Summary
本文介绍了一种组织移植技术，旨在测试颅面发育过程中基底前脑的信号传导和模式特性。
Abstract
一个多世纪以来，鸟类胚胎一直被用作模型系统，并导致了对脊椎动物发育的基本理解。该模型系统的优势之一是可以直接在嵌合胚胎中评估组织的影响和相互作用。我们之前已经表明，来自前脑的信号通过调节额鼻外胚层区（FEZ）中声波刺猬（SHH）的表达域的形状来促进面部形态发生。在本文中，描述了产生前脑嵌合体的方法，并提供了这些实验结果的说明。
Introduction
许多当代发育生物学研究都集中在基因在塑造胚胎中的作用。有很好的工具可以从遗传学的角度检查发育机制。然而，胚胎被组装并响应组织相互作用而发生形态发生。禽系统是用于评估调节发育的各种组织相互作用的经典工具，原因如下：胚胎学很好理解，胚胎很容易获得，分析鸟类系统的工具发达，胚胎便宜。
近一个世纪以来，禽类移植系统已被广泛用于谱系追踪和评估发育过程中的组织相互作用1，2，3，4。该系统用于研究调节上颌形态发生的信号中心，即额鼻外胚层区（FEZ），并发布了一段视频，描述了该技术6。除了鹌鹑雏，其他物种也被用来产生嵌合体，用于分析组织相互作用。例如，小鼠FEZ是从野生7型和突变小鼠8移植而来的，其他人使用鸭，鹌鹑和小鸡系统来评估神经嵴在面部骨骼图案化中的作用9，10，11，12。
在这项工作中，通过在鹌鹑、鸭和雏鸡胚胎中相互移植腹侧前脑，评估了前脑在调节自由经济区基因表达模式中的作用，因为需要来自前脑的信号来诱导声波刺猬在自由经济区中的表达。前脑移植在该领域并非独一无二。这些移植用于评估鹌鹑和鸭胚胎的运动发育13，尽管在这些实验中也移植了有助于非神经衍生物的组织。在其他工作中，鸟类的听觉回路已经通过前脑移植14进行评估，但这些移植含有推定的神经嵴细胞，这些细胞有助于面部形状9，10 并参与调节FEZ15中的SHH表达。因此，设计了一种在神经管闭合之前仅将腹侧前脑从一种鸟类移植到另一种鸟类的系统，以评估大脑在面部形状中的作用16 （图1A，B）。这种方法没有移植物的神经嵴污染。本文对该方法进行了说明，描述了预期结果，并讨论了面临的挑战。
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Protocol
将白北京鸭（Anas platyrhynchos），白里格霍恩鸡（Gallus gallus）和日本鹌鹑（Cortunix coturnix japonica）在37°C的加湿室中孵育，直到在HH7/ 8 17进行阶段匹配。
1. 准备供体组织
注意：试剂和工具的制备以及如何打开鸡蛋进行实验操作已经描述6.
- 用中性红色、玻璃转移移液器和锋利的钨针制备 DMEM 培养基。
- 暴露胚胎（如6所示）。
- 从7/8期胚胎基底前脑左侧收获组织移植物。使用弯曲的锋利钨针6 轻轻切开一块长~0.3毫米，宽0.2毫米的前脑，确保不包括下面的内胚层，方法是将针头滑到前脑下方，使针头平行于神经管的轴线。
- 使用玻璃移液管，从供体胚胎中取出移植物。
- 将移植物转移到含有中性红（PBS中0.01%，23°C）的DMEM中2分钟以染色，然后将染色的移植物放入不含中性红的DMEM中，直到准备植入。
2. 准备主机
- 将白勒霍恩鸡（Gallus gallus）的受精卵在37°C的加湿室中孵化至HH7 / 8 17。
- 暴露胚胎（如6所示）。
- 使用锋利的钨针，通过轻轻切割来准备移植部位，然后从左侧取出0.3毫米乘0.2毫米的基底前脑片以容纳移植物，就像分离供体组织一样。
- 注意避免过度破坏下面的内胚层，这将很明显，因为蛋黄颗粒将开始通过任何眼泪泄漏。这需要练习，并非所有尝试都会成功。
- 转移到宿主6后，定位移植物以替换已切除的宿主基底前脑。
- 将胶带紧紧地放在孔上，并将胚胎返回到37°C培养箱中适当的时间长度进行分析。
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Representative Results
嵌合体和移植污染的评估
为了评估嵌合体，应解决嵌合和移植物与其他细胞类型的污染程度。通过将鹌鹑组织移植到雏鸡胚胎中来创建嵌合体允许这种类型的分析。使用QCPN抗体可以可视化鹌鹑细胞并将其与宿主组织区分开来（图1 C，D）。在这种情况下，只有来自腹侧前脑的组织被抗体染色，表明移植物没有被其他细胞类型（包括神经嵴）污染。 嵌合的程度可以从这些部分估计，使用立体学来计数宿主和供体细胞，或者通过评估供体和宿主组织所占据的面积。
形态学和分子学结果的评估
目的是评估腹侧前脑对自由经济区面部形态和 SHH 表达的影响。最初，将鹌鹑组织移植到鸭胚胎中，以便使用QCPN评估上述嵌合体。然而，发育较快的鹌鹑脑导致嵌合体严重变形（图2），这在实验中排除了这种方法。由于这种限制，将鸭组织移植到鸡胚胎中用于实验分析。虽然这不允许评估嵌合体，但鹌鹑雏鸟系统用于执行此操作，并确认所有移植物仅由神经组织组成16。由此产生的鸭雏嵌合体具有形态变化，表明大脑参与调节形态（图3）。移植的鸭子侧似乎发育较慢，看起来更像鸭子。定量分析用于确定这些嵌合体向鸭形态学16转移。作为对照阶段，使用匹配的鸭和小鸡胚胎，以及雏鸡 - 小鸡嵌合体。
