Summary
Bu makalede, kraniyofasiyal gelişim sırasında bazal ön beynin sinyal ve paternleme özelliklerini test etmek için tasarlanmış bir doku nakli tekniği anlatılmaktadır.
Abstract
Kuş embriyosu, bir yüzyıldan fazla bir süredir model bir sistem olarak kullanılmış ve omurgalı gelişiminin temel olarak anlaşılmasına yol açmıştır. Bu model sisteminin güçlü yönlerinden biri, kimerik embriyolarda dokuların etkisinin ve dokular arasındaki etkileşimin doğrudan değerlendirilebilmesidir. Daha önce ön beyinden gelen sinyallerin, Frontonazal Ektodermal Bölgede (FEZ) Sonik kirpi (SHH) ekspresyon alanının şeklini düzenleyerek yüz morfogenezine katkıda bulunduğunu göstermiştik. Bu makalede, ön beyin kimeralarını üretme yöntemi ve bu deneylerin sonuçlarının illüstrasyonları açıklanmaktadır.
Introduction
Gelişim biyolojisindeki birçok çağdaş araştırma, embriyoların şekillendirilmesinde genlerin rolüne odaklanmaktadır. Gelişimsel mekanizmaları genetik bir perspektiften incelemek için iyi araçlar vardır. Bununla birlikte, embriyolar bir araya getirilir ve doku etkileşimlerine yanıt olarak morfogeneze tabi tutulur. Kuş sistemi, aşağıdaki nedenlerden dolayı gelişimi düzenleyen doku etkileşimlerinin çeşitliliğini değerlendirmek için kullanılan klasik bir araçtır: embriyoloji iyi anlaşılmıştır, embriyolara kolayca erişilebilir, kuş sistemlerinin analizi için araçlar iyi gelişmiştir ve embriyolar ucuzdur.
Kuş nakli sistemi, soy takibi ve gelişim sırasındaki doku etkileşimlerini değerlendirmek için neredeyse bir yüzyıl boyunca yaygın olarak kullanılmaktadır 1,2,3,4. Bu sistem, üst çene5'in morfogenezini düzenleyen bir sinyal merkezi olan Frontonazal Ektodermal Zon'u (FEZ) araştırmak için kullanıldı ve daha önce bu tekniği tanımlayan bir video yayınlandı6. Bıldırcın-civcivlere ek olarak, doku etkileşimlerinin analizi için kimera üretmek için başka türler de kullanılmıştır. Örneğin, fare FEZ'si vahşi tip7 ve mutant fareler8'den nakledildi ve diğerleri, yüz iskeleti 9,10,11,12'nin modellenmesinde nöral tepenin rolünü değerlendirmek için bir ördek, bıldırcın ve civciv sistemleri kullandılar.
Bu çalışmada, bıldırcın, ördek ve civciv embriyoları arasında ventral ön beyni karşılıklı olarak naklederek FEZ'deki gen ekspresyonunun paternini düzenlemede ön beynin rolü değerlendirilmiştir, çünkü FEZ'de Sonic kirpi ekspresyonunu indüklemek için ön beyinden bir sinyal gereklidir. Ön beyin nakilleri bu alanda benzersiz değildir. Bu nakiller, bıldırcın ve ördek embriyolarında motilitenin gelişimini değerlendirmek için kullanıldı13, ancak bu deneylerde nöral olmayan türevlere katkıda bulunan dokular da nakledildi. Diğer çalışmalarda, kuşlardaki işitsel devreler ön beyin nakli14 ile değerlendirilmiştir, ancak bu nakiller, yüz şekli 9,10'a katkıda bulunan ve FEZ15'te SHH ekspresyonunun düzenlenmesine katılan varsayımsal nöral krest hücreleri içeriyordu. Bu nedenle, beynin yüz şeklindeki rolünü değerlendirmek için nöral tüpün kapanmasından önce sadece ventral ön beyni bir kuş türünden diğerine nakletmek için bir sistem geliştirilmiştir16 (Şekil 1A, B). Bu yöntemde greftin nöral krest kontaminasyonu yoktu. Bu makalede yöntem gösterilerek beklenen sonuçlar açıklanmış ve karşılaşılan zorluklar tartışılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Beyaz Pekin ördeği (Anas platyrhynchos), beyaz Leghorn tavuğu (Gallus gallus) ve Japon bıldırcını (Cortunix coturnix japonica), HH7/8 17'de aşama eşleşene kadar nemlendirilmiş bir odada37 ° C'de inkübe edilir.
1. Donör dokunun hazırlanması
NOT: Reaktiflerin ve aletlerin hazırlanması ve deneysel manipülasyon için yumurtaların nasıl açılacağı açıklanmıştır6.
