالة ، خلقت الأنسجة العصبية للسمان الأسرع نموا أجنة مشوهة للغاية عند زرعها في البطة البطة البطة البطيئة النامية. هذا يعني أنه يجب تقييم الخيمرية والتلوث في مجموعة أخرى من الوهم التي تم إنشاؤها عن طريق تطعيم أنسجة السمان في مضيفات الكتاكيت ، وعلى الرغم من أنها ليست مثالية ، إلا أن هذا وفر الثقة في تقنية التطعيم.
بشكل عام ، يمكن أن يكون إنشاء الوهم لتقييم تفاعلات الأنسجة أثناء التطور طريقة قوية للمساعدة في فهم آليات التطور. يجب توخي الحذر خلال مراحل التخطيط لضمان أن تكون النتائج حاسمة قدر الإمكان ، وتحديد الضوابط المناسبة التي تشمل الأجنة الطبيعية وغيرها من الوهم لحساب الاختلاف بسبب الجراحة. في هذه الحالة ، كان من المهم للغاية استخدام التحليلات الكمية ، لأن التغييرات التي لوحظت كانت دقيقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
جميع المؤلفين ليس لديهم ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم الأبحاث الواردة في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني لأبحاث الأسنان والقحف الوجهي التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت أرقام الجوائز R01DE019648 و R01DE018234 و R01DE019638.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | TEK | TEKZR114 | |
| 35x10 mm Petri dish | Falcon | 1008 | |
| DMEM | Thermofisher | 11965084 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Neutral Red | Sigma | 553-24-2 | |
| No. 5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Pasteur Pipets | Thermofisher | 13-678-6B | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma bank, Iowa University, Iowa, USA | ||
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Tungsten Needle | Fine Science Tools | 26000 |
References
- Waddington, C. Developmental Mechanics of Chicken and Duck Embryos. Nature. 125, 924-925 (1930).
- Noden, D. M. The role of the neural crest in patterning of avian cranial skeletal, connective, and muscle tissues. Developmental Biology. 96 (1), 144-165 (1983).
- Borue, X., Noden, D. M. Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm. Development. 131 (16), 3967-3980 (2004).
- Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M.
- Hu, D., Marcucio, R. S., Helms, J. A. A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face. Development. 130 (9), 1749-1758 (2003).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Assessing signaling properties of ectodermal epithelia during craniofacial development. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals. Developmental Biology. 325 (1), 200-210 (2009).
- Griffin, J. N., et al. Fgf8 dosage determines midfacial integration and polarity within the nasal and optic capsules. Developmental Biology. 374 (1), 185-197 (2013).
- Schneider, R. A., Helms, J. A. The cellular and molecular origins of beak morphology. Science. 299 (5606), 565-568 (2003).
- Tucker, A. S., Lumsden, A. Neural crest cells provide species-specific patterning information in the developing branchial skeleton. Evolution & Development. 6 (1), 32-40 (2004).
- Fish, J. L., Schneider, R. A. Assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
- Schneider, R. A. Neural crest and the origin of species-specific pattern. Genesis. 56 (6-7), 23219 (2018).
- Sohal, G. S. Effects of reciprocal forebrain transplantation on motility and hatching in chick and duck embryos. Brain Research. 113 (1), 35-43 (1976).
- Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. Interspecies avian brain chimeras reveal that large brain size differences are influenced by cell-interdependent processes. PLoS One. 7 (7), 42477 (2012).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Neural crest cells pattern the surface cephalic ectoderm during FEZ formation. Developmental Dynamics. 241 (4), 732-740 (2012).
- Hu, D., et al. Signals from the brain induce variation in avian facial shape. Developmental Dynamics. 244 (9), 1133-1143 (2015).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Xu, Q., et al. Correlations Between the Morphology of Sonic Hedgehog Expression Domains and Embryonic Craniofacial Shape. Evolutionary Biology. 42 (3), 379-386 (2015).
- Eames, B. F., Schneider, R. A. The genesis of cartilage size and shape during development and evolution. Development. 135 (23), 3947-3958 (2008).
- Merrill, A. E., Eames, B. F., Weston, S. J., Heath, T., Schneider, R. A. Mesenchyme-dependent BMP signaling directs the timing of mandibular osteogenesis. Development. 135 (7), 1223-1234 (2008).