使用全安装 原位 杂交来评估 SHH 表达。与形态相似，嵌合体鸭侧的 SHH 表达看起来更像鸭子（图3）。定量分析18 也用于显示该表达结构域与头部形状16相关。
图1.实验胚胎嵌合体的移植和评估
（A）用中性红色染色的第8期鸡胚胎的背视图，显示移植物和植入部位的位置。虚线是B.（B）原位杂交后通过8期鸡胚的横截面以显示 SHH 表达的近似水平。显示了移植物的大致位置，红色虚线框。（C）免疫染色以检测鹌鹑雏鸡嵌合体中的QCPN表明移植物广泛存在，并且仅有助于腹侧神经管（箭头）和腹侧视杯（箭头）。（D） C.比例尺放大倍率更高：A：500微米，B：100微米，C：1毫米，D：200微米。 请点击此处查看此图的大图。
图2.评估鹌鹑鸭嵌合体的形态。
（一、二）第22阶段的两个鹌鹑鸭嵌合体的例子。这些胚胎有严重的畸形，无法进一步分析。比例尺： 2 mm 请点击此处查看此图的大图。
图3.评估鸭雏鸡嵌合体。
（A）正常雏鸡和（B）鸭胚胎在 全位原 位杂交后第22阶段可视化 SHH 表达。（C）雏鸡对照显示类似于正常雏鸡胚胎的 SHH 和形态模式。（D）鸭雏嵌合体显示出 SHH 表达的改变模式。在移植侧， SHH 表情（黄色虚线）更圆润，类似于鸭子图案。与宿主侧更像“狭缝”的外观（红色箭头）相比，移植侧的鼻坑（黄色箭头）也更圆润。红色条表示中线，移植位于图像的右侧。比例尺： 1 mm 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
所描述的方法允许检查基底前脑和相邻外胚层之间的组织相互作用。这种方法与以前的前脑移植方法不同，因为供体组织仅限于腹侧前脑。这消除了神经嵴细胞的移植，神经嵴细胞已被证明参与面部形态的图案化9，10。因此，将移植物限制在基底前脑对于评估计划的实验结果至关重要。
在先前采用前脑移植的研究中13，14，神经外组织的存在不会干扰对计划结果测量的解释，因为结果要么是行为上的，要么是专门测试宿主和供体环境对整体大脑发育的影响。这是使用这些胚胎学方法设计实验的重要考虑因素，可行性必须与严谨性相平衡。例如，排除推定神经嵴细胞的要求造成了需要克服的重大障碍。移植必须在早期神经阶段的胚胎上进行。在这些阶段，内胚层紧邻移植部位，必须格外小心以避免损坏内胚层，因为这会降低存活率。虽然目前尚不清楚内胚层对移植物的污染会影响结果测量，但目标是专门分离腹侧前脑对面部发育的影响。因此，出于这个目的，额外的严谨是有道理的。
需要考虑宿主和供体物种的发展速度。虽然这些动物比率的差异已被用于评估神经嵴细胞在发育中的面部骨骼模式中的作用19，20，但在这种情况下，发育较快的鹌鹑神经组织在移植到发育较慢的鸭子中时会产生极其畸形的胚胎。这意味着必须在另一组嵌合体中评估嵌合体和污染，这些嵌合体是通过将鹌鹑组织移植到雏鸡宿主中创建的，虽然不理想，但这确实为嫁接技术提供了信心。
总体而言，创建嵌合体来评估发育过程中的组织相互作用可能是帮助理解发育机制的有力方法。在计划阶段需要小心，以确保结果尽可能具有决定性，并确定适当的对照，包括正常胚胎和其他嵌合体，以解释手术引起的变异。在这种情况下，采用定量分析非常重要，因为观察到的变化是微妙的。
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Disclosures
所有作者都没有什么可透露的。
Acknowledgments
本出版物中报告的研究得到了美国国立卫生研究院国家牙科和颅面研究所的支持，奖励号为R01DE019648，R01DE018234和R01DE019638。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | TEK | TEKZR114 | |
| 35x10 mm Petri dish | Falcon | 1008 | |
| DMEM | Thermofisher | 11965084 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Neutral Red | Sigma | 553-24-2 | |
| No. 5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Pasteur Pipets | Thermofisher | 13-678-6B | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma bank, Iowa University, Iowa, USA | ||
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Tungsten Needle | Fine Science Tools | 26000 |
References
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