- DMEM ortamını nötr kırmızı, cam transfer pipeti ve keskinleştirilmiş tungsten iğneleri ile hazırlayın.
- Embriyoları açığa çıkarın (6'da gösterildiği gibi).
- Evre 7/8 embriyoların bazal ön beyninin sol tarafından doku greftleri toplayın. Ön beynin ~ 0.3 mm uzunluğunda ve 0.2 mm genişliğinde bir parçasını hafifçe kesmek için kavisli keskinleştirilmiş tungsten iğneleri6 kullanın, iğneyi ön beynin altına kaydırarak altta yatan endodermi içermediğinizden emin olun, böylece iğne nöral tüpün eksenine paralel olur.
- Cam transfer pipetini kullanarak, grefti donör embriyodan alın.
- Grefti boyamak için 2 dakika boyunca Nötr Kırmızı (PBS'de% 0.01, 23 °C) içeren DMEM'ye aktarın ve ardından boyanmış grefti engraftmana hazır olana kadar Nötr Kırmızı içermeyen DMEM'e yerleştirin.
2. Ev sahibini hazırlama
- Döllenmiş yumurtaları beyaz Leghorn tavuğundan (Gallus gallus) 37 ° C'de HH7/8 17'ye kadar nemlendirilmiş bir odada kuluçkaya yatırın.
- Embriyoları açığa çıkarın (6'da gösterildiği gibi).
- Keskinleştirilmiş tungsten iğneleri kullanarak, greft bölgesini yavaşça keserek hazırlayın, ardından donör dokuyu izole etmek için yapıldığı gibi grefti yerleştirmek için sol taraftan 0.3 mm x 0.2 mm'lik bir bazal ön beyin parçasını çıkarın.
- Altta yatan endodermin aşırı bozulmasını önlemeye dikkat edin, bu da yumurta sarısı granülleri yapılan herhangi bir yırtılmadan sızmaya başlayacağı için belirgin olacaktır. Bu pratik gerektirir ve tüm girişimler başarılı olmaz.
- Konakçı6'ya transfer ettikten sonra, grefti konağın dökülmüş bazal ön beynini değiştirecek şekilde konumlandırın.
- Bandı deliğin üzerine sıkıca yerleştirin ve embriyoyu analiz için uygun süre boyunca 37 ° C inkübatöre geri gönderin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kimerizm ve Transplantasyon Kontaminasyonunun Değerlendirilmesi
Kimeraları değerlendirmek için, kimerizmin derecesi ve greftin diğer hücre tipleriyle kontaminasyonu ele alınmalıdır. Bıldırcın dokularını civciv embriyolarına naklederek kimera oluşturmak bu tür analizlere izin verir. QCPN antikoru kullanılarak bıldırcın hücreleri görselleştirilebilir ve konakçı dokulardan ayırt edilebilir (Şekil 1 C,D). Bu durumda, sadece ventral ön beyinden türetilen dokular, greftin nöral krest de dahil olmak üzere diğer hücre tipleriyle kontamine olmadığını gösteren antikor ile boyandı. Kimerizmin kapsamı, konakçı ve donör hücrelerini saymak için stereoloji kullanılarak veya donör ve konakçı dokuların işgal ettiği alanı değerlendirerek bu bölümlerden tahmin edilebilir.
Morfolojik ve Moleküler Sonuçların Değerlendirilmesi
Amaç, ventral ön beynin FEZ'de fasiyal morfoloji ve SHH ekspresyonu üzerindeki etkisini değerlendirmektir. Başlangıçta, bıldırcın dokusu, yukarıda tarif edildiği gibi kimerizmi değerlendirmek için QCPN'yi kullanmak üzere ördek embriyolarına nakledildi. Bununla birlikte, daha hızlı gelişen bıldırcın beyni, deneylerde bu yaklaşımı engelleyen ciddi şekilde deforme olmuş kimeralara yol açmıştır (Şekil 2). Bu sınırlama nedeniyle, ördek dokularının tavuk embriyolarına nakledilmesi deneysel analiz için kullanılmıştır. Bu, kimerizmin değerlendirilmesine izin vermese de, bunu yapmak için bıldırcın civciv sistemi kullanıldı ve tüm greftlerin sadece sinir dokusundan oluştuğunu doğruladı16. Ortaya çıkan ördek-civciv kimeraları, beynin morfolojiyi düzenlemeye katıldığını gösteren morfolojik değişikliklere sahipti (Şekil 3). Naklin ördek tarafı daha yavaş gelişti ve daha ördek benzeri görünüyordu. Bu kimeraların ördek morfolojisine doğru kaydığını belirlemek için nicel bir analiz kullanılmıştır16. Kontrol aşaması olarak ördek ve civciv embriyolarının yanı sıra civciv-civciv kimeraları kullanıldı.
