Summary
Dit artikel beschrijft een weefseltransplantatietechniek die is ontworpen om de signalerings- en patrooneigenschappen van basale voorhersenen tijdens craniofaciale ontwikkeling te testen.
Abstract
Het vogelembryo wordt al meer dan een eeuw gebruikt als een modelsysteem en heeft geleid tot fundamenteel begrip van de ontwikkeling van gewervelde dieren. Een van de sterke punten van dit modelsysteem is dat het effect van en de interactie tussen weefsels direct kan worden beoordeeld in chimere embryo's. We hebben eerder aangetoond dat signalen van de voorhersenen bijdragen aan de morfogenese van het gezicht door de vorm van het expressiedomein van sonic hedgehog (SHH) in de frontonasale ectodermale zone (FEZ) te reguleren. In dit artikel wordt de methode beschreven om de hersenchimaeren van de voorhersenen te genereren en illustraties te geven van de resultaten van deze experimenten.
Introduction
Veel hedendaags onderzoek in de ontwikkelingsbiologie richt zich op de rol van genen bij het vormen van embryo's. Er zijn goede tools om ontwikkelingsmechanismen vanuit een genetisch perspectief te onderzoeken. Embryo's worden echter geassembleerd en ondergaan morfogenese als reactie op weefselinteracties. Het vogelsysteem is een klassiek hulpmiddel dat wordt gebruikt om de verscheidenheid aan weefselinteracties te beoordelen die de ontwikkeling reguleren om de volgende redenen: de embryologie is goed begrepen, de embryo's zijn gemakkelijk toegankelijk, hulpmiddelen voor analyse van vogelsystemen zijn goed ontwikkeld en de embryo's zijn goedkoop.
Het vogeltransplantatiesysteem wordt al bijna een eeuw op grote schaal gebruikt voor het traceren van afstammingslijnen en om weefselinteracties tijdens de ontwikkeling te beoordelen 1,2,3,4. Dit systeem werd gebruikt om een signaleringscentrum te onderzoeken, de Frontonasal Ectodermal Zone (FEZ), dat morfogenese van de bovenkaak5 reguleert, en er werd een video gepubliceerd waarin die techniek eerderwerd beschreven 6. Naast kwartelkuikens zijn ook andere soorten gebruikt om chimaera's te produceren voor analyse van weefselinteracties. De muis FEZ werd bijvoorbeeld getransplanteerd van wild type7 en gemuteerde muizen8, en anderen hebben een eenden-, kwartel- en kuikensysteem gebruikt om de rol van neurale kuif te beoordelen bij het patroon van het gezichtsskelet 9,10,11,12.
In dit werk werd de rol van de voorhersenen bij het reguleren van het patroon van genexpressie in de FEZ door de ventrale voorhersenen wederzijds te transplanteren tussen kwartel-, eenden- en kuikenembryo's beoordeeld, omdat een signaal van de voorhersenen nodig is om Sonic-egelexpressie in de FEZ te induceren. Voorhersenentransplantaties zijn niet uniek in het veld. Deze transplantaties werden gebruikt om de ontwikkeling van motiliteit in kwartel- en eendenembryo's te beoordelen13, hoewel in deze experimenten ook weefsels werden getransplanteerd die bijdroegen aan niet-neurale derivaten. In ander werk zijn auditieve circuits bij vogels beoordeeld door voorhersenentransplantatie14, maar deze transplantaties bevatten vermoedelijke neurale topcellen, die bijdragen aan gezichtsvorm 9,10 en deelnemen aan het reguleren van SHH-expressie in de FEZ 15. Daarom werd een systeem bedacht om alleen de ventrale voorhersenen van de ene vogelsoort naar de andere te transplanteren voordat de neurale buis werd gesloten, om de rol van de hersenen in gezichtsvorm16 te beoordelen (figuur 1A, B). Deze methode was verstoken van neurale kambesmetting van het transplantaat. In dit artikel wordt de methode geïllustreerd en worden de verwachte resultaten beschreven en worden de uitdagingen besproken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Witte Pekineend (Anas platyrhynchos), witte Leghorn kip (Gallus gallus) en Japanse kwartel (Cortunix coturnix japonica) worden geïncubeerd bij 37 °C in een bevochtigde kamer totdat ze op HH7/817 worden gematcht.
1. Voorbereiding van het donorweefsel
OPMERKING: Bereiding van reagentia en gereedschappen en hoe eieren te openen voor experimentele manipulatie is beschreven6.
