Summary
Denne artikel beskriver en vævstransplantationsteknik, der er designet til at teste signal- og mønsteregenskaberne hos basal forhjerne under kraniofacial udvikling.
Abstract
Fugleembryoet er blevet brugt som modelsystem i mere end et århundrede og har ført til grundlæggende forståelse af hvirveldyrs udvikling. En af styrkerne ved dette modelsystem er, at effekten af og interaktionen mellem væv kan vurderes direkte i kimære embryoner. Vi har tidligere vist, at signaler fra forhjernen bidrager til ansigtsmorfogenese ved at regulere formen på ekspressionsdomænet for sonisk pindsvin (SHH) i Frontonasal Ectodermal Zone (FEZ). I denne artikel beskrives metoden til generering af forhjernekimærerne og illustrationer af resultaterne af disse eksperimenter.
Introduction
Meget moderne forskning i udviklingsbiologi fokuserer på genernes rolle i udformningen af embryoner. Der er gode værktøjer til at undersøge udviklingsmekanismer fra et genetisk perspektiv. Imidlertid samles embryoner og gennemgår morfogenese som reaktion på vævsinteraktioner. Fuglesystemet er et klassisk værktøj, der bruges til at vurdere de forskellige vævsinteraktioner, der regulerer udviklingen af følgende grunde: embryologien er velforstået, embryonerne er let tilgængelige, værktøjer til analyse af fuglesystemer er veludviklede, og embryonerne er billige.
Fugletransplantationssystemet har været meget anvendt til afstamningssporing og til vurdering af vævsinteraktioner under udvikling i næsten et århundrede 1,2,3,4. Dette system blev brugt til at undersøge et signalcenter, Frontonasal Ectodermal Zone (FEZ), der regulerer morfogenese af overkæben5, og en video blev offentliggjort, der beskriver denne teknik tidligere6. Ud over vagtel-chick er andre arter også blevet brugt til at producere kimærer til analyse af vævsinteraktioner. For eksempel blev musens FEZ transplanteret fra vilde type7 og mutante mus8, og andre har brugt et ande-, vagtel- og kyllingsystem til at vurdere neurale kams rolle i mønster af ansigtsskelettet 9,10,11,12.
I dette arbejde blev forhjernens rolle i reguleringen af genekspressionsmønsteret i FEZ ved at transplantere den ventrale forhjerne gensidigt blandt vagtler, ænder og kyllingembryoner vurderet, fordi der kræves et signal fra forhjernen for at inducere sonisk pindsvineekspression i FEZ. Forebrain transplantationer er ikke unikke på området. Disse transplantationer blev brugt til at vurdere udviklingen af motilitet i vagtel- og andeembryoner13, selvom der i disse forsøg også blev transplanteret væv, der bidrog til ikke-neurale derivater. I andet arbejde er auditive kredsløb hos fugle blevet vurderet ved forhjernetransplantation14, men disse transplantationer indeholdt formodede neurale kamceller, som bidrager til ansigtsform 9,10 og deltager i reguleringen af SH-ekspression i FEZ 15. Derfor blev et system til kun at transplantere den ventrale forhjerne fra en fugleart til en anden inden lukning af neuralrøret udtænkt for at vurdere hjernens rolle i ansigtsform16 (figur 1A, B). Denne metode var blottet for neurale kamforurening af transplantatet. I denne artikel illustreres metoden, og de forventede resultater beskrives, og de udfordringer, der står over for, diskuteres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hvid Pekinand (Anas platyrhynchos), hvid leghornkylling (Gallus gallus) og japansk vagtel (Cortunix coturnix japonica) udruges ved 37 °C i et befugtet kammer, indtil den matches ved HH7/817.
1. Klargøring af donorvæv
BEMÆRK: Fremstilling af reagenser og værktøj og hvordan man åbner æg til eksperimentel manipulation er beskrevet6.
- Forbered DMEM-medier med neutral rød, en glasoverførselspipette og skærpede wolframnåle.
