Summary
Cet article décrit une technique de transplantation de tissus conçue pour tester les propriétés de signalisation et de structuration du cerveau antérieur basal au cours du développement craniofacial.
Abstract
L’embryon aviaire a été utilisé comme système modèle pendant plus d’un siècle et a conduit à une compréhension fondamentale du développement des vertébrés. L’une des forces de ce système modèle est que l’effet et l’interaction entre les tissus peuvent être directement évalués dans les embryons chimériques. Nous avons déjà montré que les signaux du cerveau antérieur contribuent à la morphogenèse faciale en régulant la forme du domaine d’expression du hérisson sonique (SHH) dans la zone ectodermique frontonasale (FEZ). Dans cet article, la méthode de génération des chimères du cerveau antérieur et de fournir des illustrations des résultats de ces expériences est décrite.
Introduction
Une grande partie de la recherche contemporaine en biologie du développement se concentre sur le rôle des gènes dans la formation des embryons. Il existe de bons outils pour examiner les mécanismes de développement d’un point de vue génétique. Cependant, les embryons sont assemblés et subissent une morphogenèse en réponse aux interactions tissulaires. Le système aviaire est un outil classique utilisé pour évaluer la variété des interactions tissulaires qui régulent le développement pour les raisons suivantes: l’embryologie est bien comprise, les embryons sont facilement accessibles, les outils d’analyse des systèmes aviaires sont bien développés et les embryons sont peu coûteux.
Le système de transplantation aviaire a été largement utilisé pour le traçage de la lignée et pour évaluer les interactions tissulaires au cours du développement depuis près d’un siècle 1,2,3,4. Ce système a été utilisé pour étudier un centre de signalisation, la zone ectodermique frontonasale (FEZ), qui régule la morphogenèse de la mâchoire supérieure5, et une vidéo a été publiée décrivant cette technique précédemment6. En plus de la caille-poussin, d’autres espèces ont également été utilisées pour produire des chimères pour l’analyse des interactions tissulaires. Par exemple, la souris FEZ a été transplantée à partir de souris sauvages de type7 et mutantes8, et d’autres ont utilisé un système de canard, de caille et de poussin pour évaluer le rôle de la crête neurale dans la structuration du squelette facial 9,10,11,12.
Dans ce travail, le rôle du cerveau antérieur dans la régulation du modèle d’expression génique dans la ZFE en transplantant réciproquement le cerveau antérieur ventral parmi les embryons de caille, de canard et de poussin a été évalué, car un signal du cerveau antérieur est nécessaire pour induire l’expression du hérisson Sonic dans la ZFE. Les greffes de cerveau antérieur ne sont pas uniques dans le domaine. Ces greffes ont été utilisées pour évaluer le développement de la motilité chez les embryons de cailles et de canards13, bien que dans ces expériences, des tissus contribuant à des dérivés non neuronaux aient également été transplantés. Dans d’autres travaux, les circuits auditifs chez les oiseaux ont été évalués par transplantation du cerveau antérieur14, mais ces greffes contenaient des cellules de crête neurale présumées, qui contribuent à la forme du visage 9,10 et participent à la régulation de l’expression de la SHH dans la FEZ 15. Par conséquent, un système permettant de transplanter uniquement le cerveau antérieur ventral d’une espèce d’oiseau à une autre avant la fermeture du tube neural a été conçu pour évaluer le rôle du cerveau dans la forme faciale16 (Figure 1A, B). Cette méthode était dépourvue de contamination de la crête neurale du greffon. Dans cet article, la méthode est illustrée et les résultats attendus sont décrits, et les défis rencontrés sont discutés.
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Protocol
Le canard blanc de Pékin (Anas platyrhynchos), le poulet Livourne blanc (Gallus gallus) et la caille japonaise (Cortunix coturnix japonica) sont incubés à 37 °C dans une chambre humidifiée jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade correspondant à HH7/817.
1. Préparation du tissu donneur
NOTE: La préparation des réactifs et des outils et la façon d’ouvrir les œufs pour la manipulation expérimentale ont été décrites6.
- Préparez les supports DMEM avec du rouge neutre, une pipette de transfert en verre et des aiguilles en tungstène affûtées.
- Exposer les embryons (comme indiqué aupoint 6).
- Prélever des greffes de tissus du côté gauche du cerveau antérieur basal des embryons de stade 7/8. Utilisez des aiguilles de tungstène aiguiséesincurvées 6 pour inciser doucement un morceau du cerveau antérieur mesurant ~0,3 mm de longueur sur 0,2 mm de largeur, en veillant à ne pas inclure l’endoderme sous-jacent en glissant l’aiguille sous le cerveau antérieur de sorte que l’aiguille soit parallèle à l’axe du tube neural.