- Bereid DMEM-media voor met neutraal rood, een glazen transferpipet en geslepen wolfraamnaalden.
- Embryo's blootstellen (zoals weergegeven in6).
- Oogst weefseltransplantaten van de linkerkant van de basale voorhersenen van stadium 7/8 embryo's. Gebruik gebogen geslepen wolfraamnaalden6 om voorzichtig een stuk van de voorhersenen van ~ 0,3 mm lang en 0,2 mm breed in te snijden, waarbij u ervoor zorgt dat u het onderliggende endoderm niet opneemt door de naald onder de voorhersenen te schuiven, zodat de naald evenwijdig is aan de as van de neurale buis.
- Pak met behulp van de glazen transferpipet het transplantaat op van het donorembryo.
- Breng het transplantaat gedurende 2 minuten over in DMEM met neutraal rood (0,01% in PBS, 23 °C) om het te kleuren en plaats het gekleurde transplantaat vervolgens in DMEM dat geen neutraal rood bevat totdat het klaar is voor transplantatie.
2. De host voorbereiden
- Incubeer bevruchte eieren van witte Leghorn-kip (Gallus gallus) bij 37 °C in een bevochtigde kamer tot HH7/8 17.
- Embryo's blootstellen (zoals weergegeven in6).
- Bereid met behulp van geslepen wolfraamnaalden de transplantaatplaats voor door voorzichtig te snijden en vervolgens een stuk basale voorhersenen van 0,3 mm bij 0,2 mm van de linkerkant te verwijderen om het transplantaat te accommoderen, zoals werd gedaan om het donorweefsel te isoleren.
- Zorg ervoor dat u overmatige verstoring van het onderliggende endoderm vermijdt, wat duidelijk zal zijn als dooierkorrels beginnen te lekken door elke scheur die wordt gemaakt. Dit vergt oefening en niet alle pogingen zullen succesvol zijn.
- Na het overbrengen naar de gastheer6, plaatst u het transplantaat om de uitgeroeide basale voorhersenen van de gastheer te vervangen.
- Plaats de tape stevig over het gat en breng het embryo gedurende de juiste tijd voor analyse terug naar de 37 °C-couveuse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beoordeling van chimerisme en transplantatiebesmetting
Om de chimaera's te beoordelen, moet de mate van chimerisme en besmetting van het transplantaat met andere celtypen worden onderzocht. Het creëren van chimaera's door kwartelweefsels in kuikenembryo's te transplanteren, maakt dit soort analyse mogelijk. Met behulp van het QCPN-antilichaam kunnen kwartelcellen worden gevisualiseerd en onderscheiden van de gastheerweefsels (figuur 1 C,D). In dit geval werden alleen weefsels afkomstig van de ventrale voorhersenen gekleurd met het antilichaam, wat aangeeft dat het transplantaat niet was besmet met andere celtypen, waaronder neurale top. De mate van chimerisme kan worden geschat aan de hand van deze secties met behulp van stereologie om gastheer- en donorcellen te tellen of door het gebied te beoordelen dat door de donor- en gastheerweefsels wordt ingenomen.
Beoordeling van morfologische en moleculaire uitkomsten
Het doel was om de impact van de ventrale voorhersenen op de gezichtsmorfologie en SHH-expressie in de FEZ te beoordelen. Aanvankelijk werd kwartelweefsel getransplanteerd in eendenembryo's om QCPN te gebruiken om chimerisme te beoordelen zoals hierboven beschreven. Het zich sneller ontwikkelende kwartelbrein leidde echter tot ernstig misvormde hersenschimmen (figuur 2), wat deze aanpak in de experimenten uitsloot. Vanwege deze beperking werd het transplanteren van eendenweefsel in kippenembryo's gebruikt voor experimentele analyse. Hoewel dit geen beoordeling van chimerisme mogelijk maakte, werd het kwartelkuikensysteem gebruikt om dit te doen en bevestigde dat alle grafts alleen uit neuraal weefsel bestonden16. De resulterende eenden-kuiken chimaera's hadden morfologische veranderingen die suggereerden dat de hersenen deelnamen aan het reguleren van de morfologie (figuur 3). De eendenkant van de transplantatie leek zich langzamer te ontwikkelen en leek meer eendachtig. Een kwantitatieve analyse werd gebruikt om te bepalen of deze hersenschimmen werden verschoven naar eendenmorfologie16. Als controlestadium werden gematchte eenden- en kuikenembryo's gebruikt, evenals kuiken-kuiken chimaera's.