- Udsæt embryoner (som vist i6).
- Høst vævstransplantater fra venstre side af basal forhjerne i fase 7/8 embryoner. Brug buede skærpede wolframnåle6 til forsigtigt at skære et stykke af forhjernen, der måler ~ 0,3 mm i længden med 0,2 mm i bredden, og sørg for ikke at inkludere den underliggende endoderm ved at glide nålen under forhjernen, så nålen er parallel med neuralrørets akse.
- Brug glasoverførselspipetten til at samle transplantatet op fra donorembryoet.
- Overfør transplantatet til DMEM, der indeholder neutral rød (0,01% i PBS, 23 °C) i 2 minutter for at plette det, og placer derefter det farvede transplantat i DMEM, der ikke indeholder neutral rød, før det er klar til engraftment.
2. Forberedelse af værten
- Befrugtede æg fra hvid leghornkylling (Gallus gallus) inkuberes ved 37 °C i et befugtet kammer indtil HH7/8 17.
- Udsæt embryoner (som vist i6).
- Brug skærpede wolframnåle til at forberede transplantatstedet ved forsigtigt at skære og derefter fjerne et 0,3 mm x 0,2 mm stykke basal forhjerne fra venstre side for at rumme transplantatet, som det blev gjort for at isolere donorvævet.
- Pas på at undgå overdreven forstyrrelse af den underliggende endoderm, hvilket vil være tydeligt, da æggeblommegranulat begynder at lække gennem enhver tåre, der er lavet. Dette kræver øvelse, og ikke alle forsøg vil lykkes.
- Efter overførsel til værten6 skal du placere transplantatet for at erstatte værtens uddøde basale forhjerne.
- Tapen anbringes stramt over hullet, og embryonet sættes tilbage i inkubatoren ved 37 °C i et passende tidsrum til analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vurdering af kimærisme og transplantationsforurening
For at vurdere kimærerne bør omfanget af kimærisme og kontaminering af transplantatet med andre celletyper behandles. Oprettelse af kimærer ved at transplantere vagtelvæv i kyllingembryoner muliggør denne type analyse. Ved hjælp af QCPN kan vagtelceller visualiseres og skelnes fra værtsvævene (figur 1 C, D). I dette tilfælde blev kun væv afledt af den ventrale forhjerne farvet med antistoffet, hvilket indikerer, at transplantatet ikke var forurenet med andre celletyper, herunder neurale kam. Omfanget af kimærisme kunne estimeres ud fra disse sektioner ved hjælp af stereologi til enten at tælle værts- og donorceller eller ved at vurdere det område, der er optaget af donor- og værtsvæv.
Vurdering af morfologiske og molekylære resultater
Målet var at vurdere virkningen af den ventrale forhjerne på ansigtsmorfologi og SSH-ekspression i FEZ. Indledningsvis blev vagtelvæv transplanteret i ænderembryoner for at anvende QCPN til at vurdere kimærisme som beskrevet ovenfor. Den hurtigere udviklende vagtelhjerne førte imidlertid til alvorligt deformerede kimærer (figur 2), hvilket udelukkede denne tilgang i forsøgene. På grund af denne begrænsning blev transplantation af ændervæv i kyllingembryoner anvendt til eksperimentel analyse. Selvom dette ikke tillod vurdering af kimærisme, blev vagtelkyllingsystemet brugt til at gøre dette og bekræftede, at alle transplantaterne kun bestod af neuralt væv16. De resulterende and-chick kimærer havde morfologiske ændringer, der antydede, at hjernen deltog i regulering af morfologi (figur 3). Andesiden af transplantationen syntes at udvikle sig langsommere og syntes mere andlignende. En kvantitativ analyse blev brugt til at bestemme, at disse kimærer blev flyttet mod andemorfologi16. Som kontrolstadium blev matchede ande- og kyllingembryoner samt chick-chick kimærer brugt.