SHH ekspresyonunu değerlendirmek için tüm mount in situ hibridizasyon kullanıldı. Morfolojiye benzer şekilde, kimeranın ördek tarafındaki SHH ekspresyonu daha ördek benzeri görünüyordu (Şekil 3). Bu ekspresyon alanının kafa şekli16 ile ilişkili olduğunu göstermek için nicel bir analiz18 de kullanılmıştır.
Şekil 1. Deneysel Embriyolarda Transplantasyon ve Kimerizmin Değerlendirilmesi
(A) Greft ve engraftman bölgesinin yerini gösteren nötr kırmızıyla boyanmış evre 8 tavuk embriyosunun dorsal görünümü. Noktalı çizgi, SHH ekspresyonunu göstermek için in situ hibridizasyondan sonra bir aşama 8 tavuk embriyosu boyunca B. (B) kesitinde gösterilen yaklaşık seviyedir. Greftin yaklaşık yeri kırmızı noktalı kutu olarak gösterilir. (C) Bıldırcın-civciv kimeralarında QCPN'yi saptamak için immün boyama, greftin yaygın olduğunu ve sadece ventro-lateral nöral tüpe (ok) ve ventral optik kaba (ok ucu) katkıda bulunduğunu gösterir. (D) C. Ölçek çubuklarında daha yüksek büyütme: A: 500 μm, B: 100 μm, C: 1 mm, D: 200 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Bıldırcın-Ördek Kimeralarının Morfolojisinin Değerlendirilmesi.
(A, B) 22. aşamada bıldırcın-ördek kimeralarının iki örneği. Bu embriyolar, daha fazla analizi engelleyen ciddi malformasyonlara sahiptir. Ölçek çubuğu: 2 mm Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Ördek-Civciv Kimeralarının Değerlendirilmesi.
(A) SHH ekspresyonunu görselleştirmek için tüm montaj in situ hibridizasyonundan sonra 22. aşamada normal civciv ve (B) ördek embriyoları. (C) Bir civciv-civciv kontrolü, normal bir civciv embriyosuna benzeyen bir SHH paterni ve morfolojisi gösterir. (D) Bir ördek-civciv kimerası, SHH ifadesinin değiştirilmiş bir modelini gösterir. Nakledilen tarafta SHH ifadesi (sarı noktalı çizgi) daha yuvarlaktır ve ördek desenine benzer. Burun çukuru ayrıca nakledilen tarafta (sarı ok), konakçı taraftaki (kırmızı ok) daha "yarık" benzeri görünüme kıyasla daha yuvarlaktır. Kırmızı çubuk orta çizgiyi gösterir ve nakil görüntünün sağ tarafındadır. Ölçek çubuğu: 1 mm Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tarif edilen yöntem, bazal ön beyin ile komşu ektoderm arasındaki doku etkileşimlerinin incelenmesine izin verir. Bu yaklaşım önceki ön beyin nakli yöntemlerinden farklıdır, çünkü donör dokusu ventral ön beyinle sınırlıydı. Bu, yüz morfolojisinin modellenmesine katıldığı gösterilen nöral krest hücrelerinin transplantasyonunu ortadan kaldırır 9,10. Bu nedenle, greftin bazal ön beyinle sınırlandırılması, planlanan deneysel sonuçların değerlendirilmesi için çok önemliydi.
Ön beyin nakillerinin kullanıldığı önceki araştırmalarda13,14 Ekstra-nöral dokunun varlığı, planlanan sonuç ölçütlerinin yorumlanmasına müdahale etmedi, çünkü sonuçlar ya davranışsaldı ya da genel beyin gelişimi üzerinde konakçı ve donör ortamını özel olarak test etti. Bu, bu embriyolojik yaklaşımları kullanarak deneylerin tasarlanmasında önemli bir husustur ve fizibilite titizlikle dengelenmelidir. Örneğin, varsayımsal nöral krest hücrelerini dışlama gereksinimi, üstesinden gelmek için önemli engeller yarattı. Nakillerin erken nevrul evresi embriyolar üzerinde yapılması gerekiyordu. Bu aşamalarda endoderm, nakil bölgesine hemen bitişiktir ve endoderme zarar vermemek için aşırı özen gösterilmesi gerekiyordu, çünkü bu sağkalımı azaltır. Greftin endoderm ile kontaminasyonunun sonuç ölçütlerini etkileyeceği açık olmasa da, amaç sadece ventral ön beynin yüz gelişimi üzerindeki etkisini izole etmekti. Bu nedenle, bu amaç için ekstra titizlik garanti edildi.