Whole mount in situ hybridisatie werd gebruikt om SHH-expressie te beoordelen. Net als bij de morfologie leek de SHH-expressie aan de eendenzijde van de chimaera meer eendachtig (figuur 3). Een kwantitatieve analyse18 werd ook gebruikt om aan te tonen dat dit expressiedomein gecorreleerd was met hoofdvorm16.
Figuur 1. Transplantatie en beoordeling van chimerisme in experimentele embryo's
(A) Dorsale weergave van stadium 8 kippenembryo gekleurd met neutraal rood met de locatie van de ent- en engraftmentplaats. Stippellijn is het geschatte niveau weergegeven in B. (B) Doorsnede door een stadium 8 kippenembryo na in situ hybridisatie om SHH-expressie te tonen. De geschatte locatie van het transplantaat wordt weergegeven, rood gestippeld vak. (C) Immunostaining om QCPN te detecteren in kwartel-kuiken chimaera's toont aan dat het transplantaat wijdverspreid is en alleen bijdraagt aan de ventro-laterale neurale buis (pijl) en ventrale optische cup (pijlpunt). (D) Hogere vergroting in C. Schaalbalken: A: 500 μm, B: 100 μm, C: 1 mm, D: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Beoordeling van de morfologie van kwarteeendchimaera's.
(A, B) Twee voorbeelden van kwartee-eend chimaera's in stadium 22. Deze embryo's hebben ernstige misvormingen die verdere analyse uitsluiten. Schaalbalk: 2 mm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Het beoordelen van eenden-kuiken chimaera's.
(A) Normale kuiken- en (B) eendenembryo's in stadium 22 na volledige mount in situ hybridisatie om SHH-expressie te visualiseren. (C) Een kuiken-kuikencontrole vertoont een patroon van SHH en morfologie dat lijkt op een normaal kuikenembryo. (D) Een eenden-kuiken chimaera vertoont een veranderd patroon van SHH-expressie . Aan de getransplanteerde zijde is SHH-expressie (gele stippellijn) meer afgerond en lijkt op het eendenpatroon. De neuskuil is ook meer afgerond aan de getransplanteerde kant (gele pijl) in vergelijking met het meer "spleet" uiterlijk aan de gastheerzijde (rode pijl). De rode balk geeft de middellijn aan en de transplantatie bevindt zich aan de rechterkant van het beeld. Schaalbalk: 1 mm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beschreven methode maakt het mogelijk om de weefselinteracties tussen de basale voorhersenen en het aangrenzende ectoderm te onderzoeken. Deze aanpak verschilt van eerdere voorhersenentransplantatiemethoden, omdat het donorweefsel beperkt was tot de ventrale voorhersenen. Dit elimineert transplantatie van de neurale topcellen, waarvan is aangetoond dat ze deelnemen aan patroonvormingvan gezichtsmorfologie 9,10. Daarom was het beperken van het transplantaat tot de basale voorhersenen essentieel om de geplande experimentele resultaten te evalueren.
In het eerdere onderzoek dat gebruik maakte van voorhersenentransplantaties13,14 interfereerde de aanwezigheid van extra-neuraal weefsel niet met de interpretatie van de geplande uitkomstmaten, omdat de uitkomsten ofwel gedragsmatig waren, of specifiek de gastheer- en donoromgeving testten op de algehele hersenontwikkeling. Dit is een belangrijke overweging bij het ontwerpen van experimenten met behulp van deze embryologische benaderingen en haalbaarheid moet worden afgewogen tegen striktheid. De vereiste om de vermoedelijke neurale topcellen uit te sluiten, creëerde bijvoorbeeld aanzienlijke obstakels om te overwinnen. De transplantaties moesten worden uitgevoerd op embryo's in het vroege neurulastadium. In deze stadia bevindt het endoderm zich direct naast de transplantatieplaats en moest uiterste zorg worden besteed om beschadiging van het endoderm te voorkomen, omdat dit de overleving vermindert. Hoewel het niet duidelijk is dat besmetting van het transplantaat door endoderm van invloed zou zijn op uitkomstmaten, was het doel om uitsluitend het effect van de ventrale voorhersenen op de gezichtsontwikkeling te isoleren. Dus voor dit doel was de extra strengheid gerechtvaardigd.