Hele mount in situ hybridisering blev brugt til at vurdere SSH-ekspression . I lighed med morfologi syntes SH-ekspression på andesiden af kimæren mere andelignende (figur 3). En kvantitativ analyse18 blev også brugt til at vise, at dette udtryksdomæne var korreleret med hovedform16.
Figur 1. Transplantation og vurdering af kimærisme i eksperimentelle embryoner
A) Rygbillede af fase 8-kyllingeembryo farvet med neutralt rødt, der viser podnings- og indkapslingsstedets placering. Den stiplede linje er det omtrentlige niveau vist i B. (B) Tværsnit gennem et trin 8 kyllingeembryo efter in situ-hybridisering for at vise SH-ekspression . Den omtrentlige placering af transplantatet vises, rød prikket boks. (C) Immunfarvning til påvisning af QCPN i vagtel-chick kimærer viser, at transplantatet er udbredt og kun bidrager til det ventro-laterale neurale rør (pil) og ventral optisk kop (pilespids). (D) Højere forstørrelse i C. Skalastænger: A: 500 μm, B: 100 μm, C: 1 mm, D: 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2. Vurdering af morfologi af vagtel-ænder-kimærer.
(A, B) To eksempler på vagtel-ænder kimærer på stadium 22. Disse embryoner har alvorlige misdannelser, der udelukker yderligere analyse. Vægtbjælke: 2 mm Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3. Vurdering af and-chick kimærer.
(A) Normale chick og (B) duck embryoner på stadium 22 efter hele mount in situ hybridisering for at visualisere SHH ekspression. (C) En chick-chick kontrol viser et mønster af SHH og morfologi, der ligner et normalt chick embryo. (D) En ande-chick kimær viser et ændret mønster af SHH udtryk. På den transplanterede side er SH-udtrykket (gul prikket linje) mere afrundet og ligner andemønsteret. Næsegraven er også mere afrundet på den transplanterede side (gul pil) sammenlignet med det mere "slidsede" udseende på værtssiden (rød pil). Den røde bjælke angiver midterlinjen, og transplantationen er på højre side af billedet. Vægtbjælke: 1 mm Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrevne metode tillader undersøgelse af vævsinteraktionerne mellem den basale forhjerne og den tilstødende ektoderm. Denne tilgang adskiller sig fra tidligere forhjernetransplantationsmetoder, fordi donorvævet var begrænset til den ventrale forhjerne. Dette eliminerer transplantation af neurale kamceller, som har vist sig at deltage i mønstrende ansigtsmorfologi 9,10. Derfor var det vigtigt at begrænse transplantatet til den basale forhjerne for at evaluere de planlagte eksperimentelle resultater.
I den tidligere forskning, der anvendte forhjernetransplantationer13,14, interfererede tilstedeværelsen af ekstraneuralt væv ikke med fortolkningen af de planlagte resultatmål, fordi resultaterne enten var adfærdsmæssige eller specifikt testede værts- og donormiljøet på den samlede hjerneudvikling. Dette er en vigtig overvejelse ved udformningen af forsøg ved hjælp af disse embryologiske tilgange, og gennemførligheden skal afbalanceres med strenghed. For eksempel skabte kravet om at udelukke de formodede neurale kamceller betydelige hindringer at overvinde. Transplantationerne skulle udføres på embryoner i tidlig neurula-fase. På disse stadier er endodermen umiddelbart ved siden af transplantationsstedet, og der måtte udvises ekstrem forsigtighed for at undgå at beskadige endodermen, fordi dette reducerer overlevelsen. Selvom det ikke er klart, at forurening af transplantatet med endoderm ville påvirke resultatmålingerne, var målet udelukkende at isolere effekten af den ventrale forhjerne på ansigtsudviklingen. Så til dette formål var den ekstra strenghed berettiget.