Konakçı ve donör türlerin gelişim hızına dikkat edilmelidir. Bu hayvanların oranlarındaki farklılıklar, nöral krest hücrelerinin gelişmekte olan yüz iskeletini modellemedeki rolünü değerlendirmede avantaj sağlamak için kullanılmış olsa da19,20, bu durumda, daha hızlı gelişen bıldırcın sinir dokusu, daha yavaş gelişen ördeğe nakledildiğinde son derece hatalı biçimlendirilmiş embriyolar yaratmıştır. Bu, kimerizm ve kontaminasyonun, bıldırcın dokusunun civciv konakçılarına aşılanmasıyla oluşturulan başka bir kimera kümesinde değerlendirilmesi gerektiği anlamına geliyordu ve ideal olmasa da, bu aşılama tekniğine güven sağladı.
Genel olarak, gelişim sırasında doku etkileşimlerini değerlendirmek için kimeralar oluşturmak, gelişim mekanizmalarını anlamaya yardımcı olmak için güçlü bir yaklaşım olabilir. Sonuçların mümkün olduğunca kesin olmasını sağlamak için planlama aşamalarında özen gösterilmeli ve ameliyata bağlı varyasyonları hesaba katmak için normal embriyoları ve diğer kimeraları içeren uygun kontroller belirlenmelidir. Bu durumda, nicel analizlerin kullanılması çok önemliydi, çünkü gözlemlenen değişiklikler inceydi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Acknowledgments
Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Diş ve Kraniofasiyal Araştırma Enstitüsü tarafından R01DE019648, R01DE018234 ve R01DE019638 ödül numaraları altında desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | TEK | TEKZR114 | |
| 35x10 mm Petri dish | Falcon | 1008 | |
| DMEM | Thermofisher | 11965084 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Neutral Red | Sigma | 553-24-2 | |
| No. 5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Pasteur Pipets | Thermofisher | 13-678-6B | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma bank, Iowa University, Iowa, USA | ||
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Tungsten Needle | Fine Science Tools | 26000 |
References
- Waddington, C. Developmental Mechanics of Chicken and Duck Embryos. Nature. 125, 924-925 (1930).
- Noden, D. M. The role of the neural crest in patterning of avian cranial skeletal, connective, and muscle tissues. Developmental Biology. 96 (1), 144-165 (1983).
- Borue, X., Noden, D. M. Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm. Development. 131 (16), 3967-3980 (2004).
- Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M.
- Hu, D., Marcucio, R. S., Helms, J. A. A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face. Development. 130 (9), 1749-1758 (2003).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Assessing signaling properties of ectodermal epithelia during craniofacial development. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals. Developmental Biology. 325 (1), 200-210 (2009).
- Griffin, J. N., et al. Fgf8 dosage determines midfacial integration and polarity within the nasal and optic capsules. Developmental Biology. 374 (1), 185-197 (2013).
- Schneider, R. A., Helms, J. A. The cellular and molecular origins of beak morphology. Science. 299 (5606), 565-568 (2003).
- Tucker, A. S., Lumsden, A. Neural crest cells provide species-specific patterning information in the developing branchial skeleton. Evolution & Development. 6 (1), 32-40 (2004).
- Fish, J. L., Schneider, R. A. Assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
- Schneider, R. A. Neural crest and the origin of species-specific pattern. Genesis. 56 (6-7), 23219 (2018).
- Sohal, G. S. Effects of reciprocal forebrain transplantation on motility and hatching in chick and duck embryos. Brain Research. 113 (1), 35-43 (1976).
- Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. Interspecies avian brain chimeras reveal that large brain size differences are influenced by cell-interdependent processes. PLoS One. 7 (7), 42477 (2012).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Neural crest cells pattern the surface cephalic ectoderm during FEZ formation. Developmental Dynamics. 241 (4), 732-740 (2012).
- Hu, D., et al. Signals from the brain induce variation in avian facial shape. Developmental Dynamics. 244 (9), 1133-1143 (2015).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Xu, Q., et al. Correlations Between the Morphology of Sonic Hedgehog Expression Domains and Embryonic Craniofacial Shape. Evolutionary Biology. 42 (3), 379-386 (2015).
- Eames, B. F., Schneider, R. A. The genesis of cartilage size and shape during development and evolution. Development. 135 (23), 3947-3958 (2008).
- Merrill, A. E., Eames, B. F., Weston, S. J., Heath, T., Schneider, R. A. Mesenchyme-dependent BMP signaling directs the timing of mandibular osteogenesis. Development. 135 (7), 1223-1234 (2008).