- À l’aide de la pipette de transfert en verre, prélever le greffon sur l’embryon du donneur.
- Transférer le greffon dans du DMEM contenant du rouge neutre (0,01% dans PBS, 23 ° C) pendant 2 minutes pour le colorer, puis placer le greffon coloré dans le DMEM qui ne contient pas de rouge neutre jusqu’à ce qu’il soit prêt pour la greffe.
2. Préparation de l’hôte
- Incuber les œufs fécondés du poulet blanc Livourne (Gallus gallus) à 37 °C dans une chambre humidifiée jusqu’à HH7/8 17.
- Exposer les embryons (comme indiqué aupoint 6).
- À l’aide d’aiguilles de tungstène aiguisées, préparer le site du greffon en coupant doucement, puis en retirant un morceau de cerveau antérieur basal de 0,3 mm sur 0,2 mm du côté gauche pour accueillir le greffon comme cela a été fait pour isoler le tissu du donneur.
- Prenez soin d’éviter une perturbation excessive de l’endoderme sous-jacent, qui sera évidente lorsque les granules vitellins commenceront à couler à travers toute déchirure qui est faite. Cela demande de la pratique et toutes les tentatives ne seront pas couronnées de succès.
- Après le transfert à l’hôte6, positionner le greffon pour remplacer le cerveau antérieur basal extirpé de l’hôte.
- Placer le ruban adhésif hermétiquement sur le trou et remettre l’embryon dans l’incubateur à 37 °C pendant la durée appropriée pour l’analyse.
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Representative Results
Évaluation du chimérisme et de la contamination par les transplantations
Afin d’évaluer les chimères, l’étendue du chimérisme et la contamination du greffon par d’autres types de cellules doivent être abordées. La création de chimères par transplantation de tissus de caille dans des embryons de poussins permet ce type d’analyse. En utilisant l’anticorps QCPN, les cellules de caille peuvent être visualisées et distinguées des tissus hôtes (Figure 1 C,D). Dans ce cas, seuls les tissus dérivés du cerveau antérieur ventral ont été colorés avec l’anticorps, ce qui indique que la greffe n’était pas contaminée par d’autres types de cellules, y compris la crête neurale. L’étendue du chimérisme pourrait être estimée à partir de ces sections en utilisant la stérologie pour compter les cellules de l’hôte et du donneur ou en évaluant la zone occupée par le donneur et les tissus hôtes.
Évaluation des résultats morphologiques et moléculaires
L’objectif était d’évaluer l’impact du cerveau antérieur ventral sur la morphologie faciale et l’expression de la SHH dans la ZFE. Initialement, le tissu de caille a été transplanté dans des embryons de canard afin d’utiliser QCPN pour évaluer le chimérisme tel que décrit ci-dessus. Cependant, le développement plus rapide du cerveau de caille a conduit à des chimères gravement déformées (Figure 2), ce qui a empêché cette approche dans les expériences. En raison de cette limitation, la transplantation de tissus de canard dans des embryons de poulet a été utilisée pour l’analyse expérimentale. Bien que cela n’ait pas permis d’évaluer le chimérisme, le système de poussins de caille a été utilisé pour le faire et a confirmé que toutes les greffes étaient composées uniquement de tissu neural16. Les chimères canard-poussin qui en ont résulté présentaient des changements morphologiques suggérant que le cerveau participait à la régulation de la morphologie (Figure 3). Le côté canard de la greffe semblait se développer plus lentement et ressemblait davantage à un canard. Une analyse quantitative a été utilisée pour déterminer que ces chimères ont été déplacées vers la morphologie des canards16. Au stade témoin, des embryons de canard et de poussin appariés, ainsi que des chimères poussin-poussin ont été utilisés.
L’hybridation in situ sur support entier a été utilisée pour évaluer l’expression de SHH . Comme pour la morphologie, l’expression de SHH du côté canard de la chimère ressemblait davantage à celle d’un canard (Figure 3). Une analyse quantitative18 a également été utilisée pour montrer que ce domaine d’expression était corrélé avec la forme de la tête16.
Graphique 1. Transplantation et évaluation du chimérisme chez les embryons expérimentaux
(A) Vue dorsale de l’embryon de poulet de stade 8 coloré en rouge neutre indiquant l’emplacement du greffon et du site de greffe. La ligne pointillée est le niveau approximatif indiqué dans B. (B) Coupe transversale à travers un embryon de poulet de stade 8 après hybridation in situ pour montrer l’expression SHH . L’emplacement approximatif de la greffe est indiqué, boîte pointillée rouge. (C) L’immunomarquage pour détecter la QCPN chez les chimères caille-poussin montre que le greffon est répandu et ne contribue qu’au tube neural ventro-latéral (flèche) et à la coupe optique ventrale (pointe de flèche). (D) Grossissement plus élevé en C. Barres d’échelle: A: 500 μm, B: 100 μm, C: 1 mm, D: 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 2. Évaluation de la morphologie des chimères de canards.