Der skal tages hensyn til værts- og donorarternes udviklingshastighed. Mens forskelle i satserne for disse dyr er blevet brugt til fordel i vurderingen af neurale kamcellers rolle i mønsteret af det udviklende ansigtsskelet19,20, skabte det hurtigere udviklende vagtelneurale væv i dette tilfælde ekstremt misdannede embryoner, når de transplanteres til den langsommere udviklende and. Dette betød, at kimærisme og forurening skulle vurderes i et andet sæt kimærer skabt ved podning af vagtelvæv i kyllingværter, og selvom det ikke var ideelt, gav dette tillid til podningsteknikken.
Samlet set kan oprettelse af kimærer til vurdering af vævsinteraktioner under udvikling være en stærk tilgang til at hjælpe med at forstå udviklingsmekanismer. Der skal udvises forsigtighed i planlægningsfasen for at sikre, at resultaterne bliver så afgørende som muligt, og der skal fastlægges passende kontroller, der omfatter normale embryoner og andre kimærer for at tage højde for variation på grund af kirurgi. I dette tilfælde var det meget vigtigt at anvende kvantitative analyser, fordi de observerede ændringer var subtile.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Institute of Dental and Craniofacial Research of the National Institutes of Health under tildelingsnumre R01DE019648, R01DE018234 og R01DE019638.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | TEK | TEKZR114 | |
| 35x10 mm Petri dish | Falcon | 1008 | |
| DMEM | Thermofisher | 11965084 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Neutral Red | Sigma | 553-24-2 | |
| No. 5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Pasteur Pipets | Thermofisher | 13-678-6B | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma bank, Iowa University, Iowa, USA | ||
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Tungsten Needle | Fine Science Tools | 26000 |
References
- Waddington, C. Developmental Mechanics of Chicken and Duck Embryos. Nature. 125, 924-925 (1930).
- Noden, D. M. The role of the neural crest in patterning of avian cranial skeletal, connective, and muscle tissues. Developmental Biology. 96 (1), 144-165 (1983).
- Borue, X., Noden, D. M. Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm. Development. 131 (16), 3967-3980 (2004).
- Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M.
- Hu, D., Marcucio, R. S., Helms, J. A. A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face. Development. 130 (9), 1749-1758 (2003).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Assessing signaling properties of ectodermal epithelia during craniofacial development. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals. Developmental Biology. 325 (1), 200-210 (2009).
- Griffin, J. N., et al. Fgf8 dosage determines midfacial integration and polarity within the nasal and optic capsules. Developmental Biology. 374 (1), 185-197 (2013).
- Schneider, R. A., Helms, J. A. The cellular and molecular origins of beak morphology. Science. 299 (5606), 565-568 (2003).
- Tucker, A. S., Lumsden, A. Neural crest cells provide species-specific patterning information in the developing branchial skeleton. Evolution & Development. 6 (1), 32-40 (2004).
- Fish, J. L., Schneider, R. A. Assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
- Schneider, R. A. Neural crest and the origin of species-specific pattern. Genesis. 56 (6-7), 23219 (2018).
- Sohal, G. S. Effects of reciprocal forebrain transplantation on motility and hatching in chick and duck embryos. Brain Research. 113 (1), 35-43 (1976).
- Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. Interspecies avian brain chimeras reveal that large brain size differences are influenced by cell-interdependent processes. PLoS One. 7 (7), 42477 (2012).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Neural crest cells pattern the surface cephalic ectoderm during FEZ formation. Developmental Dynamics. 241 (4), 732-740 (2012).
- Hu, D., et al. Signals from the brain induce variation in avian facial shape. Developmental Dynamics. 244 (9), 1133-1143 (2015).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Xu, Q., et al. Correlations Between the Morphology of Sonic Hedgehog Expression Domains and Embryonic Craniofacial Shape. Evolutionary Biology. 42 (3), 379-386 (2015).
- Eames, B. F., Schneider, R. A. The genesis of cartilage size and shape during development and evolution. Development. 135 (23), 3947-3958 (2008).
- Merrill, A. E., Eames, B. F., Weston, S. J., Heath, T., Schneider, R. A. Mesenchyme-dependent BMP signaling directs the timing of mandibular osteogenesis. Development. 135 (7), 1223-1234 (2008).