Er moet rekening worden gehouden met de ontwikkelingssnelheid van de gastheer- en donorsoort. Hoewel verschillen in de snelheden van deze dieren zijn gebruikt om te profiteren bij het beoordelen van de rol van neurale topcellen bij het patroon van het zich ontwikkelende gezichtsskelet19,20, creëerde in dit geval het zich sneller ontwikkelende kwartel neurale weefsel extreem misvormde embryo's bij transplantatie in de langzamer ontwikkelende eend. Dit betekende dat chimerisme en besmetting moesten worden beoordeeld in een andere set chimaera's die werden gecreëerd door kwartelweefsel in kuikengastheren te enten, en hoewel dit niet ideaal was, gaf dit wel vertrouwen in de enttechniek.
Over het algemeen kan het creëren van chimaera's om weefselinteracties tijdens de ontwikkeling te beoordelen een krachtige benadering zijn om ontwikkelingsmechanismen te helpen begrijpen. Tijdens de planningsfasen moet zorg worden besteed om ervoor te zorgen dat de resultaten zo overtuigend mogelijk zijn, en passende controles worden vastgesteld die normale embryo's en andere chimaera's omvatten om rekening te houden met variatie als gevolg van chirurgie. In dit geval was het erg belangrijk om kwantitatieve analyses te gebruiken, omdat de waargenomen veranderingen subtiel waren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Onderzoek gerapporteerd in deze publicatie werd ondersteund door het National Institute of Dental and Craniofacial Research van de National Institutes of Health onder toekenningsnummers R01DE019648, R01DE018234 en R01DE019638.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | TEK | TEKZR114 | |
| 35x10 mm Petri dish | Falcon | 1008 | |
| DMEM | Thermofisher | 11965084 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Neutral Red | Sigma | 553-24-2 | |
| No. 5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Pasteur Pipets | Thermofisher | 13-678-6B | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma bank, Iowa University, Iowa, USA | ||
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Tungsten Needle | Fine Science Tools | 26000 |
References
- Waddington, C. Developmental Mechanics of Chicken and Duck Embryos. Nature. 125, 924-925 (1930).
- Noden, D. M. The role of the neural crest in patterning of avian cranial skeletal, connective, and muscle tissues. Developmental Biology. 96 (1), 144-165 (1983).
- Borue, X., Noden, D. M. Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm. Development. 131 (16), 3967-3980 (2004).
- Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M.
- Hu, D., Marcucio, R. S., Helms, J. A. A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face. Development. 130 (9), 1749-1758 (2003).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Assessing signaling properties of ectodermal epithelia during craniofacial development. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals. Developmental Biology. 325 (1), 200-210 (2009).
- Griffin, J. N., et al. Fgf8 dosage determines midfacial integration and polarity within the nasal and optic capsules. Developmental Biology. 374 (1), 185-197 (2013).
- Schneider, R. A., Helms, J. A. The cellular and molecular origins of beak morphology. Science. 299 (5606), 565-568 (2003).
- Tucker, A. S., Lumsden, A. Neural crest cells provide species-specific patterning information in the developing branchial skeleton. Evolution & Development. 6 (1), 32-40 (2004).
- Fish, J. L., Schneider, R. A. Assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
- Schneider, R. A. Neural crest and the origin of species-specific pattern. Genesis. 56 (6-7), 23219 (2018).
- Sohal, G. S. Effects of reciprocal forebrain transplantation on motility and hatching in chick and duck embryos. Brain Research. 113 (1), 35-43 (1976).
- Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. Interspecies avian brain chimeras reveal that large brain size differences are influenced by cell-interdependent processes. PLoS One. 7 (7), 42477 (2012).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Neural crest cells pattern the surface cephalic ectoderm during FEZ formation. Developmental Dynamics. 241 (4), 732-740 (2012).
- Hu, D., et al. Signals from the brain induce variation in avian facial shape. Developmental Dynamics. 244 (9), 1133-1143 (2015).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Xu, Q., et al. Correlations Between the Morphology of Sonic Hedgehog Expression Domains and Embryonic Craniofacial Shape. Evolutionary Biology. 42 (3), 379-386 (2015).
- Eames, B. F., Schneider, R. A. The genesis of cartilage size and shape during development and evolution. Development. 135 (23), 3947-3958 (2008).
- Merrill, A. E., Eames, B. F., Weston, S. J., Heath, T., Schneider, R. A. Mesenchyme-dependent BMP signaling directs the timing of mandibular osteogenesis. Development. 135 (7), 1223-1234 (2008).