(A, B) Deux exemples de chimères caille-canard au stade 22. Ces embryons présentent de graves malformations qui empêchent une analyse plus approfondie. Barre d’échelle: 2 mm Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 3. Évaluation des chimères canard-poussin.
(A) Poussins normaux et (B) embryons de canard au stade 22 après hybridation in situ pour visualiser l’expression de SHH . (C) Un témoin poussin-poussin montre un modèle de SHH et une morphologie qui ressemble à un embryon de poussin normal. (D) Une chimère canard-poussin présente un modèle modifié d’expression SHH . Du côté transplanté, l’expression SHH (ligne pointillée jaune) est plus arrondie et ressemble au motif du canard. La fosse nasale est également plus arrondie du côté transplanté (flèche jaune) par rapport à l’apparence plus « fendue » du côté de l’hôte (flèche rouge). La barre rouge indique la ligne médiane et la greffe se trouve sur le côté droit de l’image. Barre d’échelle: 1 mm Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La méthode décrite permet d’examiner les interactions tissulaires entre le cerveau antérieur basal et l’ectoderme adjacent. Cette approche diffère des méthodes précédentes de transplantation du cerveau antérieur, car le tissu du donneur était limité au cerveau antérieur ventral. Cela élimine la transplantation des cellules de la crête neurale, qui ont été montrées pour participer à la structuration de la morphologie faciale 9,10. Par conséquent, la restriction de la greffe au cerveau antérieur basal était essentielle pour évaluer les résultats expérimentaux prévus.
Dans la recherche précédente qui utilisait des greffes de cerveau antérieur13,14, la présence de tissu extra-neural n’interférait pas avec l’interprétation des mesures de résultats prévues, car les résultats étaient soit comportementaux, soit testaient spécifiquement l’environnement de l’hôte et du donneur sur le développement global du cerveau. Il s’agit d’une considération importante dans la conception d’expériences utilisant ces approches embryologiques et la faisabilité doit être équilibrée avec rigueur. Par exemple, l’obligation d’exclure les cellules de crête neurale présumées a créé des obstacles importants à surmonter. Les greffes devaient être effectuées sur des embryons précoces au stade neurulaire. À ces stades, l’endoderme est immédiatement adjacent au site de transplantation, et des précautions extrêmes ont dû être prises pour éviter d’endommager l’endoderme, car cela réduit la survie. Bien qu’il ne soit pas clair que la contamination du greffon par l’endoderme aurait un impact sur les mesures de résultats, l’objectif était d’isoler exclusivement l’effet du cerveau antérieur ventral sur le développement du visage. Donc, à cette fin, la rigueur supplémentaire était justifiée.
Il faut tenir compte du taux de développement de l’espèce hôte et de l’espèce donneuse. Bien que les différences dans les taux de ces animaux aient été utilisées à bon escient pour évaluer le rôle des cellules de la crête neurale dans la structuration du squelette facial en développement19,20, dans ce cas, le tissu neural de caille qui se développe plus rapidement a créé des embryons extrêmement malformés lorsqu’il a été transplanté dans le canard à développement plus lent. Cela signifiait que le chimérisme et la contamination devaient être évalués dans un autre ensemble de chimères créées par greffage de tissu de caille dans des hôtes poussins, et bien que ce ne soit pas idéal, cela a donné confiance dans la technique de greffe.
Dans l’ensemble, la création de chimères pour évaluer les interactions tissulaires au cours du développement peut être une approche puissante pour aider à comprendre les mécanismes du développement. Des soins doivent être donnés pendant les étapes de planification pour s’assurer que les résultats seront aussi concluants que possible, et des contrôles appropriés déterminés qui incluent des embryons normaux et d’autres chimères pour tenir compte des variations dues à la chirurgie. Dans ce cas, il était très important d’utiliser des analyses quantitatives, car les changements observés étaient subtils.
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Disclosures
Tous les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par le National Institute of Dental and Craniofacial Research des National Institutes of Health sous les numéros d’attribution R01DE019648, R01DE018234 et R01DE019638.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | TEK | TEKZR114 | |
| 35x10 mm Petri dish | Falcon | 1008 | |
| DMEM | Thermofisher | 11965084 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Neutral Red | Sigma | 553-24-2 | |
| No. 5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Pasteur Pipets | Thermofisher | 13-678-6B | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma bank, Iowa University, Iowa, USA | ||
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Tungsten Needle | Fine Science Tools | 26000 |
References
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